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燕窩全基因組dna的提取方法

文檔序號:3573465閱讀:632來源:國知局
專利名稱:燕窩全基因組dna的提取方法
技術領域
本發(fā)明涉及生物化學領域,具體涉及脫氧核酸的提取方法。
背景技術
常見的燕窩是雨燕科(Apodidae)金絲燕屬(Aerodramus或Collocalia)的多種鳥類分 泌出的唾液或唾液與其絨羽混合而成的凝膠干結物,也有部分燕窩是雨燕科(Apodidae)雨 燕屬(Apus)某些鳥類筑巢時分泌出的唾液干結物,如中國廣東省懷集縣出產(chǎn)的燕窩(有的地方 也叫龍牙燕窩)。由于燕窩是名貴補品,市價之高導致不法商販以假亂真、以次充好,許多偽 劣、假冒產(chǎn)品從外觀上難以區(qū)分,而燕窩中的DNA主要來自于唾液中脫落的n腔上皮細胞 和絨羽上的毛囊細胞,這是無法偽造的,因此,分子檢測手段在燕窩質(zhì)量控制方面顯得尤為 重要。
目前常用的DNA提取方法主要有苯酚法、CTAB法和高鹽低pH法。
苯酚法用SDS裂解細胞使DNA釋放出來,然后交替用苯酚/氯仿這兩種不同的蛋白質(zhì)變 性劑抽提,去除溶液中的蛋白質(zhì)。苯酚、氯仿去蛋白質(zhì)的能力較強而去多糖的能力較弱,因 此常用于動物組織的DNA提取,對植物組織的DNA提取效果欠理想。
CTAB法因為能較好地去除多糖雜質(zhì),故常用于植物組織的DNA提取。CTAB即十六烷 基三甲基溴化銨,是一種陽離子去污劑。CTAB即可以裂解細胞膜,使DNA釋放出來,又可 以在不同鹽濃度下選擇性地沉淀多糖或DNA,達到純化的目的。當溶液中鹽濃度大于0.7M 時,CTAB與多糖形成沉淀,與DNA形成水溶性復合物,通過氯仿抽提可使CTAB-多糖沉 淀復合物從溶液中釋出去除,而CTAB-DNA復合物仍保留在上清液中,分離上清液并加入異 丙醇或乙醇,可使DNA釋出沉淀而CTAB仍留在溶液中。當溶液中鹽濃度小于0.5M時,CTAB 與DNA形成沉淀,通過高速離心可使CTAB-DNA沉淀從溶液中釋出與蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì) 分離,CTAB-DNA沉淀可通過高鹽溶解,再加入異丙醇或乙醇沉淀DNA。
高鹽低pH法主要也是用于植物組織DNA提取。低pH有利于防止植物中的多酚類物質(zhì) 氧化,高鹽則有利于蛋白質(zhì)沉淀。
但是,燕窩唾液中的主要成分是唾液酸糖蛋白,其分子結構含有肽鏈和糖鏈,因而要兼 具蛋白質(zhì)與多糖的理化性質(zhì),在提取DNA時,大量的唾液酸糖蛋白容易與DNA共沉淀,因 此,無論使用上述哪一種提取方法,所得DNA的純度不高,使下游實驗難以進行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從燕窩中提取基因組DNA的方法。本發(fā)明實現(xiàn)上述目的的技術方案是-
燕窩全基因組DNA的提取方法,該方法由以下步驟組成
(1) 取燕窩干品研磨成120目細粉,按重量體積比為1 : IO加入SDS緩沖液,于65。C 水浴2小時,高速離心;
(2) 取上清,加入等體積的氯仿異戊醇混合液,混合均勻,高速離心;
(3) 取上清,在室溫下加入十分之一體積的CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min, 然后加入等體積的氯仿異戊醇混合液,混勻,高速離心;
(4) 取上清,加入0.6 0.8體積倍預冷的異丙醇,混勻后立即高速離心;
(5) 取沉淀物用75 80%乙醇洗滌后將乙醇吹干,溶于TE溶液,即可; 上述步驟中,
所述的SDS緩沖液是Tris-HCl、 EDTA、 SDS、 DTT、蛋白酶k和NaCl的混合水溶液, 其中Tris-HCl的濃度為30 100mM, EDTA的濃度為8 30mM, SDS的濃度為5 20g/L, DTT的濃度為0.04 M,蛋白酶k的濃度為100 300mg/L, NaCl的濃度為0.7 2.0M;
所述的CTAB緩沖液是CTAB和NaCl的混合水溶液,其中CTAB的濃度為50 150g/L, NaCl的濃度為0.7M。
本發(fā)明方法中,所述的SDS緩沖液中的SDS濃度最好是10g/L, NaCl濃度最好是2.0M; 所述的CTAB緩沖液中CTAB的濃度為100g/L。
本發(fā)明方法中,步驟(4)所述的異丙醇的用量最佳為0.7體積倍。 本發(fā)明方法中,步驟(5)所述的乙醇的濃度最佳為75°/0。 本發(fā)明方法中,所述的Tris-HCl的濃度最佳為50mM。 本發(fā)明方法中,所述的EDTA的濃度最佳為10mM。 本發(fā)明方法中,所述的蛋白酶k的濃度最佳為200mg/L。
