專利名稱：一種以殼聚糖為載體的固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以殼聚糖為載體的固定化方法，特別是用于酶、細(xì)胞、菌體、發(fā)酵 液或蛋白質(zhì)的固定化方法。
背景技術(shù)：
固定化是相對于游離酶或細(xì)胞而言的。通過化學(xué)或物理的手段使目標(biāo)物質(zhì)束縛在 載體區(qū)域中，同時(shí)又保持了催化活性并且可以反復(fù)利用。固定化后，酶或細(xì)胞隨著載體的移 動而移動，因而在科研和生產(chǎn)中人們可以通過操作肉眼可見的固體狀的載體而控制不可見 的酶和細(xì)胞的行為。固定化的方法主要有吸附法、包埋法和交聯(lián)法。決定固定化工藝是否具有實(shí)際經(jīng) 濟(jì)價(jià)值的關(guān)鍵性因素是載體的價(jià)格和性能。海藻酸鈉、卡拉膠和殼聚糖是研究最多的載體， 來源豐富，價(jià)格便宜，然而應(yīng)用到工業(yè)化的例子卻不多。這些物質(zhì)用于固定化的共同程序是 制膠、造粒和硬化，其中造粒和硬化可以同時(shí)進(jìn)行。對于固定化的工業(yè)應(yīng)用，顆粒的形狀不 是衡量的指標(biāo)，更加重要的是比表面積、機(jī)械強(qiáng)度和過濾性能。上述常規(guī)技術(shù)還存在一些缺 陷。第一個(gè)缺陷是造粒技術(shù)往往是擠出成型，非常難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模操作，且顆粒大小極難控 制。第二個(gè)缺陷是通過上述常規(guī)工藝形成的顆粒機(jī)械性能差，難以耐受持續(xù)的機(jī)械攪拌，其 彌補(bǔ)方法是裝成酶柱，然而這樣又極大地限制了它的應(yīng)用范圍，要求反應(yīng)液必須有一定的 流動性能才能應(yīng)用。第三個(gè)缺陷是常規(guī)的發(fā)酵液固定化手段必須先收菌得到菌體，而許多 微生物發(fā)酵液過濾困難，采用大規(guī)模離心手段收集菌體并非工業(yè)化首選，因此工業(yè)上不得 不采取陶瓷膜等其他手段代替固定化。以殼聚糖為固定化載體的報(bào)道較多。例如，王俊等(王俊等，《化工進(jìn)展》，2004， 23(10), 1117-1120)報(bào)道了“以殼聚糖為載體固定化海藻糖合成酶”;趙江等(趙江等，《鄭 州工程學(xué)院學(xué)報(bào)》，2004，25 (2)，34-37)報(bào)道了“胃蛋白酶固定化條件的研究”;蔡俊等(《生 物技術(shù)》，2003，13 (5) 11-12)報(bào)道了谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的固定化及酶學(xué)特性研究； 任廣智等(《離子交換與吸附》，2000，16 (4))報(bào)道了磁性殼聚糖微球用于脲激酶的固定化研 究。上述方法都是將殼聚糖先造粒，經(jīng)過處理后再與目標(biāo)產(chǎn)物交聯(lián)或吸附固定，其中也包括 將殼聚糖包裹到磁性顆粒表面的做法，但這種做法難以放大，且成本更高，吸附量更小。上 述方法都存在固定化顆粒交聯(lián)度不均一，強(qiáng)度不均一的缺點(diǎn)。上述方法應(yīng)用于發(fā)酵液固定 化時(shí)，都需要將發(fā)酵液進(jìn)行固液分離、收集菌體后再進(jìn)行固定化操作，固液分離的效果對設(shè) 備的依賴性較高。本申請發(fā)明人將殼聚糖的絮凝作用與固定化作用相結(jié)合，并做了工藝上的改進(jìn)， 形成了一種獨(dú)特的固定化工藝。與上述兩種固定化程序不同，本發(fā)明中殼聚糖溶液與待固 定物質(zhì)的溶液或懸浮液先交聯(lián)成凝膠狀，再通過該凝膠在弱堿性環(huán)境下的硬化作用而自動 脫水固化，再通過攪拌將凝膠分散成顆粒。分離出顆粒后，濾液澄清，在顯微鏡下濾液中看 不到菌體殘留。該顆粒具有很好的強(qiáng)度和過濾性能，通過機(jī)械粉碎成更小顆粒后仍保持合 適的強(qiáng)度和過濾性能。
