專利名稱：：一種抗腫瘤抗生素和其藥學(xué)上可接受的鹽、及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗腫瘤抗生素NC0604和其藥學(xué)上可接受的鹽，及其制備方法和用途，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：博萊霉素是一類具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和獨(dú)特作用的廣譜抗菌抗腫瘤抗生素，博萊霉素抗生素的分子結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>博萊霉素(A2+B2為主)具有有效的抗淋巴、頭、頸癌和生殖細(xì)胞腫瘤的作用。博萊霉素在腫瘤治療過程中的骨髓抑制作用和免疫抑制作用都很低，因此已成為臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥。然而，因?yàn)闀?huì)產(chǎn)生劑量依賴型肺纖維化的副作用，使其應(yīng)用受到局限。因此開發(fā)療效好，肺毒性低的新的博萊霉素族化合物一直是研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明研究人員在研究過程中發(fā)現(xiàn)了一種與已知博萊霉素族化合物結(jié)構(gòu)有所不同的新的化合物，并對(duì)其生物活性和肺毒性作用進(jìn)行了初步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與臨床在用的博萊霉素相比，其活性更好，肺毒性更低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種抗腫瘤活性更好而肺毒性更低的具有更好開發(fā)前景的博萊霉素族新抗生素化合物。本發(fā)明的另一目的是提供一種博萊霉素族抗腫瘤抗生素化合物在藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明的再一目的是提供一種博萊霉素族抗腫瘤抗生素化合物及其在藥學(xué)上可接受的鹽的微生物發(fā)酵、分離、提取方法。本發(fā)明的再一目的是提供一組博萊霉素族抗腫瘤抗生素化合物及其在藥學(xué)上可接受的鹽在抗腫瘤藥物上的用途。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供具有結(jié)構(gòu)式(I)的博萊霉素族抗腫瘤抗生素NC0604及其所形成的在藥學(xué)上可接受的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(I)其中，R為-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-CH2-CH2-CONH2。所述的藥學(xué)上可接受的鹽為鹽酸鹽、硫酸鹽、其他無(wú)機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽。本發(fā)明博萊霉素族抗腫瘤抗生素化合物NC0604分子量為1510，分子式為C6。H94N2。022S2，其生物學(xué)性質(zhì)和理化性質(zhì)如下1.顏色無(wú)定形白色粉末。2.熔點(diǎn)無(wú)固定熔點(diǎn)，隨溫度升高，顏色加深。3.溶解性易溶于水、甲醇，微溶于乙醇，不溶于丙酮、氯仿等低極性有機(jī)溶劑。4.顏色反應(yīng)胍基反應(yīng)陰性，茚三酮反應(yīng)不典型；與012+螯合形成藍(lán)色的螯合物。5.紫外光譜含銅品水溶液的紫外光譜在243~245、292~295nm處有兩個(gè)最大吸收峰，并且兩峰的比值為1.23,脫銅后243245nm處的吸收峰變?yōu)榧绶?，是典型的博萊霉素族的紫外吸收光譜。脫銅品及含銅品的紫外光譜分別見圖l和圖2。6.紅外光譜其紅外光譜在3200~3400cm-1(OH/NH)，1720cm-1(C=0),1650和1550cm"(CONH)以及1050cm"(OH)有特征吸收峰，表明其分子中具有糖肽類結(jié)構(gòu)。見圖3。7.質(zhì)譜圖4是NC0604的MALDI-TOF質(zhì)譜圖，顯示其[M+Hf峰為m/zl511。圖5是MS-MS高分辯質(zhì)譜圖(a)及給出的元素組成報(bào)告(b)，提供NC0604的分子式為C6QH95N2Q022S2。8.