本發(fā)明方法中,所述的燕窩是雨燕科(Apodidae)金絲燕屬(Aerodramus或Collocalia) 的鳥類分泌出的唾液或唾液與其絨羽混合而成的凝膠干結物,如金絲燕燕窩、白燕燕窩、血 燕燕窩;或者是雨燕科(Apodidae)雨燕屬(Apus)的鳥類分泌出的唾液或唾液與其絨羽混合 而成的凝膠干結物,如懷集出產(chǎn)的燕窩(有的地方也稱龍牙燕窩)。
本發(fā)明方法中,所述的SDS為十二烷基磺酸鈉,EDTA為二乙胺四乙酸,DTT為二硫蘇 糖醇,CTAB為十六垸基三甲基溴化銨。
本發(fā)明方法中,各步驟中所述的高速離心為本領域分離基因組DNA的常規(guī)操作,其速 度和時間通常為12000g和5min,并盡量在低溫(4°C)下操作;步驟(2)和(3)所述的氯 仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的比例為24 : 1。本發(fā)明首先利用SDS和DTT使燕窩中細胞裂解,在裂解的同時用高濃度的NaCl除去大 部分糖蛋白,可減少純化時糖蛋白對DNA的干擾,接著用氯仿異戊醇除去蛋白質(zhì),此時DNA 所在的上清液仍處于高鹽狀態(tài),加入CTAB進一步除去糖蛋白,然后再次通過氯仿異戊醇將糖 蛋白和CTAB的結合物除去,最后用-2(TC預冷的異丙醇在室溫下短時間使DNA沉淀,可最大 限度減少糖蛋白和DNA共沉淀。由此可見,本發(fā)明方法主要是利用高濃度鹽溶液使蛋白沉淀 以及CTAB在高離子強度下能使多糖沉淀但不能使核酸沉淀的原理,消除了糖蛋白對DNA 提取的干擾,所得基因組DNA質(zhì)量較好,能滿足PCR反應的要求,使得利用分子手段鑒定燕 窩品種得以實現(xiàn)。此外,本發(fā)明方法結果穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,且操作簡單、費用低、無需特殊 試劑和儀器。


圖1是燕窩中基因組DNA電泳圖,其中泳道M: Marker DNA大小標準;S:鮭魚精基 因組DNA對照品;1-4:實施例l-4提取的DNA; 5-10:實施例5-10提取的DNA; 11-12: 實施例11-12提取的DNA。
圖2是實施例3所得的燕窩基因組DNA的巢示PCR產(chǎn)物電泳圖,其中泳道M: Marker
DNA大小標準;1: PCR產(chǎn)物。
具體實施方式
例l
1、 材料白燕燕窩,購自新加坡錦興公司。
2、 方法
取白燕燕窩干品研磨成120目細粉,稱取0.1200g,加入1.2ml SDS緩沖液,65°。水浴2h, 前半小時輕輕搖動4次。4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中加入等體積氯仿異 戊醇混合液,混合均勻后,4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中在室溫下(20°C) 加入O.l體積CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min,然后加入與混合液等體積的氯仿 異戊醇混合液,混合均勻后,4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液加入0.7體積-20 。C的異丙醇,混合均勻后馬上4。C下12000xg離心5min,所得沉淀用75%乙醇洗滌,吹干乙 醇。沉淀溶解于TE溶液。-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 所述的SDS緩沖液由pH為8.0的50mM的Tris-HCl、 pH為8.0的10mM的EDTA、重 量體積百分含量為1%SDS、 0.04 M DTT、 200ng/ml蛋白酶k、 2.0M NaCl和水組成; 所述的CTAB緩沖液由重量體積百分含量為10% CTAB、 0.7MNaCl和水組成; 所述的氯仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1。3、結果取6^iLDNA溶液于0.8。/。瓊脂糖凝膠中電泳,結果如圖1所示,所提取的DNA 條帶清晰,說明DNA質(zhì)量較好。
例2
1、 材料血燕燕窩,購自新加坡錦興公司
2、 方法
