專利名稱：一種從王不留行中分離制備具有增乳活性單體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)和生物細(xì)胞學(xué)，具體說就是一種從王不 留行中分離制備具有增乳活性單體的方法。
(二)
背景技術(shù)：
我國中草藥資源豐富，中藥用于增奶，具有毒副作用小、價格低、 無抗藥性、無殘留等獨特優(yōu)勢。將中草藥作為增奶劑和飼料添加劑的 研究最早源于我國，目前已經(jīng)有許多增奶方劑用于飼料添加劑來提高 奶牛產(chǎn)乳量，同時一些增乳的天然中藥及其制劑在臨床上也己廣泛應(yīng)
用。Dugoua等(2006， 2009)系統(tǒng)闡述了增乳中藥的藥理學(xué)性質(zhì)， 對增乳中藥在妊娠和泌乳臨床應(yīng)用中的正確性和安全性進(jìn)行了評價。 王不留行(&mewK"cc"Wae)為石竹科植物麥藍(lán)菜的種子，為傳
統(tǒng)常用中藥。王不留行作為重要的增乳中藥，其所含成分種類多，成 分復(fù)雜。天然藥物有效性的物質(zhì)基礎(chǔ)在于它的有效成分。因此若想探 明王不留行的增乳機理就需要尋找到其中具有增乳活性的單體成分， 才能通過含量測定的方法控制天然藥物及其制劑的質(zhì)量，從而更好的 研究其藥效動力學(xué)及藥代動力學(xué)，對王不留行增乳活性成分的開發(fā)利 用具有重要的理論和實際價值。從中藥復(fù)方的藥味篩選到成分篩選是 中藥藥效研究的主流。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)篩選中藥藥效成分是十分快 捷有效的方法。隨著天然藥物化學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展，鄰苯二甲酸二丁 酯從一些天然活性物質(zhì)中分離獲得。韋松等(1997)從莧科牛膝屬植 物懷牛膝分離制備鑒定出7種化合物，其中包括鄰苯二甲酸二丁酯。 周忠波等(2007)發(fā)現(xiàn)紅柳中含有鄰苯二甲酸二丁酯成分。韓志慧等 (2006)發(fā)現(xiàn)山茱萸中含有鄰苯二甲酸二丁酯成分。此外具有增乳效 應(yīng)的漏蘆中也含有鄰苯二甲酸二丁酯。由于生態(tài)環(huán)境與陸地生物迥 異，海洋生物中蘊藏著大量結(jié)構(gòu)獨特的活性物質(zhì)，海洋天然產(chǎn)物成為 目前天然藥物化學(xué)研究中最活躍的領(lǐng)域之一。史大永等(2005)對基 根硬毛藻的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，鑒定出其中含有鄰苯二甲酸二丁 酯。孫奕(2008)從綠藻從石莼中分離得到8個化合物，其中包括鄰苯 二甲酸二丁酯。曲新顏等(2004)從海洋來源的放線菌代謝產(chǎn)物分離
3制備出鄰苯二甲酸二丁酯，且其具有抗腫瘤活性。鄰苯二甲酸二丁酯 是一種環(huán)境雌激素，具有雌激素生物樣的生物活性。近年的一些研究 表明，對羥基苯甲酸酯體外實驗具有弱雌激素活性，能與雌激素受體 (ER)結(jié)合。關(guān)于鄰苯二甲酸二丁酯生物活性的研究報道較少， 一些 體內(nèi)試驗的結(jié)果表明鄰苯二甲酸二丁酯生物可以對促進(jìn)子宮增重具
有一定作用(楊波等，2002)。鄰苯二甲酸二丁酯可促進(jìn)雌激素依賴 性乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，可能具有擬雌激素作用(靳秋梅等， 2005)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備方法簡便、純度高、成本低的從 王不留行中分離制備具有增乳活性單體的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的從王不留行中分離制備具有增乳活 性單體的方法步驟如下
步驟一王不留行粗提取取王不留行粗粉10kg，用體積分?jǐn)?shù) 70%的乙醇加熱回流提取3次，每次2h，減壓回收溶劑，稀釋母液， 依次以乙醚、乙酸乙酯萃取，獲得乙酸乙酯萃取部位。
步驟二王不留行提取物活性部位的篩選對乙酸乙酯部位進(jìn)行
聚酰胺柱層析，干法上樣，分別用水，10%， 30%， 50%， 70%, 95% 乙醇系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，收集不同梯度洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后獲得不同 洗脫部位的中藥成分，通過其對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳模型細(xì)胞活 力、乳糖及乳蛋白分泌能力的影響確立50%的乙醇洗脫部位為王不留 行增乳活性部位。