尤其需要說明的是，本發(fā)明可以直接將發(fā)酵液中的菌體或蛋白成分固定化，避免 了發(fā)酵液工業(yè)化收菌的困難，對于工業(yè)酶制劑的開發(fā)具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適合于工業(yè)化生產(chǎn)操作的固定化方法。以殼聚糖為載 體，與目標(biāo)物質(zhì)經(jīng)充分交聯(lián)后，再固化分散成顆粒。本發(fā)明具有普遍適用性，可用于酶、細(xì) 胞、菌體、發(fā)酵液及蛋白質(zhì)等物質(zhì)的固定化。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案解決上述問題一種以殼聚糖為載體的固定化方法，其特征在于，包括以下步驟a.制備待固定的殼聚糖溶液1)向殼聚糖中加入酸，配制成殼聚糖溶液，2)準(zhǔn)備待固定物質(zhì)的溶液或懸浮液，3)將上述1)的溶液與待固定物質(zhì)的溶液或懸浮液直接混合；b.交聯(lián)將交聯(lián)劑與上述步驟a得到的混合物混合，進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完成后的混合 物呈凝膠狀；c.向上述步驟b得到的凝膠狀混合物中加入堿性物質(zhì)，攪拌使凝膠固化分散成顆 粒狀，收集顆粒狀的交聯(lián)殼聚糖；d.可選擇地，通過粉碎、切割或者過篩方法將上述步驟c得到的交聯(lián)殼聚糖再加 工成各種形態(tài)的顆粒或粉末。本發(fā)明的固定化方法中，所述待固定物質(zhì)選自酶、細(xì)胞、菌體、發(fā)酵液或蛋白質(zhì)。一般常用的酸都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，優(yōu)選自冰醋酸、鹽酸或硫酸，更優(yōu)選體積比 0. 1-80%的冰醋酸水溶液。一般常規(guī)的堿性物質(zhì)都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，優(yōu)選能與殼聚糖溶液反應(yīng)生成氣體的物 質(zhì)，如碳酸鈉和/或碳酸氫鈉的固體或溶液，這樣可以達(dá)到更好的固定化效果，又不會劇烈 改變PH而對生物活性造成大的影響。一般常規(guī)的交聯(lián)劑都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，優(yōu)選交聯(lián)劑為戊二醛，交聯(lián)劑與步驟b得 到的凝膠狀混合物的體積比在5%以下。本發(fā)明固定化方法的步驟a中，待固定殼聚糖溶液中殼聚糖的含量為0. 1-3% (w/
V) O本發(fā)明的固定化方法可應(yīng)用于瓜氨酸、二甲基環(huán)丙甲酰胺、N-乙酰神經(jīng)氨酸、 4-氰基-3-羥基-丁酸或氟比洛芬的生產(chǎn)中。優(yōu)選的，本發(fā)明的固定化方法應(yīng)用于瓜氨酸生產(chǎn)中的精氨酸脫亞胺酶產(chǎn)生菌的菌 體固定化步驟或精氨酸脫亞胺酶產(chǎn)生菌發(fā)酵液的直接固定化步驟。更優(yōu)選的，上述精氨酸 脫亞胺酶產(chǎn)生菌為糞鏈球菌。本發(fā)明的固定化方法還可應(yīng)用于溶液的除菌或澄清處理。為了更清楚敘述本發(fā)明內(nèi)容，下面具體敘述本發(fā)明涉及到的方法一種以殼聚糖為載體的固定化方法，其特征在于，包括以下步驟a.制備待固定的殼聚糖溶液1)向殼聚糖中加入0. 1-80% (ν/ν)的冰醋酸水溶液，以冰醋酸調(diào)節(jié)ρΗ，攪拌，溶解，配制成0. 1-6% (w/v)的殼聚糖溶液；2)準(zhǔn)備濃度為0. 1-80% (w/v)的酶液、菌體溶液或發(fā)酵液；3)將上述1)的殼聚糖溶液與上述2)的酶液、菌體溶液或發(fā)酵液直接混合均勻；b 交聯(lián)將交聯(lián)劑與上述步驟a得到的混合物混合，可以在步驟a得到的混合物中加入交 聯(lián)劑，也可以將交聯(lián)劑預(yù)先加入到步驟a的1)液或2)液中。加入交聯(lián)劑后，充分?jǐn)嚢杈鶆?，靜置使交聯(lián)反應(yīng)充分完成。完成反應(yīng)后的混合物 成凝膠狀。