取血燕燕窩干品研磨成120目細粉,稱取0.1200g,加入1.2ml SDS緩沖液,65。C水浴2h, 前半小時輕輕搖動4次。4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中加入等體積氯仿異 戊醇混合液,混合均勻后,4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中在室溫下(20°C) 加入O.l體積CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min,然后加入與混合液等體積的氯仿 異戊醇混合液,混合均勻后,4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液加入0.7體積-20 'C的異丙醇,混合均勻后馬上4。C下12000xg離心5min,所得沉淀用75%乙醇洗滌,吹干乙 醇。沉淀溶解于TE溶液。-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 所述的SDS緩沖液由pH為8.0的50mM的Tris-HCl、 pH為8.0的10mM的EDTA、重 量體積百分含量為1%SDS、 0.04MDTT、 200昭/ml蛋白酶k、 2.0M NaCl和水組成; 所述的CTAB緩沖液由重量體積百分含量為10% CTAB、 0.7MNaCl和水組成; 所述的氯仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1。
3、 結果取6pLDNA溶液于0.8n/。瓊脂糖凝膠中電泳,結果如圖1所示,所提取的DNA 條帶清晰,說明DNA質(zhì)量較好。
例3
1、 材料金絲燕燕窩,購自新加坡錦興公司
2、 方法
取金絲燕燕窩干品研磨成120目細粉,稱取0.1200g,加入1,2mlSDS緩沖液,65。C水浴 2h,前半小時輕輕搖動4次。4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中加入等體積氯 仿異戊醇混合液,混合均勻后,4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中在室溫下(20 nC)加入0.1體積CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min,然后加入與混合液等體積的 氯仿異戊醇混合液,混合均勻后,4匸下12000xg離心5min取上清。所得上清液加入0.7體 積-2(TC的異丙醇,混合均勻后馬上4'C下12000xg離心5min,所得沉淀用75%乙醇洗滌,吹 干乙醇。沉淀溶解于TE溶液。-20匸保存?zhèn)溆谩?br> 所述的SDS緩沖液由pH為8.0的50mM的Tris-HCl、 pH為8.0的10mM的EDTA、重量體積百分含量為1%SDS、 0.04 M DTT、 200嗎/ml蛋白酶k、 2.0M NaCl和水組成; 所述的CTAB緩沖液由重量體積百分含量為10% CTAB、 0.7M NaCl和水組成; 所述的氯仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1。
3、 結果取6^iLDNA溶液于0.8y。瓊脂糖凝膠中電泳,結果如圖1所示,所提取的DNA 條帶清晰,說明DNA質(zhì)量較好。
4、 以巢式PCR反應結果檢測DNA的提取質(zhì)量,方法如下
PCR反應緩沖液采用預混合液(2 x ),含Taq酶1.25U/25nl, dNTP各0.4mM, Mg2+ 3mM。 第一次PCR反應體系為25^1,其中premixTaql2.5ial,引物濃度各0.3)aM,模板0.8pl-2^1, 純水補足體積。循環(huán)參數(shù)94'C變性lmin, 51。C退火lmin, 72"C延伸90S, 40個循環(huán)。首 次循環(huán)前94。C變性4min,最后一個循環(huán)后72'C延伸4min。正向引物為ND5(序列 TAGCTAGGATCTTTCGCCCT),反向引物為Thr(序列TCTTTGGTTTACAAGACCAATGTT)。 第二次PCR反應體系為5(^1,其中預混合液25pl,引物濃度各0.3pM,模板1.2pl,純水補 足體積。循環(huán)參數(shù)94'C變性30S, 60'C退火30S, 72。C延伸30S, 30個循環(huán)。首次循環(huán)前 94'C變性2min,最后一個循環(huán)后72 °C延伸4min 。正向引物為Cytb413(序列 GTAGGATATGTCCTNCCHTGAGG), 反向引物為Cytb818(序歹U : GGCATATGCGAATARGAARTATCA)。取第二次PCR產(chǎn)物3pL于2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。
PCR產(chǎn)物的電泳圖見圖2,該圖顯示按本發(fā)明方法提取的DNA可進行PCR反應,所得 產(chǎn)物大小符合實驗設計(400bp)。
