專(zhuān)利名稱(chēng)：重組蛋白a基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組蛋白A基因，以及含有這種重組基因的載體、轉(zhuǎn)化的菌株和重組蛋白A基因表達(dá)的產(chǎn)物，及其純化方法和親和填料的制備和用途。
背景技術(shù)：
葡萄球菌蛋白A(Staphylococal ProteinA， SPA)是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)。1940年，Vevwey發(fā)現(xiàn)在某些金黃色葡萄球菌中含有一種物質(zhì)，在雙向擴(kuò)散試驗(yàn)中，能與正常人血清形成沉淀。1959年Jensen也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似現(xiàn)象，將其命名為A抗原。1963年Lofkvist等人分離了 A物質(zhì)，證明它是一種蛋白質(zhì)，且與糖有不同；1960年Grov命名其為葡萄球菌蛋白A，簡(jiǎn)稱(chēng)SPA (ProteinA)。編碼SPA的基因于1983年被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)。Uhlen等在1984年闡明了蛋白A的全基因序列和相應(yīng)的氨基酸序列。對(duì)蛋白A的結(jié)構(gòu)和功能研究發(fā)現(xiàn)，SPA包括A、B、C、D、E等5個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都有與大多數(shù)哺乳動(dòng)物IgG的Fc區(qū)獨(dú)立結(jié)合的能力。2003年，L. Yang等應(yīng)用表面張力探針證明每個(gè)蛋白A分子可結(jié)合兩個(gè)IgG分子。 重組蛋白A是抗體純化首選介質(zhì)。盡管目前國(guó)內(nèi)抗體大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)量還相對(duì)較低，但隨著我國(guó)許多抗體藥物大規(guī)模生產(chǎn)計(jì)劃的實(shí)施，抗體生產(chǎn)量將在近幾年內(nèi)迅速增加，由此市場(chǎng)對(duì)蛋白A及其親和填料的需求量會(huì)迅速提高。 目前我們所使用的蛋白A及填料多依賴(lài)于進(jìn)口 ，價(jià)格昂貴，而國(guó)內(nèi)同類(lèi)產(chǎn)品存在產(chǎn)量低、活性差等不足，這些都嚴(yán)重限制了其廣泛大量應(yīng)用。急需一種改進(jìn)的蛋白A制備瓊脂糖凝膠，以獲得更高IgG純度、載量及低proA脫落的穩(wěn)定的親和填料，用于抗體的高效純化。 目前所使用的蛋白A免疫吸附材料采用的基質(zhì)是瓊脂糖凝膠，與蛋白A的偶聯(lián)方式多為溴化氰或環(huán)氧氯丙烷活化偶聯(lián)，這2種活化方式有著明顯不足(l)溴化氰是一種劇毒物質(zhì)，合成過(guò)程對(duì)人體和環(huán)境危害較大；(2)環(huán)氧活化時(shí)，環(huán)氧基在堿性條件下易水解，活化效率低；本研究采用N-羥基琥珀酰亞胺活性酯化法(NHS)活化載體，活化條件溫和，對(duì)蛋白A配體活性影響小，且由于活化過(guò)程中引入間隔臂，使單位體積的蛋白A親和填料可結(jié)合更多的IgG，可明顯提高其IgG結(jié)合載量。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種新的重組蛋白A的基因序列，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供該重組蛋白A的氨基酸序列，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供含有該重組蛋白A基因的載體。 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之四是提供被含有重組蛋白A基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之五是提供該重組蛋白A的制備方法。 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之六是提供該重組蛋白A的用途。 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之七是提供一種由該重組蛋白A和層析介質(zhì)載體組