步驟三王不留行增乳單體的制備對50%的有效部位進(jìn)行進(jìn)一 步的分離純化，對聚酰胺柱層析分離獲得的50%乙醇洗脫部位進(jìn)行硅 膠薄層層析，根據(jù)硅膠G板的薄層結(jié)果的Rf值情況選擇摸索不同的 溶劑系統(tǒng)，最終確立石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為有效分離系統(tǒng)，采用石 油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)對50%乙醇洗脫部位進(jìn)行硅膠柱層析，對分離的
化合物進(jìn)行篩選，其中石油醚乙酸乙酯20: l的洗脫流分中含有- -
個具有增乳活性的單體成分；對該增乳單體化合物的制備采用分析型 和制備型HPLC法進(jìn)行，采用10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%的甲醇對單體化合物的粗品進(jìn)行紫外全波長掃描進(jìn)行檢識，確立此化合物的紫外吸收波長為275nm，采用半制備 型HPLC對化合物連續(xù)進(jìn)樣以純化并制備出高純度的目的化合物。
步驟四增乳單體的結(jié)構(gòu)鑒定采用紫外光譜、核磁共振氫譜、
核磁共振碳譜、高分辨電噴霧質(zhì)譜(HR-ESI-MS)對目的化合物進(jìn)行 結(jié)構(gòu)鑒定，以確定目的化合物的分子量、分子式及其具體結(jié)構(gòu)形式， 鑒定結(jié)果確定目的化合物為鄰苯二甲酸二丁酯；制備出的鄰苯二甲酸 二丁酯可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳糖和(3-酪蛋白的分 泌水平；且鄰苯二甲酸二丁酯制備的中藥單體注射液的動物試驗結(jié)果 表明其可以促進(jìn)小鼠和奶牛產(chǎn)奶量的提高。
本發(fā)明一種從王不留行中分離制備具有增乳活性單體的方法，在 提取過程中采用的乙醇等有機溶劑的成本低廉、無毒、可以回收。采 用的聚酰胺柱層析和硅膠柱層析可以擴大規(guī)?；a(chǎn)，從而可以獲得 大量的增乳成分。同時可以通過制備型HPLC獲得單體成分，其制備 方法簡便且純度高。對王不留行增乳成分一一鄰苯甲酸二丁酯的確定 可以為增乳新藥的開發(fā)提供重要思路。對于王不留行中藥資源的開發(fā) 具有一定的意義，也必然會帶來一定的經(jīng)濟(jì)效益。
(四)
圖1為本發(fā)明的分離前樣品色譜圖2為本發(fā)明的增乳活性成分的硅膠薄層層析圖3為本發(fā)明的增乳活性單體分離前；
圖4為本發(fā)明的增乳活性單體分離后；
圖5為本發(fā)明的增乳單體的結(jié)構(gòu)圖。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖舉例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例1，結(jié)合圖l一圖5，本發(fā)明一種從王不留行中分離制備 具有增乳活性單體的方法，方法步驟如下
步驟一王不留行粗提取取王不留行粗粉10kg，用體積分?jǐn)?shù) 70%的乙醇加熱回流提取3次，每次2h，減壓回收溶劑，稀釋母液， 依次以乙醚、乙酸乙酯萃取，獲得乙酸乙酯萃取部位；
步驟二王不留行提取物活性部位的篩選對乙酸乙酯部位進(jìn)行 聚酰胺柱層析，干法上樣，分別用水，10%， 30%, 50%， 70%， 95%獲得不同 洗脫部位的中藥成分，通過其對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳模型細(xì)胞活 力、乳糖及乳蛋白分泌能力的影響確立50%的乙醇洗脫部位為王不留
行增乳活性部位；
步驟三王不留行增乳單體的制備對50%的有效部位進(jìn)行進(jìn)一 步的分離純化，對聚酰胺柱層析分離獲得的50%乙醇洗脫部位進(jìn)行硅
膠薄層層析，根據(jù)硅膠G板的薄層結(jié)果的Rf值情況選擇摸索不同的
溶劑系統(tǒng)，最終確立石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為有效分離系統(tǒng)，采用石
油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)對50%乙醇洗脫部位進(jìn)行硅膠柱層析，對分離的
