專利名稱：重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(igf-1)融合蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到生物技術(shù)中的生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是DNA重組技術(shù)，即構(gòu)建 硫氧還蛋白和人IGF-1融合蛋白，并通過(guò)基因工程大腸桿菌發(fā)酵制備它的方法。
背景技術(shù)：
1976年Rillderktercht從人血清中分離得到胰島素樣生長(zhǎng)因子 -l(insulin-like growth factor-1， IGF-1)，開(kāi)始IGF-1研究的新紀(jì)元。IGF-I 具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)物質(zhì)代等作用，近年來(lái)倍受重視，在治療胰島素抗性 糖尿病、神經(jīng)損傷、矮小癥、骨質(zhì)疏松、分解代謝疾病等方面，具有廣闊的應(yīng) 用前景。目前，國(guó)外IGF-1治療糖尿病、肌肉萎縮側(cè)索硬化癥已產(chǎn)業(yè)化，但我 國(guó)尚未有產(chǎn)品上市(國(guó)外有相同名稱的產(chǎn)品，但生產(chǎn)方法沒(méi)有公開(kāi))。目前采用 基因工程方法是生產(chǎn)IGF-I的唯一有效方法。
國(guó)內(nèi)報(bào)道hlGF-1在大腸桿菌中的表達(dá)研究不少，如第一軍醫(yī)大學(xué)的吳嵐曉 選用含有噬菌體啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體pRSET B質(zhì)粒。質(zhì)粒在大腸桿菌中的拷 貝數(shù)高，表達(dá)強(qiáng)。他們選擇ATG前的Nde 1和HindIII酶切位點(diǎn)克隆外源基因 時(shí)可將前導(dǎo)肽編碼序列切除，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)， 實(shí)現(xiàn)了目的基因的非融合表達(dá)。但表達(dá)產(chǎn)物的^位氨基酸為甲硫氨酸，而天然 的hIGF-l不含甲硫氨酸。其它作者的表達(dá)產(chǎn)物同樣含甲硫氨酸。含甲硫氨酸的 產(chǎn)品必須去除甲硫氨酸，這樣將大大增加產(chǎn)品的成本。而且有文獻(xiàn)報(bào)道成熟型 或N端短融合(僅幾個(gè)氨基酸)型的表達(dá)產(chǎn)物是極不穩(wěn)定的，很難在一般大腸桿 菌中穩(wěn)定高表達(dá)。
pET系列載體是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)。pET系列載體是利用大 腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。T7表達(dá)系統(tǒng)的T7 RNA聚合酶選擇性的激 活T7噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。它是一種高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速 度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右，大腸桿菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)T7噬菌體轉(zhuǎn)錄體系。pET32是pET系列載體中的融合蛋白表達(dá)載體。它含有一 個(gè)高度可溶的多肽一硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)，具有催化二硫鍵的形成 作用。此外，該載體含有的6X組氨酸片段(6xHis tag)對(duì)目的蛋白的純化非 常方便，因?yàn)?X組氨酸片段可以和Ni-NTA瓊脂糖結(jié)合，將樣品直接上柱，洗 脫，就可以純化出帶有His Tag的融合蛋白。。
融合蛋白可用蛋白水解酶或化學(xué)試劑進(jìn)行選擇性切割獲得目的小肽。由于 酶制劑價(jià)格昂貴、成本高，該法不適合大規(guī)模生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是要提供一種產(chǎn)物穩(wěn)定，分離方 法簡(jiǎn)單，成本低，適用于大規(guī)模的生產(chǎn)的硫氧還蛋白和人IGF-1融合蛋白，并 通過(guò)基因工程大腸桿菌發(fā)酵制備它的方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用技術(shù)方案是 一種重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子
-1(IGF-l)融合蛋白的制備方法，其特征在于采用基因工程菌發(fā)酵法生產(chǎn)a. 重組人IGF-1融合蛋白相關(guān)基因設(shè)計(jì)和合成；b.構(gòu)建重組人IGF-1融合蛋白 表達(dá)載體；C.用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主構(gòu)建基因工程菌；d.用所述基因工程 菌發(fā)酵重組人IGF-1融合蛋白。
所述的相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是組成融合蛋白的兩個(gè)蛋白分別是硫氧還蛋白 和IGF-1，兩個(gè)蛋白之間引入了一個(gè)二肽鍵Asn-Gly;硫氧還蛋白可以促進(jìn)IGF-1 的二硫鍵形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加；二肽鍵作 為羥胺的特異性裂解部分可以在羥胺的作用下斷裂，釋放出IGF-1，此外，含6 組氨酸系列，從而大大方便純化工藝。