成的親和層析介質(zhì)。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下 本發(fā)明提供的重組蛋白A基因是以6個(gè)人工合成的重組蛋白A基因單體(基因序 列根據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性進(jìn)行了優(yōu)化)串聯(lián)而成，5'端Ala-Asp變成Val-Asp，以 形成Accl酶切位點(diǎn)，各重組蛋白A基因單體間以Accl酶切位點(diǎn)相連，其中第一個(gè)重組蛋白 A基因單體前端引入與表達(dá)載體pBV220 —致的EcoRI酶切位點(diǎn)及6個(gè)His標(biāo)簽，最后一個(gè) 重組蛋白A基因單體末端加入終止密碼子TAA及與表達(dá)載體一致的BamHI酶切位點(diǎn)。該基 因由1073個(gè)核苷酸組成，編碼352個(gè)氨基酸。該基因序列及編碼的氨基酸序列見(jiàn)序列表 SEQ No. 1和SEQ No. 2。 本發(fā)明還構(gòu)建了含有上述重組蛋白A基因的重組表達(dá)載體，構(gòu)建方法是將化學(xué)合 成的重組蛋白A基因單體用EcoRI和BamHI雙酶切后連接到同樣酶切的pBV220載體上，再 以Accl內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切，構(gòu)建含6個(gè)串聯(lián)重組蛋白A基因單體的重組蛋白A基因表達(dá)載 體。 本發(fā)明還提供了利用上述含大腸桿菌重組表達(dá)載體的大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白A 的方法，該方法是將菌株進(jìn)行發(fā)酵，高效表達(dá)重組蛋白A，再離心菌液收集菌體，超聲破碎， 取離心上清進(jìn)行分離純化，獲得重組蛋白A產(chǎn)品。 本發(fā)明生產(chǎn)的重組蛋白A為可溶性表達(dá)，且具有表達(dá)量高(占細(xì)菌可溶性蛋白總 量的80%以上)、表達(dá)時(shí)間短(僅數(shù)小時(shí))、易于純化、成本低等優(yōu)點(diǎn)，有利于基因工程重組 蛋白A的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 本發(fā)明的重組蛋白A基因的表達(dá)產(chǎn)物重組蛋白A用于與瓊脂糖凝膠等層析介質(zhì)載 體偶聯(lián)制備親和層析填料用于抗體(藥物)的分離純化。 本發(fā)明生產(chǎn)的重組蛋白A具有IgG結(jié)合活性強(qiáng)、純度及產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。 本發(fā)明生產(chǎn)的重組蛋白A親和填料具有IgG載量高、結(jié)合特異性強(qiáng)、親和力好、蛋
白A配體脫落少等優(yōu)點(diǎn)，各項(xiàng)指標(biāo)等同于或優(yōu)于目前市售的protein A S印harose 4Fast
Flow。
圖1是本發(fā)明構(gòu)建的重組表達(dá)載體pBV220-P，是在載體pBV220中加入protein A基因。 圖2重組蛋白A表達(dá)產(chǎn)物分步純化的SDS-PAGE電泳圖。其中泳道1是低分子蛋 白marker ;泳道2是經(jīng)誘導(dǎo)的DH5a/pBV220-P菌體超聲破菌后的離心上清；泳道3是樣品 經(jīng)金屬鎳親和層析柱純化的重組蛋白A ;泳道4是經(jīng)分子篩S印hacryl S200純化的重組蛋 白A。 圖3是本發(fā)明的重組蛋白A與市售的幾種蛋白A的ELISA活性比較圖。 圖4是用人IgG s印harose 6FF測(cè)定重組蛋白A的hlgG結(jié)合活性的色譜圖。圖中第1個(gè)峰為蛋白A流穿峰，第二個(gè)峰為洗脫的蛋白A。 圖5是重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF分離兔血清中的IgG的分離純化色譜圖。 圖6是重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF分離兔血清中的IgG的SDS-PAGE電泳圖，其
中泳道1 :低分子量marker ;泳道2 :兔血清；泳道3 :純化的兔IgG。 圖7是在不同條件下的重組蛋白A的活性ELISA檢測(cè)結(jié)果條形圖。 圖8是重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF的IgG載量穩(wěn)定性檢測(cè)的分離純化色譜圖。 圖9是重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF純化的IgG樣品中脫落配基蛋白A檢測(cè)的標(biāo)
準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1重組蛋白A基因單體的合成 為促進(jìn)金黃色葡萄球菌蛋白A基因在大腸桿菌中的表達(dá)，根據(jù)大腸桿菌密碼子的 偏愛(ài)性，優(yōu)化蛋白A的B結(jié)構(gòu)域基因中某些堿基序列(有多種優(yōu)化方案，序列表SEQNo. 1為 其中一種優(yōu)化后序列)，通過(guò)化學(xué)合成的方法，設(shè)計(jì)合成重組蛋白A基因單體序列，其序列 長(zhǎng)度為174bp，兩端是AccI酶切位點(diǎn)，用于多個(gè)重組蛋白A基因單體連接的接頭。此外，還 包括起始密碼子ATG，終止密碼子TAA、克隆用EcoRI和BamHI限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)及5'端 6XHis標(biāo)簽序列。 實(shí)施例2含有一個(gè)重組蛋白A基因單體的pBV220表達(dá)載體的構(gòu)建 將化學(xué)合成的重組蛋白A基因單體用EcoRI和BamHI雙酶切后連接到同樣酶切的