優(yōu)選交聯(lián)劑為戊二醛，優(yōu)選戊二醛與步驟b得到的凝膠狀混合物的體積比為 0. 1-5% (ν/ν)。c.向上述步驟b得到的凝膠狀混合物中加入堿性物質(zhì)，攪拌使凝膠固化分散成顆 粒狀，收集顆粒狀的交聯(lián)殼聚糖；經(jīng)過攪拌分散的固定化顆?？梢酝ㄟ^過濾或離心收集，因顆粒過濾性能很好，一 般可以直接過濾收集，然后再以緩沖液或水洗滌，驅(qū)除殘留的戊二醛。收集的固定化顆?？?以繼續(xù)用離心機(jī)，如三足式離心機(jī)甩干。上述方法制造的固定化顆粒具有多孔結(jié)構(gòu)，交聯(lián)充分，機(jī)械性能好，過濾性能強(qiáng)， 可以不用進(jìn)一步處理而直接用于下游產(chǎn)品的開發(fā)過程。上述方法制造的固定化顆粒也可以通過粉碎、切割、過篩等方法再加工成各種形 態(tài)的顆粒或粉末，用于下游產(chǎn)品的開發(fā)過程。本發(fā)明的固定化方法應(yīng)用于瓜氨酸生產(chǎn)中精氨酸脫亞胺酶產(chǎn)生菌的菌體固定化 條件為步驟a的待固定的殼聚糖溶液中含有0. 1-3% (w/v)的殼聚糖，并含有0. 1-40% (w/v)的菌體；步驟b得到的凝膠狀混合物中戊二醛的濃度為0. 1-3% (ν/ν)；堿性物質(zhì)為 碳酸氫鈉和/或碳酸鈉固體或溶液。本發(fā)明的固定化方法應(yīng)用于瓜氨酸生產(chǎn)中精氨酸脫亞胺酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵液直接 固定化條件為步驟a的待固定的殼聚糖溶液中含有0. 1-3% (w/v)的殼聚糖，并含有發(fā)酵 液；步驟b得到的凝膠狀混合物中戊二醛的濃度為0.1-3% (ν/ν)；堿性物質(zhì)為碳酸氫鈉和 /或碳酸鈉固體或溶液。本發(fā)明固定化方法的應(yīng)用拓展本發(fā)明的固定化方法除了可以制造固定化顆粒外，還可以用于液體的澄清處理。 上述步驟b得到的混合物呈凝膠狀，能將微生物等能與戊二醛或殼聚糖反應(yīng)的物質(zhì)全部交 聯(lián)包裹，經(jīng)步驟c處理后，溶液成為澄清透明狀，顯微鏡下檢測無菌。本發(fā)明的優(yōu)勢在于，將殼聚糖配制成溶液，與待固定物質(zhì)液液混和，直接吸附，之 后交聯(lián)，再加堿形成菌絲固定化顆粒，最后固液分離。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的原料混和更 加充分，且不用對待固定物質(zhì)做預(yù)先處理。得到的顆粒均勻性好，韌性好，機(jī)械強(qiáng)度高，可實(shí) 現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模，吸附完全，易過濾，濾液澄清，產(chǎn)率高。下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明實(shí)施例的制備方法僅 僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方法 的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。在上下文中，除非另有說明，w/w表示質(zhì)量比(g/g)，w/v表示質(zhì)量體積比(g/ml)， ν/ν表示體積比(ml/ml)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1菌體固定化取糞鏈球菌菌體lKg，配制成5L的菌液；配制3L 2% (ν/ν)的冰醋酸水溶液，加入 IOOg殼聚糖，攪拌充分溶解；將菌液加入到殼聚糖溶液中，攪拌均勻；加入80ml 50% (ν/ν) 的戊二醛水溶液，攪拌均勻，靜置3小時(shí)；加入IOOg碳酸氫鈉，攪拌2小時(shí)；過濾水洗，收集 得到固定化細(xì)胞。在顯微鏡下觀察濾液，采用血球記數(shù)板計(jì)數(shù)，找不到殘留的菌體細(xì)胞。將上述固定化細(xì)胞用于精氨酸到瓜氨酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。