化合物進(jìn)行篩選，其中石油醚乙酸乙酯20: l的洗脫流分中含有^ 個具有增乳活性的單體成分；對該增乳單體化合物的制備釆用分析型 和制備型HPLC法進(jìn)行，采用10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%的甲醇對單體化合物的粗品進(jìn)行紫外全波長 掃描進(jìn)行檢識，確立此化合物的紫外吸收波長為275nm，采用半制備 型HPLC對化合物連續(xù)進(jìn)樣以純化并制備出高純度的目的化合物；
步驟四增乳單體的結(jié)構(gòu)鑒定采用紫外光譜、核磁共振氫譜、 核磁共振碳譜、高分辨電噴霧質(zhì)譜(HR-ESI-MS)對目的化合物進(jìn)行 結(jié)構(gòu)鑒定，以確定目的化合物的分子量、分子式及其具體結(jié)構(gòu)形式， 鑒定結(jié)果確定目的化合物為鄰苯二甲酸二丁酯；制備出的鄰苯二甲酸 二丁酯可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳糖和(3-酪蛋白的分 泌水平；且鄰苯二甲酸二丁酯制備的中藥單體注射液的動物試驗結(jié)果 表明其可以促進(jìn)小鼠和奶牛產(chǎn)奶量的提高。
實施例2:結(jié)合圖l-圖5，本發(fā)明一種從王不留行中分離制備具
有增乳活性單體的方法，實驗方法如下 實驗試劑
化學(xué)分析純的乙醚、乙酸乙酯、石油醚、乙醇；色譜級甲醇；層 析用聚酰胺(80 100目)；層析用硅膠(200~300目)。 實驗設(shè)備
R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申勝；ZHJH-1112垂直流超凈工作臺， 上海智城分析儀器制造有限公司；CO-150型C02培養(yǎng)箱，日本；SZ-93 自動雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；LC-10AT高效液相色
6譜儀，日本島津，SPD-10A紫外檢測器；2695-2996型HPLC色譜儀， 美國Waters; Delta-600-2487制備型HPLC色譜儀，美國Waters; Bmker-400型超導(dǎo)核磁共振光譜儀；SHIMADZU UV-1601型紫外光 譜儀；IonSpec Ultima 7.0T FTICR高分辨電噴霧質(zhì)譜儀(HR-ESI-MS); Hypersil-ODSlI(5(im 10x250mm)半制備型色譜柱，大連依利特公司； Hypersil ODSII(5pm 4.6x200 mm)分析型色譜柱，大連依利特公司。 實驗方法
(1) 王不留行粗提取
取王不留行粗粉10kg，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇加熱回流提取3 次，每次2h，減壓回收溶劑。稀釋母液，依次以乙醚、乙酸乙酯萃 取。獲得乙酸乙酯萃取部位。
(2) 王不留行提取物活性部位的篩選
對乙酸乙酯部位進(jìn)行聚酰胺柱層析，干法上樣，分別用水，10%， 30%， 50%, 70%， 95%乙醇系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫。收集不同梯度洗脫 液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后獲得不同洗脫部位的中藥成分。通過其對奶牛乳腺上 皮細(xì)胞泌乳模型細(xì)胞活力、乳糖及乳蛋白分泌能力的影響確立50% 的乙醇洗脫部位為王不留行增乳活性部位。
(3) 王不留行增乳單體的制備
對50%的有效部位進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。對聚酰胺柱層析分離 獲得的50%乙醇洗脫部位進(jìn)行硅膠薄層層析，根據(jù)硅膠G板的薄層 結(jié)果的Rf值情況選擇摸索不同的溶劑系統(tǒng)，最終確立石油醚-乙酸乙 酯系統(tǒng)為有效分離系統(tǒng)。采用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)對50%乙醇洗脫 部位進(jìn)行硅膠柱層析。對分離的化合物進(jìn)行篩選，其中從石油醚乙 酸乙酯(20: 1)部位分離的一個化合物具有增乳活性。
增乳單體化合物的制備采用分析型和制備型的HPLC法進(jìn)行。采 用10%、 20%、 30%、 40。/o、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%的 甲醇對單體化合物的粗品進(jìn)行紫外全波長掃描進(jìn)行檢識。以確立此化 合物的紫外吸收波長為275nm。采用半制備型HPLC對化合物連續(xù)進(jìn) 樣以純化并制備出高純度的目的化合物。
(4) 增乳單體的結(jié)構(gòu)鑒定