pBV220載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切
及測(cè)序鑒定后證明重組蛋白A基因單體已克隆至pBV220中。 實(shí)施例3含有重組蛋白A基因的pBV220-P表達(dá)載體的構(gòu)建 將上述的含一個(gè)重組蛋白A基因單體的pBV220載體及重組蛋白A基因單體以 Accl酶切，回收相應(yīng)片段后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，抽提 質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定后證明重組蛋白A基因(6個(gè)蛋白A基因單體串聯(lián))已克隆至 pBV220中。結(jié)果如說(shuō)明書(shū)附圖l所示。
實(shí)施例4pBV220-P表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌 pBV220-P用CaCl2法轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a ，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)
化子，經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定獲得含有pBV220-P的克隆子。 實(shí)施例5利用工程菌E. coli DH5 a /pBV220-P生產(chǎn)重組蛋白A 1)菌種的培養(yǎng)發(fā)酵 按l : 50將大腸桿菌工程菌E. coli DH5a/pBV220-P接種于新鮮LB培養(yǎng)基中， 3(TC培養(yǎng)過(guò)夜；次日在無(wú)菌條件下將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按1 : 20接種至發(fā)酵培養(yǎng)基 中，3(TC培養(yǎng)至0D6。。達(dá)到0. 5-0. 8時(shí)，升溫至42。C誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4h后離心收菌。
2)表達(dá)產(chǎn)物的純化 取發(fā)酵誘導(dǎo)菌用PBS洗滌3次，溶解，超聲破碎，4t:離心，收集上清，用0. 45 y m濾 器過(guò)濾，適當(dāng)稀釋后，用金屬螯合鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱進(jìn)行純化，收集洗脫峰，再將洗 脫液進(jìn)行S印hacryl S200分子篩進(jìn)行純化，收集特征峰即為純化的重組蛋白A，其純化可 達(dá)95%以上，而在菌體上清蛋白中蛋白A含量已超過(guò)80% (含量明顯高于其它相關(guān)專(zhuān)利報(bào)道)。結(jié)果如說(shuō)明書(shū)附2所示。 實(shí)施例6重組蛋白A的ELISA活性 1)兔IgG(2ug/ml)包被，37。C，2h 2)37"，封閉2h，洗板 3)加入不同濃度的重組蛋白A，37t:，lh，洗板 4)加入1 : 1000的辣根標(biāo)記兔IgG抗體，37t: lh，洗板 5)顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)0D450 經(jīng)ELISA檢測(cè)表明，本發(fā)明的重組蛋白A與兔IgG有很好的結(jié)合活性，其活性高于 目前市售的幾種重組蛋白A，且每孔加入lng重組蛋白A即可獲得明顯檢測(cè)信號(hào)。結(jié)果見(jiàn)附 3。 實(shí)施例7重組蛋白A的人IgG結(jié)合活性 人IgG s印harose 6FF膠裝柱1ml (配基含量為18mg IgG/ml膠) 1)填料裝柱后，用平衡緩沖液流PBS洗5 10個(gè)柱床體積平衡柱子。 2)將樣品(蛋白A濃度約10mg/ml)稀釋10倍上柱，上樣流速0. 5ml/min。 3)平衡緩沖液再洗5 10個(gè)柱床體積，把UV洗至基線(xiàn)。 4)洗脫緩沖液0. 1M glycine-HCl， pH 3. 0洗脫，收集洗脫峰，立即用PBS中和到 中性。 5) 0. 1M glycine-HCl洗脫緩沖液流洗3 5個(gè)柱床體積。再用PBS流洗3 5個(gè)
柱床體積。 結(jié)果 用BCA法測(cè)洗脫峰蛋白量為2. 5mg.由此得知本發(fā)明的重組蛋白A的人IgG結(jié)合
活性為7. 2mglgG/mg proA。 色譜圖見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附4 。 實(shí)施例8重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF的制備 1)室溫下將瓊脂糖凝膠6B FF與0. lmol 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和0. lmol/L