所述的基因發(fā)酵重組人IGF-1融合蛋白的工藝流程如下挑選單菌落基因 工程菌，進(jìn)行放大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌液進(jìn)行細(xì)胞破碎，分離出包涵體，
破壞包涵體，釋放出融合蛋白，過(guò)Nr-金屬螯合柱獲得融合蛋白，融合蛋白在
羥胺溶液中裂解，釋放重組人IGF-1，分離純化IGF-1，再脫鹽，冷凍干燥樣品，質(zhì)檢得最終樣品。
所述的載體為商品化的pET32a ( + )，及其替代品。 所述的宿主細(xì)胞為DH5ci及其替代品。
所述的融合蛋白中是采用優(yōu)化的裂解條件，羥胺濃度為2 — 3M，反應(yīng)的溫度 為40—45。C，采用LiOH控制pH8. 5-9. 5,反應(yīng)時(shí)間為5 —IO小時(shí)。
1. 根據(jù)人IGF-1的初級(jí)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了一個(gè)串聯(lián)表達(dá)的融合蛋白，N端為硫氧 還蛋白，C端為IGF-1，中間為自行設(shè)計(jì)的二肽用于羥胺裂解；
2. 根據(jù)人天然IGF-1的DNA序列，設(shè)計(jì)了二條PCR引物，分別加上EcoRI和 HindIII識(shí)別序列，二肽序列和保護(hù)性堿基，由EcoRI和HindIII位點(diǎn)定 向克隆到pET32a ( + )表達(dá)型質(zhì)粒，得到表達(dá)載體；
3. 陽(yáng)性克隆發(fā)酵條件優(yōu)化獲得高表達(dá)的產(chǎn)物;
4. 采用N:T—金屬螯合柱層析方法，獲得融合蛋白；
5. 融合蛋白經(jīng)過(guò)羥胺裂解釋放出IGF-1單體；
6. 采用Ni"—金屬螯合柱層析去除未裂解的融合蛋白和裂解的前導(dǎo)肽，獲得 IGF-1單體。
本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明根據(jù)天然工GF-I的第一個(gè)氨基酸為甘氨酸 (Gly, G)的特點(diǎn)，在天然的IGF-I前面加上前導(dǎo)肽，而前導(dǎo)肽和IGF-1之間設(shè) 計(jì)一個(gè)羥胺的特異裂解部位(Asn-Gly肽鍵)，減低純化成本。前導(dǎo)肽為硫氧還 蛋白，可以促進(jìn)二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能 增加。此外，前導(dǎo)肽含6x組氨酸系列，因此，不但可以高效表達(dá)，而且可以方 便采用M-金屬親和層析柱將前導(dǎo)肽去處，獲得天然的完整IGF-I。
本發(fā)明采用串聯(lián)表達(dá)的融合蛋白，N端為硫氧還蛋白，C端為IGF-1，使表 達(dá)產(chǎn)物更加穩(wěn)定，分離方法簡(jiǎn)單，價(jià)廉。因此，本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用前景。
圖1 pET32a ( + )表達(dá)載體示意圖。
圖2 pET32a ( + )表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)和表達(dá)序列。圖中rx Tag代表硫氧化還原蛋白標(biāo)簽，串.109個(gè)氨基酸組成；His Tag 代表6個(gè)組氨酸標(biāo)簽。
圖3 PCR引物1。其中AAC GGT編碼Asn-Gly, GAA TTC為Ecorl酶切位占。
"、、o
圖4 PCR引物2。包含IGF-1的后面5個(gè)氨基酸系列，終止密碼(TAG), Hindlll酶切位點(diǎn)(AAGCTT)。 圖5 pET32-IGF構(gòu)建圖。
圖6 PCR獲得的IGF-1 DNA在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜。 圖7融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果的SDS-PAGE ^譜。
圖中從左到右各泳道分別是IPTG誘導(dǎo)1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、
未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白菌和分子量標(biāo)記。
圖8包涵體總蛋白經(jīng)過(guò)Nr金屬螯合柱后得到的融合蛋白SDS-PAGE圖譜。 圖中從左到右各泳道分別是含400慮(洗脫液稀釋5倍)、400 mM、 10 mM、 20、 50、 lOOmM咪唑的磷酸緩沖液洗脫結(jié)果。 圖9融合蛋白裂解后的圖譜。
圖中從左到右各泳道分別是分子量標(biāo)記，未裂解蛋白，裂解蛋白。 圖10融合蛋白裂解后純化的目的蛋白IGF-1的MALDI-TOF-MS圖譜。
具體實(shí)施例方式
1.融合蛋白基因的克隆
1.1串聯(lián)表達(dá)融合蛋白的設(shè)計(jì)
天然的IGF-1其N(xiāo)端第一個(gè)氨基酸為Gly，不是甲硫氨酸。也就是說(shuō)在人
體細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成的IGF-1前體必須去除第一個(gè)甲硫氨酸后才被分泌到細(xì)胞外。
因此，如果用含基因起始密碼ATG的IGF-1基因單獨(dú)表達(dá)的話， 一方面分離純
化不方便，另一方面去除甲硫氨酸也非常麻煩。^yi中根據(jù)羥胺能特異性裂解
Asn-Gly肽鍵的特點(diǎn)，以及天然IGF-1的第一個(gè)氨基酸正好為Asn，而IGF-1整 個(gè)蛋白鏈上沒(méi)有Asn-Gly 二肽序列的特點(diǎn)，在設(shè)計(jì)時(shí)在前導(dǎo)肽和IGF-1之間設(shè)計(jì)一個(gè)Asn-Gly序列，促進(jìn)表達(dá)和方便純化。 1.2融合蛋白的基因引物設(shè)計(jì)