采用紫外光譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、高分 電噴霧質(zhì)譜(HR-ESI-MS)對該化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。以確定該化合物的分子
量、分子式及其具體結(jié)構(gòu)形式。制備出的鄰苯二甲酸二丁酯可以促進(jìn) 體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳糖和p-酪蛋白的分泌水平。且鄰苯二 甲酸二丁酯制備的中藥單體注射液的動物試驗結(jié)果表明其可以促進(jìn) 小鼠和奶牛產(chǎn)奶量的提高。
實驗結(jié)果
(1) 王不留行增乳活性單體的分離制備
采用分析型和制備型的HPLC法對薄層層析的目的點進(jìn)行分析 及分離制備，其中圖1為分離前樣品色譜圖，分析型HPLC的紫外全 波長掃描結(jié)果表明該化合物在275nm下具有最大吸收，HPLC分析結(jié) 果表明有雜質(zhì)峰，其純度低(圖3)。采用Waters制備型HPLC對該 化合物進(jìn)行純化，獲得了 30mg具有單一 HPLC色譜峰的單體化合物 (圖4)。
(2) 王不留行增乳活性單體的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果 本研究通過中藥對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳模型泌乳
功能影響的研究，從王不留行中分離獲得了一種具有增乳效應(yīng)的單體 成分。為明確該活性成分的結(jié)構(gòu)特性及其藥效學(xué)的物質(zhì)基礎(chǔ)，對制備 型HPLC純化獲得的該中藥成分進(jìn)行紫外光譜、質(zhì)譜、碳譜、氫譜及 超導(dǎo)核磁共振光譜，以確定其結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果表明該化合物為鄰 苯二甲酸二丁酯(Dibutylphthalate)。其具體結(jié)構(gòu)見圖5所示。
增乳單體為無色油狀液體，易溶于甲醇。能與醇、醚、酮等混溶， 微溶于水。相對密度1.047~1.049，凝固點-35°C，沸點340°C。 HR-ESI-MS(pos.)譜中，在m/z301.1413處可見[M+Na]+分子離子峰， 表明化合物的分子量為278。結(jié)合'H-NMR和13C-NMR譜推測其分 子式為(^16112204(計算值301.1416)，計算出不飽和度為6。
表4-l為該化合物的核磁共振譜的數(shù)據(jù)與歸屬。根據(jù)此實驗結(jié)果 在化合物^-NMR譜中，因其結(jié)構(gòu)的對稱性，故僅表現(xiàn)出半數(shù)結(jié)構(gòu)的 質(zhì)子信號特征。低場區(qū)37.71(2H, dd, J=6.0， 3.2Hz )和7.61(2H, dd, J=6.0, 3.2Hz )處可見歸屬于鄰二取代苯上的兩組氫信號；S4.28(4H, t， J二6.4Hz)處可見2個氧代亞甲基氫信號；1.71(4H,m)和1.45(4H，m)處 可見4個亞甲基氫信號；S0.97(6H, t，片3.6Hz)處可見2個甲基氫信號。
8200910072959.5 ， 亦僅表現(xiàn)出半數(shù)結(jié)構(gòu)的碳信號特征。其中包括歸屬于苯環(huán)的6個碳信 號(3132.4x2、 129.9x2和133.6x2);在低場區(qū)5169.3處可見酯羰基碳 信號；另外，在566.6處可見氧代亞甲基碳信號；S31.7和20.3處可 見亞甲基碳信號；此外在514.1處可見甲基碳信號。
將化合物的！H-NMR譜的全部氫信號和"C-NMR譜的所有碳信 號進(jìn)行了準(zhǔn)確的解析和歸屬。并將化合物的波譜學(xué)數(shù)據(jù)與已知化合物 鄰苯二甲酸二丁酯進(jìn)行對照，兩者基本一致。綜合以上分析，鑒定化 合物為鄰苯二甲酸二丁酯。
表4-1 THL化合物的H-NMR和13C-NMR的統(tǒng)計數(shù)據(jù)No.sHsc
1,27.71(2H， dd，《/=6.0,132.4
3,63.2Hz) 7.61(2H, dd，J=6.0,129.9
4,53.2Hz)133.6
1，-169.3
r4.28(4H, t,聲6.4Hz)66.6
2"1.71(4H, m)31.7
3"1.45(4H， m)20.3
4，，0.97(6H， t，月.6Hz)14.1
(3)王不留行增乳活性單體的增乳效應(yīng)