N-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的無(wú)水二氧六環(huán)反應(yīng)90min。 2)合成的酯用二氧六環(huán)和甲醇充分洗滌以除去沉淀的二環(huán)己基脲。 3)在pH7. 5，4t:和磷酸鹽緩沖液的條件下，加入重組蛋白A(8mg/ml膠)反應(yīng)6h。 4)偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將凝膠在室溫和pH9的條件下與lmol/L甘氨酸反應(yīng)2h，以破
壞殘留的活性酯。 5)用磷酸鹽緩沖液充分洗滌。 重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF具有以下特點(diǎn) 1)基質(zhì)6%的交聯(lián)瓊脂糖凝膠 2)配體重組蛋白A 3)配體密度約6mg重組蛋白A/ml 4)吸附載量30-40mg人IgG/ml 5)蛋白A脫落少，結(jié)合特異性高 6)最大流速300cm/h 7)pH范圍3-10
8)使用溫度室溫 9)保存溫度及液體4-8°C ， 20%乙醇 10)穩(wěn)定性高親和填料可重復(fù)使用多次而IgG載量無(wú)明顯下降。
實(shí)施例9重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF從兔血清中分離純化IgG
1)重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF裝柱。 2)用緩沖液A洗5 10個(gè)柱床體積平衡柱子，流速為lml/min。 3)將兔血清用緩沖液A稀釋10倍，0. 45 ii m濾膜過(guò)濾，上樣，流速為lml/min。4)用緩沖液A再洗5 10個(gè)柱床體積，流速為lml/min。 5)用緩沖液B洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，立即用中和緩沖液中和到中性。
5)用純水洗10個(gè)柱床體積，再用20%的乙醇流洗10個(gè)柱床體積，流速為2ml/ min，柱子置于4-8t:保存。 6)將分離純化的IgG樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
緩沖液組成 緩沖液A :20mM磷酸鹽緩沖液，pH7. 4。 配制0. 2M NaH2P0419ml， 0. 2M Na2HP0481ml， NaCl 9g加水至1000ml 。 緩沖液B :20mM檸檬酸緩沖液，pH4. 0。配制檸檬酸2. lg加水950ml，用5M NaOH 調(diào)至pH4. O，加水至1000ml。
結(jié)果 分離純化色譜圖見(jiàn)圖5 ;SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖6，泳道1為低分子量蛋白 marker,泳道2為兔血清，泳道3為本發(fā)明的重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF親和填料所裝的 柱子洗脫峰樣品，其上下兩條帶分別是IgG的重鏈和輕鏈。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用本發(fā)明的重組 蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF親和層析介質(zhì)經(jīng)一步純化就可以得到純度大于95 %的IgG，用BCA 法測(cè)洗脫IgG量為35mg/ml膠。 實(shí)施例10本發(fā)明的重組蛋白A不同條件下穩(wěn)定性檢測(cè)取本發(fā)明的重組蛋白A(lmg/ml)分別置于4°C 、室溫7天及pH3和pHll條件下2h， 反復(fù)凍融10次，分別取樣4次，進(jìn)行ELISA活性測(cè)定，觀察蛋白A在不同條件下穩(wěn)定性情況。 ELISA活性測(cè)定見(jiàn)實(shí)施例6重組蛋白A的ELISA活性
結(jié)果 除在室溫下重組蛋白A活性呈明顯下降趨勢(shì)，在其他條件下蛋白活性無(wú)顯著降 低，這表明在常見(jiàn)條件下蛋白A活性穩(wěn)定性較好。
結(jié)果見(jiàn)圖7。 實(shí)施例11重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF穩(wěn)定性檢測(cè) 方法見(jiàn)實(shí)施例8重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF從兔血清中分離純化IgG 上述試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行10次 結(jié)果 BCA法測(cè)10次洗脫峰蛋白量都在30-40mg/ml膠范圍內(nèi)。 從純化峰圖及BCA所測(cè)IgG濃度結(jié)果看，重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF經(jīng)過(guò)10次 兔血清純化試驗(yàn)IgG載量無(wú)下降趨勢(shì)，這表明本發(fā)明的重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF的IgG 載量穩(wěn)定性很好。分離純化色譜圖見(jiàn)圖8。