核磁共振譜圖6是NC0604的^-NMR譜圖，在5H7~9ppm有四個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)，分別歸屬為博萊霉素分子主核中兩個(gè)噻唑環(huán)和咪唑環(huán)的四個(gè)質(zhì)子，它們是博萊霉素族化合物具有鑒別意義的特征。圖7是其13C-NMR譜圖，根據(jù)已報(bào)道的博萊霉素族化合物的13C-NMR，對(duì)照已知化學(xué)位移數(shù)據(jù)及^^HCOSY(圖8)，HSQC(圖9)和HMBC(圖10),對(duì)NC0604的核磁共振譜進(jìn)行了研究并對(duì)13C信號(hào)進(jìn)行了歸屬，見表l，最終確證了其結(jié)構(gòu)。G表1NC060413C-NMR譜各峰歸屬AssignmentNC0604Assign-meritNC0604ICO175.933G1100.273CH69.848273.092a-CH61.943370.6%CH321.718471.906IIS-CO179.002569.848CO170.520663.0822168.196MCO160.7404167.4231101.0016154.95877.1365115.075576.351a-CH62.572271.143P-CH243.038467.553CH313.655663.730mCO180,321R(CO)177.522CH77.136d49.763Y-CH50.714g49.714a-CH45.444h46.148Y-cn317.543c48.0336<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>9.抗菌活性:如表2所示。可以看出NC0604具有廣譜抗菌作用。表2NC0604抗菌活性檢定菌MIC(嗎/ml)金葡菌ATCC292132金葡菌1532金葡菌05-3(MRSA)64表葡菌ATCC1222816表葡菌04-5(MRSE)>128糞腸球菌ATCC29212〉128糞腸球菌77564大腸埃希菌ATCC259220.5大腸埃希菌261銅綠假單胞菌ATCC27853>128銅綠假單胞菌17>128肺炎克雷白桿菌ATCC7006032肺炎克雷白桿菌140.25陰溝腸桿菌45031.1產(chǎn)氣腸桿菌451021醋酸鈣不動(dòng)桿菌25001>128普通變形桿菌490271宋內(nèi)志賀氏菌515921痢疾志賀氏菌0.25福氏志賀氏菌0.25鼠傷寒桿菌0.25傷寒桿菌H9010.25枯草桿菌6633_0.0310.抗腫瘤活性MTT法和克隆形成率法檢測(cè)了NC0604和Bleomycin對(duì)不同類型腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果表明，NC0604對(duì)KB、HepG2、MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞的抑制作用要敏感得多。這幾種細(xì)胞在兩種藥物作用下的生存活力曲線如圖lla-h。11.肺毒性羥脯氨酸(HYP)含量的變化是反映肺毒性的一個(gè)指標(biāo)，羥脯氨酸含量升高，說明肺毒性增強(qiáng)。在對(duì)昆明白小鼠分別連續(xù)腹腔注射Bleomycin和NC0604十六天，停藥二十八天后處死，檢測(cè)肺組織HYP含量如表3。NC0604和Bleomycin給藥組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，p<0.01，差異非常顯著。表3藥物作用下鼠肺組織HYP含量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>采用輪枝鏈霉菌屬的微生物可獲得本發(fā)明所述NC0604化合物，優(yōu)選的是輪枝鏈霉菌平陽(yáng)變種(S&e/Jtomycesv""c/〃wsvar.乃'"gV朋ge附^".sp),可先釆用適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)輪技鏈霉菌平陽(yáng)變種(5Vreptowyc&sveWc/〃wsvar.尸/wgy朋ge/xs7'51w.sp);然后從發(fā)酵液中分離含有本發(fā)明的粗提物，再?gòu)拇痔嵛镏蟹蛛x純化得到NC0604。本發(fā)明所述NC0604的制備方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)、分離、提取和精制，發(fā)酵培養(yǎng)所用的菌株為輪技鏈霉菌平陽(yáng)變種(5^印tomFMve/Y/c/〃Mvar.