取上述固定化細(xì)胞100g，加 入到2000ml 10% (w/v)的精氨酸水溶液中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，含有瓜氨酸的濾液用于 進(jìn)一步提取瓜氨酸，固定化細(xì)胞繼續(xù)用于下一批反應(yīng)。經(jīng)過7批反應(yīng)，得到的反應(yīng)液中含有 瓜氨酸1220g，轉(zhuǎn)化率為87. 1%。固定化細(xì)胞使用時(shí)間為182小時(shí)。實(shí)施例2發(fā)酵液固定化配制400L 3% (ν/ν)的冰醋酸水溶液，加入殼聚糖20Kg，攪拌使充分溶解；加入 2000L糞鏈球菌的發(fā)酵液，攪拌均勻；加入50L 50% (ν/ν)的戊二醛水溶液，攪拌均勻，靜置 3小時(shí)；加入20Kg碳酸氫鈉，攪拌2小時(shí)；過濾水洗，收集得到固定化細(xì)胞。在顯微鏡下觀 察濾液，采用血球記數(shù)板計(jì)數(shù)，找不到殘留的菌體細(xì)胞。將上述固定化細(xì)胞用于精氨酸到瓜氨酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)液為2000L 10% (w/ ν)的精氨酸水溶液，加入上述固定化細(xì)胞，反應(yīng)結(jié)束后過濾，含有瓜氨酸的濾液用于進(jìn)一步 提取瓜氨酸，固定化細(xì)胞繼續(xù)用于下一批反應(yīng)。經(jīng)過5批反應(yīng)，得到的反應(yīng)液中含有瓜氨酸 970Kg，轉(zhuǎn)化率為97%。固定化細(xì)胞使用時(shí)間為150小時(shí)。實(shí)施例3酶液固定化配制30ml 2% (ν/ν)的冰醋酸水溶液，加入Ig殼聚糖，攪拌充分溶解；加入60ml R-酰胺酶酶液，攪拌均勻；加入1.6ml 25% (ν/ν)的戊二醛水溶液，攪拌均勻，靜置3小時(shí)； 加入Ig碳酸氫鈉，攪拌2小時(shí)；過濾水洗，得到R-酰胺酶固定化酶。將R-酰胺酶固定化酶 用于4-氰基-(R)-3-羥基-丁酸乙酯的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到R-3-羥基-戊二酸乙酯。配制30ml 2% (ν/ν)的冰醋酸水溶液，加入Ig殼聚糖，攪拌充分溶解；加入60ml R-氟比洛芬酯酶酶液，攪拌均勻；加入1.6ml 25% (ν/ν)的戊二醛水溶液，攪拌均勻，靜置 3小時(shí)；加入Ig碳酸氫鈉，攪拌2小時(shí)；過濾水洗，得到R-氟比洛芬酯酶固定化酶。將R-氟 比洛芬酯酶固定化酶用于氟比洛芬乙酯的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到R-氟比洛芬。配制30ml 2% (ν/ν)的冰醋酸水溶液，加入Ig殼聚糖，攪拌充分溶解；加入60ml 神經(jīng)氨酸醛縮酶酶液，攪拌均勻；加入1.6ml 25% (ν/ν)的戊二醛水溶液，攪拌均勻，靜置3 小時(shí)；加入Ig碳酸氫鈉，攪拌2小時(shí)；過濾水洗，得到神經(jīng)氨酸醛縮酶固定化酶。將神經(jīng)氨 酸醛縮酶固定化酶用于N-乙酰甘露糖胺的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到N-乙酰神經(jīng)氨酸。實(shí)施例4基因工程菌的固定化取二甲基環(huán)丙甲酰胺酰胺酶基因工程菌菌體100g，配制成500ml的菌液；配制 300ml2% (ν/ν)的冰醋酸水溶液，加入IOg殼聚糖，攪拌充分溶解；將菌液加入到殼聚糖溶 液中，攪拌均勻；加入16ml 25% (ν/ν)的戊二醛水溶液，攪拌均勻，靜置3小時(shí)；加入IOg 碳酸氫鈉，攪拌2小時(shí)；過濾水洗，得到酰胺酶工程菌固定化細(xì)胞。取上述固定化細(xì)胞100g，加入到500ml 6g/l的外消旋二甲基環(huán)丙甲酰胺水溶液中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，殘留固定化細(xì)胞繼續(xù)用于下一批反應(yīng)。經(jīng)過5批反應(yīng)，得到的反 應(yīng)液中含有S-2，2-二甲基環(huán)丙甲酰胺12g。