①鄰苯二甲酸二丁酯可以顯著促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳糖和卩-酪蛋白分泌能力的提高。②鄰苯二甲酸二丁酯提高泌乳期小鼠和奶牛的動物產(chǎn)奶量試驗表明該單體具有增乳活性。
權(quán)利要求
1.一種從王不留行中分離制備具有增乳活性單體的方法，其特征在于方法步驟如下步驟一王不留行粗提取取王不留行粗粉10kg，用體積分?jǐn)?shù)70％的乙醇加熱回流提取3次，每次2h，減壓回收溶劑，稀釋母液，依次以乙醚、乙酸乙酯萃取，獲得乙酸乙酯萃取部位；步驟二王不留行提取物活性部位的篩選對乙酸乙酯部位進(jìn)行聚酰胺柱層析，干法上樣，分別用水，10％，30％，50％，70％，95％乙醇系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，收集不同梯度洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后獲得不同洗脫部位的中藥成分，通過其對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳模型細(xì)胞活力、乳糖及乳蛋白分泌能力的影響確立50％的乙醇洗脫部位為王不留行增乳活性部位；步驟三王不留行增乳單體的制備對50％的有效部位進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，對聚酰胺柱層析分離獲得的50％乙醇洗脫部位進(jìn)行硅膠薄層層析，根據(jù)硅膠G板的薄層結(jié)果的Rf值情況選擇摸索不同的溶劑系統(tǒng)，最終確立石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為有效分離系統(tǒng)，采用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)對50％乙醇洗脫部位進(jìn)行硅膠柱層析，對分離的化合物進(jìn)行篩選，其中石油醚乙酸乙酯20∶1的洗脫流分中含有一個具有增乳活性的單體成分；對該增乳單體化合物的制備采用分析型和制備型HPLC法進(jìn)行，采用10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的甲醇對單體化合物的粗品進(jìn)行紫外全波長掃描進(jìn)行檢識，確立此化合物的紫外吸收波長為275nm，采用半制備型HPLC對化合物連續(xù)進(jìn)樣以純化并制備出高純度的目的化合物；步驟四增乳單體的結(jié)構(gòu)鑒定采用紫外光譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、高分辨電噴霧質(zhì)譜(HR-ESI-MS)對目的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，以確定目的化合物的分子量、分子式及其具體結(jié)構(gòu)形式，鑒定結(jié)果確定目的化合物為鄰苯二甲酸二丁酯；制備出的鄰苯二甲酸二丁酯可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳糖和β-酪蛋白的分泌水平；且鄰苯二甲酸二丁酯制備的中藥單體注射液的動物試驗結(jié)果表明其可以促進(jìn)小鼠和奶牛產(chǎn)奶量的提高。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種制備方法簡便、純度高、成本低的從王不留行中分離制備具有增乳活性單體的方法。方法步驟包括王不留行粗提取、王不留行提取物活性部位的篩選、王不留行增乳單體的制備、增乳單體的結(jié)構(gòu)鑒定，鑒定結(jié)果確定目的化合物為鄰苯二甲酸二丁酯；制備出的鄰苯二甲酸二丁酯可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳糖和β-酪蛋白的分泌水平；本發(fā)明一種從王不留行中分離制備具有增乳活性單體的方法，在提取過程中采用的乙醇等有機溶劑的成本低廉、無毒、可以回收。采用的聚酰胺柱層析和硅膠柱層析可以擴大規(guī)模化生產(chǎn)，從而可以獲得大量的增乳成分。對于王不留行中藥資源的開發(fā)具有一定的意義，也必然會帶來一定的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C07C69/00GK101648870SQ200910072959
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者佟慧麗, 李慶章, 君 秦, 高學(xué)軍, 黃建國 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)