實(shí)施例12重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF純化IgG樣品中脫落配基蛋白A檢測(cè) 用cygnus protein A ELISA試劑盒F400進(jìn)行IgG樣品的殘留蛋白A檢測(cè)。 方法見(jiàn)cygnus protein A ELISA試劑盒F400使用說(shuō)明書(shū)。 結(jié)果 蛋白A ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖9。 根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算IgG樣品中殘留蛋白A含量〈lng/mg IgG，普遍低于國(guó)內(nèi)外
同類(lèi)產(chǎn)品水平。 序列表 1. —般信息 發(fā)明名稱(chēng)高效抗體純化介質(zhì)_重組蛋白A及其親和填料的制備 序列數(shù)目2 2. SEQ ID Nol的信息 Organization Applicant -------------------- Street :北京經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)永昌中路6號(hào) City:北京 State: Country :中國(guó) PostalCode :100176 PhoneNumber :86-10-67871177 FaxNumber :86-10-67877776 EmailAddress :gong_zl@agtc. com. cn 〈110>bastName :zhaolong 〈110>FirstName :gong 〈110〉Middlelnitial : 〈110〉Suffix: Application Proj ect ------------------- 〈120〉Title :重組蛋白A基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制備 〈130>AppFileReference :Cloned Genes Encoding Recombinant protein A 〈140>CurrentAppNumber : 〈141〉CurrentFilingDate :2008-12-21 Sequence -------- 〈213>0rganismName -Staphylococcus aureus 〈400〉PreSequenceString : g朋ttcatet ggtggtggat朋ca朋ttc;a 3C3朋g3gca gcag朋cgcg ttctecgaga 60 tcctgcatct gccgaacctg aacgaagaac agcgteacgc cttcatccag tctctgaaag 120 atgacccatc tcaaagcgct aaccttctgg cagaagctea gaagctg朋t gatgctcagg 180
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皿3g3gC3gCagaacgcgtt ctecgagatc ctgcatctgc420
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tg皿cg皿ga cteaccttct
ttctggcaga
agcgteacgc C3g皿gctea 〈212〉Type :DNA 〈211〉Length :1073 SequenceName :protein SequenceDescription :無(wú) 3. SEQ ID No2的信息 Organization Applicant
Street :北京經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)永昌中路6號(hào) City :北京 State :
Country :中國(guó) PostalCode :100176 PhoneNumber :86_10_67871177 FaxNumber :86-10-67877776 EmailAddress :gong_zlfegtc. com. cn 〈110〉LastName :zhaolong 〈110〉FirstName :gong 〈110〉Middlelnitial : 〈110〉Suffix : Application Project
A gene
〈120〉Title :重組蛋白A基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制備
〈130〉A(chǔ)ppFileReference :Cloned Genes Encoding Recombinant protein 〈140〉CurrentAppNumber :8/8頁(yè)
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〈141>CurrentFilingDate :08_12_21 Sequence