尸/"gy""gms7》w.sp)。用于培養(yǎng)所述微生物的培養(yǎng)基中，采用可被其利用的營(yíng)養(yǎng)源即碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)鹽和能被其利用的痕量營(yíng)養(yǎng)物，這些成分可預(yù)先一次性地加入培養(yǎng)基中，或者間歇或者連續(xù)地加入培養(yǎng)基中。對(duì)本發(fā)明所用的較好的微生物來(lái)說，可釆用如下培養(yǎng)基(按重量計(jì))葡萄糖0.4~0.6%;豆餅粉3~4%;玉米漿0.4-0.6%;NaC14-5%;玉米粉1~3%;淀粉2.0~3.0%;KH2P040.01~0.02%;ZnS040.04~0.06%;CuS040.08~0.12%;玉米油0.3~0.5%,其余為水，調(diào)pH值為6.0-6.5。培養(yǎng)的方式可釆用靜態(tài)培養(yǎng)、搖床培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、浸沒培養(yǎng)或其它方式，但對(duì)大量生產(chǎn)來(lái)說，優(yōu)選為浸沒培養(yǎng)。培養(yǎng)條件(時(shí)間、溫度、pH等)隨菌種不同而變，也隨培養(yǎng)基成分的變化有所不同，本領(lǐng)域技術(shù)人員按照培養(yǎng)工藝能夠根據(jù)具體情況而選擇。在發(fā)酵產(chǎn)生NC0604的過程中，可加入也可不加入NC0604的前體物質(zhì)或者通過微生物代謝能夠產(chǎn)生NC0604側(cè)鏈(R基團(tuán))的物質(zhì)。當(dāng)NC0604在培養(yǎng)基中積累達(dá)到最大濃度時(shí)終止培養(yǎng)，從發(fā)酵液中分離含有化合物的粗品，可釆用發(fā)酵產(chǎn)物的一般提取分離方法進(jìn)行。例如，可使用吸附、離子交換、冷干等方法，亦可在每一分離步驟中將二種或以上的方法結(jié)合使用。更詳細(xì)地說，按照常規(guī)方法，首先進(jìn)行過濾或離心，分離出固形的菌絲和培養(yǎng)濾液，本發(fā)明的化合物9主要存在于培養(yǎng)濾液中，將培養(yǎng)濾液用大孔樹脂進(jìn)行層析、濃縮，收集活性成分，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，減壓冷凍干燥，即得到NC0604物質(zhì)的粗品。為了從粗品中進(jìn)一步精制，可進(jìn)一步釆用大孔吸附樹脂吸附層析、離子交換、葡聚糖凝膠層析等。如果有必要進(jìn)一步精制時(shí)，可重復(fù)采用上述方法以制得高純度的NC0604。NC0604可以游離的形式得到分離，也可以藥學(xué)上可接受的鹽的形式(如鹽酸鹽、硫酸鹽、其它無(wú)機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽，尤其是鹽酸鹽的形式)得到分離。如果需要，可以用本領(lǐng)域常規(guī)方法將NC0604的鹽的形式轉(zhuǎn)化成游離形式，或?qū)⒂坞x形式轉(zhuǎn)化成藥學(xué)上可接受的鹽如鹽酸鹽、硫酸鹽、其它無(wú)機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽中的一種。含銅品的脫銅方法可以是八羥基喹啉法、HzS法、Na2S法，二苯磺卡貝松法，EDTA法。對(duì)分離、提取及精制過程中NC0604物質(zhì)的確認(rèn)，可使用本物質(zhì)對(duì)其有抑制作用的微生物，如枯草桿菌(sac///ws的生物檢測(cè)法或凝膠法或高效液相法，二者或三者并用更好。本發(fā)明所述的化合物及其在藥學(xué)上可接受的鹽具有廣譜抗菌和較好的抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物。采用本發(fā)明的微生物發(fā)酵方法而精制得到的NC0604物質(zhì)，用作醫(yī)藥組成物時(shí)的給藥形態(tài)，可為片劑、膠囊、注射劑，亦可根據(jù)其活性的進(jìn)一步研究與各種適于藥用的載體、添加劑、賦形劑、稀釋劑和溶劑等混合而開發(fā)成適用的制劑形式，如軟膏，霜?jiǎng)鷦?、微膠囊等制劑。這些制劑都可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知常用的制備方法而獲得。