例4
1、 材料懷集出產(chǎn)的燕窩,購自中國廣東省懷集縣燕窩加工廠。
2、 方法:
取燕窩干品研磨成120目細粉,稱取0.1200g,加入L2mlSDS緩沖液,65'C水浴2h,前 半小時輕輕搖動4次。4"C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中加入等體積氯仿異戊 醇混合液,混合均勻后,4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中在室溫下(20°C)加 入O.l體積CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min,然后加入與混合液等體積的氯仿異 戊醇混合液,混合均勻后,fC下12000xg離心5min取上清。所得上清液加入0.7體積-2(TC 的異丙醇,混合均勻后馬上4。C下12000xg離心5min,所得沉淀用75%乙醇洗滌,吹干乙醇。 沉淀溶解于TE溶液。-20卩保存?zhèn)溆谩?br> 所述的SDS緩沖液由pH為8.0的50mM的Tris-HCl、 pH為8.0的10mM的EDTA、重 量體積百分含量為1%SDS、 0.04M DTT、 200嗎/ml蛋白酶k、 2.0M NaCl和水組成;所述的CTAB緩沖液由重量體積百分含量為10% CTAB、 0.7MNaCl和水組成; 所述的氯仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1。
3、結果取6pLDNA溶液于0.8。/。瓊脂糖凝膠中電泳,結果如圖1所示,所提取的DNA 條帶清晰,說明DNA質(zhì)量較好。 例5
1、 材料白燕燕窩,購自新加坡錦興公司
2、 方法
取白燕燕窩干品研磨成120目細粉,稱取0.1200g,加入1.2ml SDS緩沖液,65。C水浴2h, 前半小時輕輕搖動4次。4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中加入等體積氯仿異 戊醇混合液,混合均勻后,4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中在室溫下(20°C) 加入0.1體積CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min,然后加入與混合液等體積的氯仿 異戊醇混合液,混合均勻后,4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液加入0.7體積-20 。C的異丙醇,混合均勻后馬上4"下12000xg離心5min,所得沉淀用75%乙醇洗滌,吹干乙 醇。沉淀溶解于TE溶液。-20匸保存?zhèn)溆谩?br> 所述的SDS緩沖液由pH為8.0的50mM的Tris-HCl、 pH為8.0的10mM的EDTA、重 量體積百分含量為0.5°/。 SDS、 0.04MDTT、 200ng/ml蛋白酶k、 0.7M NaCl和水組成; 所述的CTAB緩沖液由重量體積百分含量為10°/。 CTAB、 0.7M NaCl和水組成; 所述的氯仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1。
3、 結果取6nLDNA溶液于0.8。/。瓊脂糖凝膠中電泳,結果如圖1所示,所提取的DNA 條帶清晰,說明DNA質(zhì)量較好。
例6
1、 材料血燕燕窩,購自新加坡錦興公司
2、 方法
取血燕燕窩干品研磨成120目細粉,稱取0.1200g,加入1.2ml SDS緩沖液,65"C水浴2h, 前半小時輕輕搖動4次。4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中加入等體積氯仿異 戊醇混合液,混合均勻后,4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中在室溫下(20°C) 加入O.l體積CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min,然后加入與混合液等體積的氯仿 異戊醇混合液,混合均勻后,4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液加入0.7體積-20 。C的異丙醇,混合均勻后馬上4。C下12000xg離心5min,所得沉淀用75%乙醇洗滌,吹干乙 醇。沉淀溶解于TE溶液。-20°<:保存?zhèn)溆谩K龅腟DS緩沖液由pH為8.0的50mM的Tris-HCl、 pH為8.0的lOmM的EDTA、重 量體積百分含量為2%SDS、 0.04MDTT、 200嗎/ml蛋白酶k、 2.0MNaCl和水組成; 所述的CTAB緩沖液由重量體積百分含量為10% CTAB、 0.7MNaCl和水組成; 所述的氯仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1。