權(quán)利要求
1.一種以殼聚糖為載體的固定化方法，其特征在于，包括以下步驟a.制備待固定的殼聚糖溶液1)向殼聚糖中加入酸，配制成殼聚糖溶液，2)準(zhǔn)備待固定物質(zhì)的溶液或懸浮液，3)將上述1)的溶液與待固定物質(zhì)的溶液或懸浮液直接混合；b.交聯(lián)將交聯(lián)劑與上述步驟a得到的混合物混合，進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完成后的混合物呈 凝膠狀；c.向上述步驟b得到的凝膠狀混合物中加入堿性物質(zhì)，攪拌使凝膠固化，分散成顆粒 狀，收集顆粒狀的交聯(lián)殼聚糖；d.可選擇地，通過粉碎、切割或者過篩方法將上述步驟C得到的交聯(lián)殼聚糖再加工成 各種形態(tài)的顆?；蚍勰?br>
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中酸選自冰醋酸、鹽酸或硫酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中堿性物質(zhì)選自碳酸鈉和/或碳酸氫鈉的固體或溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中待固定物質(zhì)選自酶、細(xì)胞、菌體、發(fā)酵液或蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中交聯(lián)劑為戊二醛。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟a的待固定殼聚糖溶液中殼聚糖的 含量為0. 1-3% (w/v)，交聯(lián)劑與步驟b得到的凝膠狀混合物的體積比在5%以下。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法的用途，該方法可應(yīng)用于瓜氨酸、二甲基環(huán)丙甲酰胺、N-乙 酰神經(jīng)氨酸或4-氰基-3-羥基-丁酸或氟比洛芬的生產(chǎn)中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，可應(yīng)用于瓜氨酸生產(chǎn)中的精氨酸脫亞胺酶產(chǎn)生菌的菌 體固定化步驟或精氨酸脫亞胺酶產(chǎn)生菌發(fā)酵液的直接固定化步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，精氨酸脫亞胺酶產(chǎn)生菌為糞鏈球菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法的用途，該方法可應(yīng)用于溶液的除菌或澄清處理。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以殼聚糖為載體的固定化方法，將殼聚糖溶液與酶、細(xì)胞、菌體、發(fā)酵液或蛋白質(zhì)等待固定物質(zhì)的溶液或懸浮液直接混合，交聯(lián)，再在堿性條件下固化，分散得到顆粒狀的交聯(lián)殼聚糖。本發(fā)明形成的固定化顆粒具有多孔結(jié)構(gòu)，機(jī)械強(qiáng)度好，過濾性能強(qiáng)，不需要復(fù)雜的設(shè)備。本發(fā)明可用于大規(guī)模的細(xì)胞固定化、酶固定化、不經(jīng)固液分離的發(fā)酵液的直接固定化，例如瓜氨酸生產(chǎn)中2000L規(guī)模的發(fā)酵液直接固定化，以及制備S-2，2-二甲基環(huán)丙甲酰胺、R-氟比洛芬、N-乙酰神經(jīng)氨酸或R-3-羥基-戊二酸乙酯的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。本發(fā)明還可用于溶液的除菌或澄清處理。
文檔編號C07K17/10GK101993867SQ20091016924
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日
發(fā)明者徐期, 楊仲毅 申請人:浙江海正藥業(yè)股份有限公司