本發(fā)明所用的微生物發(fā)酵方法釆用本領(lǐng)域熟知的輪技鏈霉菌發(fā)酵條件，工藝簡(jiǎn)單。本發(fā)明所用輪技鏈霉菌平陽(yáng)變種(Streptomycesverticillusvar.10Pingyangensisn鄰)，為已知菌株，有關(guān)其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理特性、碳源利用及其產(chǎn)物的抗菌譜等已有文獻(xiàn)記載(趙儀英等，微生物學(xué)報(bào)，1979,19(4):361-364)。圖1為本發(fā)明所述化合物NC0604的紫外譜圖2為本發(fā)明所述化合物NC0604含銅品的紫外譜圖3為本發(fā)明所述化合物NC0604的紅外譜圖4為本發(fā)明所述化合物NC0604的MALDI-TOF質(zhì)譜圖5a為本發(fā)明所述化合物NC0604的MS-MS高分辯質(zhì)譜圖5b為本發(fā)明所述化合物NC0604的元素組成報(bào)告；圖6為本發(fā)明所述化合物NC0604溶于D20中的1H-NMR譜圖7為本發(fā)明所述化合物NC0604溶于D20中的13C-NMR譜圖8為本發(fā)明所述化合物NC0604溶于D20中1H-1HC0SY譜圖9為本發(fā)明所述化合物NC0604溶于D20中的HSQC譜圖10為本發(fā)明所述化合物NC0604溶于D20中的HMBC譜圖l].a為MTT法檢測(cè)Bleomycin,Nc0604對(duì)KB細(xì)胞增殖的影響；圖lib為MTT法檢測(cè)Bleomycin、Nc0604對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響；圖lie為MTT法檢測(cè)Bleomycin、Nc0604對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響；圖lid為MTT法檢測(cè)Bleomycin,Nc0604對(duì)MCF-7/DOX細(xì)胞增殖的影響；圖l]e為ColonyFormation法檢測(cè)Bleomycin、Nc0604對(duì)KB細(xì)胞增殖的影響；圖llf為ColonyFormation法檢測(cè)Bleomycin,Nc0604對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響；ii圖llg為ColonyFormation法檢測(cè)Bleomycin、Nc0604對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響；圖llh為ColonyFormation法檢觀ijBleomycin、Nc0604對(duì)MCF-7/DOX細(xì)胞增殖的影響。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l發(fā)酵由葡萄糖1.0%;蛋白胨0,5%;淀粉1.0%;NaCl0.5%;瓊脂2.0%(pH7.2-7.5)為斜面培養(yǎng)基，12(TC下滅菌30分鐘，制成斜面，于37t:恒溫3天。至表面水分稍干，無(wú)雜菌生長(zhǎng)時(shí)，接種到輪技鏈霉菌平陽(yáng)變種菌種孢子(Streptomycesverticillusvar.Pingyangensisn.sp)，于28。C培養(yǎng)8天，外觀為白色，氣生菌絲豐滿呈絨毛狀，無(wú)染菌時(shí)即可收取使用。在多個(gè)500ml玻璃瓶中分別裝入100ml培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分淀粉2.5%，葡萄糖0.5%，豆餅粉3.5%,KH2P040.1%，ZnS040.05%，CuSO40.01%，pH自然)。加棉塞，于120'C下滅菌30分鐘，由斜面挖塊接種。28。C在旋轉(zhuǎn)搖床旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48小時(shí)后，作為種子。然后將與種子培養(yǎng)基相同成分的發(fā)酵培養(yǎng)基(pH自然)，在500ml的三角瓶中分裝100ml,滅菌后加入2%上述培養(yǎng)的種子，29。C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)7-8天后收獲發(fā)酵液。