3、結果取6pLDNA溶液于0.8c/。瓊脂糖凝膠中電泳,結果如圖1所示,所提取的DNA 條帶清晰,說明DNA質(zhì)量較好。 例7
1、 材料金絲燕燕窩,購自新加坡錦興公司
2、 方法
取金絲燕燕窩干品研磨成120目細粉,稱取0.1200g,加入1.2mlSDS緩沖液,65。C水浴 2h,前半小時輕輕搖動4次。4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中加入等體積氯 仿異戊醇混合液,混合均勻后,4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中在室溫下(20 'C)加入O.l體積CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min,然后加入與混合液等體積的 氯仿異戊醇混合液,混合均勻后,4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液加入0.7體 積-20。C的異丙醇,混合均勻后馬上4'C下12000xg離心5min,所得沉淀用75%乙醇洗滌,吹 干乙醇。沉淀溶解于TE溶液。-20"保存?zhèn)溆谩?br> 所述的SDS緩沖液由pH為8.0的50mM的Tris-HCl、 pH為8.0的10mM的EDTA、重 量體積百分含量為0.5%SDS、 0.04MDTT、 200pg/ml蛋白酶k、 1.4MNaCl和水組成; 所述的CTAB緩沖液由重量體積百分含量為10% CTAB、 0.7MNaCl和水組成; 所述的氯仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1。
3、 結果取6nLDNA溶液于0.8M瓊脂糖凝膠中電泳,結果如圖1所示,所提取的DNA 條帶清晰,說明DNA質(zhì)量較好。
例8
1、 材料懷集出產(chǎn)的燕窩,,購自中國廣東省懷集縣燕窩加工廠。
2、 方法
取燕窩干品研磨成120目細粉,稱取0.1200g,加入1.2mlSDS緩沖液,65'C水浴2h,前 半小時輕輕搖動4次。4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中加入等體積氯仿異戊 醇混合液,混合均勻后,4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中在室溫下(2(TC)加 入O.l體積CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min,然后加入與混合液等體積的氯仿異 戊醇混合液,混合均勻后,4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液加入0.7體積-20'C的異丙醇,混合均勻后馬上4。C下12000xg離心5min,所得沉淀用75%乙醇洗滌,吹千乙醇。 沉淀溶解于TE溶液。-20^保存?zhèn)溆谩?br> 所述的SDS緩沖液由pH為8.0的50mM的Tris-HCl、 pH為8.0的10mM的EDTA、重 量體積百分含量為1%SDS、 0.04MDTT、 200ng/ml蛋白酶k、 1.4MNaCl和水組成; 所述的CTAB緩沖液由重量體積百分含量為10% CTAB、 0.7MNaCl和水組成; 所述的氯仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1。
3、結果取6pLDNA溶液于0.8o/。瓊脂糖凝膠中電泳,結果如圖1所示,所提取的DNA 條帶清晰,說明DNA質(zhì)量較好。 例9
1、材料血燕燕窩,購自新加坡錦興公司 '2、方法