〈213>0rganismName -Staphylococcus aureus 〈400>PreSequenceString :METVALVALASPASNLYSPHEASNLYSGLU GLNGLNASNALAPHETYRGLUILELEUHISLEUPROASNLEUASNGLUGLUGLNARGASN ALAPHEILEGLNSERLEULYSASPASPPROSERGLNSERALAASNLEULEUA1AGLUALA LYSLYSLEUASNASPALAGLNALAPROLYSVALASPASNLYSPHEASNLYSGLUGLNGLN ASNALAPHETYRGLUILELEUHISLEUPRO ASNLEUASNGLUGLUGLNARGASNALAPHE ILEGLNSERLEULYSASPASPPROSERGLNSERALAASNLEULEUALAGLUA1ALYSLYS LEUASNASPALAGLNALAPROLYSVALASPASNLYSPHEASNLYSGLUGLNGLNASNALA PHETYRGLUILELEUHISLEUPROASNLEUASNGLUGLUGLNARGASNALAPHEILEGLN SERLEULYSASPASPPROSERGLNSERALAASNLEULEUALAGLUALALYSLYSLEUASN ASPALAGLNALAPROLYSVALASPASNLYSPHEASNLYSGLUGLNGLNASNA1APHETYR GLUILELEUHISLEUPROASNLEUASNGLUGLUGLNARGASNALAPHEILEGLNSERLEU LYSASPASPPROSERGLNSERALAASNLEULEUALAGLUALALYSLYSLEUASNASPALA GLNALAPROLYSVALASPASNLYSPHEASNLYSGLUGLNGLNASNALAPHETYRGLUILE LEUHISLEUPROASNLEUASNGLUGLUGLNARGASNALAPHEILEGLNSERLEULYSASP ASPPROSERGLNSERALAASNLEULEUALAGLUALALYSLYSLEUASNASPA1AGLNALA PROLYSVALASPASNLYSPHEASNLYSGLUGLNGLNASNALAPHETYRGLUILELEUHIS LEUPROASNLEUASNGLUGLUGLNARGASNALAPHEILEGLNSERLEULYSASPASPPRO SERGLNSERALAASNLEULEUALAGLUALA
LYS LYS LEU ASN ASP ALA GLN 〈212>Type:PRT 〈211〉Length :352 SequenceName :protein A
ALA PRO LYS VAL ASP
權(quán)利要求
一種人工重組蛋白A的基因表達(dá)序列，其特征是1)其序列根據(jù)宿主菌大腸桿菌密碼子的特點(diǎn)進(jìn)行了優(yōu)化；2)包含6個(gè)人工重組蛋白A的基因單體重復(fù)序列；3)包含his標(biāo)簽序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1，所述的基因序列為SEQ Nol。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l，所述的重組蛋白A的氨基酸序列為SEQ No2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l，所述的重組蛋白A基因表達(dá)載體為原核表達(dá)載體，其特征為所述表達(dá)載體優(yōu)先為pBV220。
5. —種重組蛋白A瓊脂糖凝膠，其特征是以瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，采用N-羥基琥珀酰亞胺活性酯化法(NHS)活化載體，將所述的蛋白A以共價(jià)鍵的方式固定在載體表面，從而合成了蛋白A瓊脂糖凝膠。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5，所述的瓊脂糖凝膠可以用于抗體分離純化。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是將蛋白A的B結(jié)構(gòu)域基因單體根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建六串體插入熱誘導(dǎo)型大腸桿菌載體pBV220，構(gòu)建了含有該基因的大腸桿菌表達(dá)載體及其轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α重組株和利用此菌株生產(chǎn)重組蛋白A的方法。此菌株所產(chǎn)生的可溶性重組蛋白A達(dá)到細(xì)菌可溶性蛋白總量的80％以上，以后只經(jīng)鎳離子螯合層析和分子篩柱層析即可將重組蛋白A純化到95％以上純度，且該蛋白具有表達(dá)量高、成本低、易純化等優(yōu)點(diǎn)。用其制備的重組蛋白A親和填料具有人IgG吸附載量高、proA脫落少等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明為獲得質(zhì)量高且價(jià)格便宜的抗體(藥物)純化介質(zhì)重組蛋白A提供了一條切實(shí)可行的途徑。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101760466SQ20081024055
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日
發(fā)明者何新舟, 宮照龍, 曹暉, 許允立 申請(qǐng)人:本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司