實(shí)施例2提取純化將實(shí)施例1的發(fā)酵培養(yǎng)液(25升)用草酸溶液調(diào)pH2-3，過濾，濾液通過122(H+)陽(yáng)離子交換樹脂(1升)吸附，后用0.3mol/LHCl(4升)洗脫，活性部分調(diào)pH至7.0,并加適量CuS04溶液使其充分螯合Ci^+，然后用大孔吸附樹脂進(jìn)行脫鹽，用含0.01MHC1的20%丙酮溶液洗脫，收集洗脫液并除去丙酮后進(jìn)行CM-SephadexC-25(NH4+)柱層析，用0.11M的NH4C1梯度洗脫，分離得到NC0604含銅品洗脫液，再經(jīng)大孔吸附樹脂脫鹽，脫鹽后的洗脫液經(jīng)真空濃縮及冷凍干燥即可得到藍(lán)色的NC0604含銅純品(313mg)。將含銅品在酸性甲醇(pH2)中用二苯磺卡貝松進(jìn)行脫銅處理，用丙酮沉淀，將沉淀溶于水后再進(jìn)行真空濃縮及冷凍干燥即得到NC0604鹽酸鹽純品(266mg)。實(shí)施例3提取純化將實(shí)施例1的發(fā)酵培養(yǎng)液(25升)用草酸溶液調(diào)pH23,過濾，濾液通過151(H+)離子交換樹脂(l升)吸附，水洗后用0.3mol/LHC1(4升)洗脫，活性部分調(diào)pH至6.5并加適量CuS04溶液使其充分螯合Cu2、然后用大孔吸附樹脂4006進(jìn)行脫鹽，用含0.01MHC1的10%丙酮溶液洗脫，收集洗脫液，除去丙酮后用氨水調(diào)pH6.5，進(jìn)行CM-SephadexC-25(NH4+)柱層析，水沖洗柱子后，用0.1~1M的NH4C1梯度洗脫，按峰位收集，合并。分離得到NC0604含銅品洗脫液，再經(jīng)大孔吸附樹脂脫鹽，脫鹽后的洗脫液經(jīng)真空濃縮及冷凍干燥即可得到藍(lán)色的NC0604含銅純品(336mg)。將含銅品用含5%NaCl和5%EDTA二鈉鹽的水溶液洗脫，除去產(chǎn)物螯合的銅，得NC0604鹽酸鹽純品(290mg)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。1權(quán)利要求1、具有結(jié)構(gòu)式(I)的糖肽類抗生素化合物及其所形成的在藥學(xué)上可接受的鹽其中，R為NH(CH2)3NH(CH2)4NHCH2CH2CONH2。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物及其所形成的在藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，所述的藥學(xué)上可接受的鹽為鹽酸鹽、硫酸鹽、其它無(wú)機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽。3、一種制備權(quán)利要求1或2所述化合物及其所形成的在藥學(xué)上可接受的鹽的方法，其特征在于，包括發(fā)酵培養(yǎng)、分離、提取和精制。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述化合物的制備及其所形成的在藥學(xué)上可接受的鹽方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)釆用輪技鏈霉菌的微生物。5、根據(jù)權(quán)利要求3或4所述化合物的制備及其所形成的在藥學(xué)上可接受的鹽方法，其特征在于，所述輪技鏈霉菌為輪技鏈霉菌平陽(yáng)變種(5^一函yc&s1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6、權(quán)利要求1或2所述的化合物及其所形成的在藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種具有結(jié)構(gòu)式(I)的新化合物及其所形成的在藥學(xué)上可接受的鹽，其采用發(fā)酵培養(yǎng)其產(chǎn)生菌而獲得，本發(fā)明所述的化合物為一種博萊霉素族的新化合物，具有比臨床在用的博萊霉素更好的抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物。文檔編號(hào)C07K9/00GK101628931SQ20081011664公開日2010年1月20日申請(qǐng)日期2008年7月14日優(yōu)先權(quán)日2008年7月14日發(fā)明者石蓮英,解云英,許鴻章,陳彩霞,陳汝賢,敏魯申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所