取血燕燕窩干品研磨成120目細粉,稱取0.1200g,加入1.2ml SDS緩沖液,65。C水浴2h, 前半小時輕輕搖動4次。4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中加入等體積氯仿異 戊醇混合液,混合均勻后,4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中在室溫下(2(TC) 加入O.l體積CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min,然后加入與混合液等體積的氯仿 異戊醇混合液,混合均勻后,4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液加入0.7體積-20 。C的異丙醇,混合均勻后馬上4。C下12000xg離心5min,所得沉淀用75。/。乙醇洗漆,吹干乙 醇。沉淀溶解于TE溶液。-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 所述的SDS緩沖液由pH為8.0的50mM的Tris-HCl、 pH為8.0的10mM的EDTA、重 量體積百分含量為1%SDS、 0.04MDTT、 200嗎/ml蛋白酶k、 2.0M NaCl和水組成;
所述的CTAB緩沖液由重量體積百分含量為5% CTAB、 0.7M NaCl和水組成; 所述的氯仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1。
3、結果取6pLDNA溶液于0.8y。瓊脂糖凝膠中電泳,結果如圖1所示,所提取的DNA 條帶清晰,說明DNA質(zhì)量較好。 例10
1、 材料金絲燕燕窩,購自新加坡錦興公司
2、 方法
取金絲燕燕窩干品研磨成120目細粉,稱取0.1200g,加入1.2mlSDS緩沖液,65'C水浴 2h,前半小時輕輕搖動4次。4。C下12000化離心5min取上清。所得上清液中加入等體積氯 仿異戊醇混合液,混合均勻后,4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中在室溫下(20'C)加入O.l體積CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min,然后加入與混合液等體積的 氯仿異戊醇混合液,混合均勻后,4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液加入0.7體 積-20'C的異丙醇,混合均勻后馬上4t:下12000xg離心5min,所得沉淀用75%乙醇洗滌,吹 干乙醇。沉淀溶解于TE溶液。-20'C保存?zhèn)溆谩?br> 所述的SDS緩沖液由pH為8.0的50mM的Tris-HCl、 pH為8.0的lOmM的EDTA、重 量體積百分含量為1%SDS、 0.04MDTT、 200pg/ml蛋白酶k、 2.0M NaCl和水組成; 所述的CTAB緩沖液由重量體積百分含量為15%CTAB、 0.7M NaCl和水組成 所述的氯仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1。
3、結果取6pLDNA溶液于0.8。/。瓊脂糖凝膠中電泳,結果如圖1所示,所提取的DNA 條帶清晰,說明DNA質(zhì)量較好。 例11
1、 材料金絲燕燕窩,購自新加坡錦興公司。
2、 方法
取金絲燕燕窩干品研磨成120目細粉,稱取0.1200g,加入L2mlSDS緩沖液,65。C水浴 2h,前半小時輕輕搖動4次。4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中加入等體積苯 酚氯仿異戊醇混合液,混合均勻后,4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中加入等 體積氯仿異戊醇混合液,混合均勻后,4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液加入0.7 體積-20'C的異丙醇,混合均勻后馬上4'C下12000xg離心5min,所得沉淀用75%乙醇洗滌, 吹干乙醇。沉淀溶解于TE溶液。-20'<:保存?zhèn)溆谩?br> 所述的SDS緩沖液由pH為8.0的50mM的Tris-HCl、 pH為8.0的10mM的EDTA、重 量體積百分含量為1%SDS、 0.04MDTT、 200pg/ml蛋白酶k、 2.0MNaCl和水組成; 所述的苯酚氯仿異戊醇混合液中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25: 24:1。
所述的氯仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1。
3、 結果取6pLDNA溶液于0.8%瓊脂糖凝膠中電泳,結果如圖1所示,泳道11的DNA 加樣孔滯留,DNA條帶彎曲拖尾,說明用常規(guī)的苯酚法提取燕窩DNA效果欠佳。
例12
1、 材料血燕燕窩,購自新加坡錦興公司。
2、 方法取血燕燕窩干品研磨成120目細粉,稱取0.1200g,加入1.2ml SDS緩沖液,65。C水浴2h, 前半小時輕輕搖動4次。4'C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中加入等體積氯仿異 戊醇混合液,混合均勻后,4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液中在室溫下(20°C) 加入O.l體積CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min,然后加入與混合液等體積的氯仿 異戊醇混合液,混合均勻后,4。C下12000xg離心5min取上清。所得上清液加入0.7體積-20 'C的異丙醇,混合均勻后馬上4"下12000xg離心5min,所得沉淀用75%乙醇洗滌,吹干乙 醇。沉淀溶解于TE溶液。-2(rc保存?zhèn)溆谩?br> 所述的SDS緩沖液由pH為8.0的50mM的Tris-HCl、 pH為8.0的10mM的EDTA、重 量體積百分含量為1%SDS、 0.04MDTT、 200pg/ml蛋白酶k和水組成;
所述的CTAB緩沖液由重量體積百分含量為10%CTAB、 0.7MNaCl和水組成; 所述的氯仿異戊醇混合液中氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1。
3、結果取6pLDNA溶液于0.8。/。瓊脂糖凝膠中電泳,結果如圖1所示,電泳圖泳道12 中顯示沒有DNA,說明裂解時的SDS緩沖液若不含NaCl,不能提取到燕窩DNA。
權利要求
1、燕窩全基因組DNA的提取方法,該方法由以下步驟組成(1)取燕窩干品研磨成120目細粉,按重量體積比為1∶10加入SDS緩沖液,于65℃水浴2小時,高速離心;(2)取上清,加入等體積的氯仿異戊醇混合液,混合均勻,高速離心;(3)取上清,在室溫下加入十分之一體積的CTAB緩沖液,混合均勻后室溫下放置15min,然后加入等體積的氯仿異戊醇混合液,混勻,高速離心;(4)取上清,加入0.6~0.8體積倍預冷的異丙醇,混勻后立即高速離心;(5)取沉淀物用75~80%乙醇洗滌后將乙醇吹干,溶于TE溶液,即可;上述步驟中,所述的SDS緩沖液是Tris-HCl、EDTA、SDS、DTT、蛋白酶k和NaCl的混合水溶液,其中Tris-HCl的濃度為30~100mM,EDTA的濃度為8~30mM,SDS的濃度為5~20g/L,DTT的濃度為0.04M,蛋白酶k的濃度為100~300mg/L,NaCl的濃度為0.7~2.0M;所述的CTAB緩沖液是CTAB和NaCl的混合水溶液,其中CTAB的濃度為50~150g/L,NaCl的濃度為0.7M。
2、 如權利要求1所述的提取方法,其特征在于所述的SDS緩沖液中的SDS濃度是10g/L, NaCl濃度是2.0M。
3、 如權利要求1所述的提取方法,其特征在于所述的CTAB緩沖液中CTAB的濃度為 100g/L。
4、 如權利要求1所述的提取方法,其特征在于步驟(4)所述的異丙醇的用量為0.7體 積倍。
5、 如權利要求1所述的提取方法,其特征在于步驟(5)所述的乙醇的濃度為75%。
6、 如權利要求1所述的提取方法,其特征在于所述的Tris-HCl的濃度為50mM。
7、 如權利要求1所述的提取方法,其特征在于所述的EDTA的濃度為10 mM。
8、 如權利要求1所述的提取方法,其特征在于所述的蛋白酶k的濃度為200mg/L。
9、 如權利要求1 8之一所述的提取方法,其特征在于所述的燕窩是雨燕科金絲燕屬或 雨燕屬的鳥類分泌出的唾液或唾液與其絨羽混合而成的凝膠干結物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從燕窩中提取基因組DNA的方法,該方法是首先利用SDS和DTT使燕窩中細胞裂解,在裂解的同時用高濃度的NaCl除去大部分糖蛋白,可減少純化時糖蛋白對DNA的干擾,接著用氯仿異戊醇結合CTAB進一步除去糖蛋白,最后用異丙醇在低溫下短時間使DNA沉淀,可最大限度減少糖蛋白和DNA共沉淀。本發(fā)明方法結果穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,且操作簡單、費用低、無需特殊試劑和儀器,所得基因組DNA質(zhì)量較好,能滿足PCR反應的要求,可實現(xiàn)燕窩品種的鑒定。
文檔編號C07H21/00GK101423542SQ200810219930
公開日2009年5月6日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權日2008年12月12日
發(fā)明者雁 候, 冼小敏, 華 周, 林潔茹, 王培訓, 蔣東旭, 賴小平, 陳建南, 松 黃 申請人:廣州中醫(yī)藥大學
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