根據(jù)pET32a ( + )的多克隆位點(diǎn)序列，在5'端和3'端的兩條引物上分別 加上EcoRI和Hindin限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。 1.3 IGF-l基因的合成
采用PCR法擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增程序如下預(yù)變性95'C， 5min;變性95。C， lrain;復(fù)性64"， lmin;延伸72。C， lmin，共35個(gè)循環(huán)，最后一次反應(yīng)延伸 時(shí)間為10 min。
取適量PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5—2y。瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后拍照，其 它PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳染色后采用膠回收試劑盒提取膠中PCR產(chǎn)物。 1.4目的基因插入表達(dá)載體pET32a ( + )
目的基因(PCR產(chǎn)物)用EcoRI和mndIII雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖電泳，回收 DNA片段。pET32a ( + )質(zhì)粒同樣用這兩個(gè)酶進(jìn)行酶切后純化。將目的DNA片段 和酶切后的載體混合進(jìn)行連接。
連接反應(yīng)后將反應(yīng)液直接加到感受態(tài)的DH5a大腸桿菌，然后接種到含氨節(jié) 青霉素的瓊脂糖平板上進(jìn)行抗性篩選。挑取6個(gè)菌落，小量擴(kuò)增后制備質(zhì)粒， 并以該質(zhì)粒為模板，采用上述PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增r擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5 — 2%瓊脂糖 凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后估計(jì)產(chǎn)物的堿基數(shù)目。堿基數(shù)目在230bp左右者 為陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒直接進(jìn)行咖A序列測(cè)序。測(cè)序正確的菌種保存 在甘油管中(-20°C)。 2.基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)
2. 1.細(xì)菌培養(yǎng)和誘導(dǎo)取2ul甘油管中菌液加入到3ml含氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng) 液中，37°C， 250轉(zhuǎn)/分，搖床培養(yǎng)過(guò)夜。次日取適量菌液，加入到100倍含氨 芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)2h，加入IPTG誘導(dǎo)5h。
2.2細(xì)菌的破解收集菌液，4000rpm離心10min'，用PBS重懸，超聲180次以 裂解細(xì)菌。裂解液以12000rpm離心10min，去上清，用1 XPBS洗滌沉淀3次，12000rpm離心lmin，以緩沖液B重懸，室溫孵育2h (緩沖液B的組成100Mm NaH2P04、麗m Tris-Cl、 8M尿素、pH8. 0)。然后以12000rpm離心30min，小 心移取上清(細(xì)菌裂解液)。
3. 融合蛋白的分離
將適量Ni-NTA樹(shù)脂(每ml樹(shù)脂上樣的融合蛋白小于15mg)置于層析柱內(nèi)， 打開(kāi)柱下端帽子讓液體自然流干，加磷酸緩沖液平衡后將細(xì)菌裂解液加入， 3(kin后用3(M分別含0、 i0、 20、 50、 lOOmM咪唑的磷酸緩沖液進(jìn)行階段洗脫， 流速為2ml/min，洗脫液不搜集。最后用含400mM咪唑的緩沖液進(jìn)行洗脫，流速 為lnil/min。收集洗脫液，冷凍干燥，一2(TC保存。
4. 羥胺裂解反應(yīng)
經(jīng)純化、冷凍千燥的融合蛋白加入羥胺裂解液(含6M胍，2M羥胺，用5M LiOH 溶液調(diào)節(jié)到pH9)， 45。C水浴保溫4一6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液透析20小時(shí) 后再次上NTA-Ni+瓊脂糖層析柱，用不含咪唑的磷酸緩沖液洗脫，收集洗脫液， 冷凍干燥，一20'C保存。
5. 基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)法鑒定目的蛋白 基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)(MALDI-TOF—MS)為美國(guó)賽弗吉
公司(CIPHERGEN)產(chǎn)品。2次基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)量法 (MALDI-TOF MS)分析中裂解產(chǎn)物的分子量為分別為7640.0D和7640.8D。 MALDI-TOF-MS儀器的最大測(cè)量誤差為0. 5%，由于IGF-1的理論分子量為7649D， 因此在誤差范圍內(nèi)理論值為7610.7 7687.2。被測(cè)蛋白的分子量在此范圍內(nèi)可 認(rèn)為是IGF-1。SEQUENCE LISTING
〈110〉福建醫(yī)科大學(xué)
〈120〉重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)融合蛋白的制備方法 〈160> 2
〈170〉 Patentln version 3.1 〈210〉 1
〈211〉 210
〈212〉腿
〈213〉人 <400> 1
GGTCCG GMACCCTGTGCGGTGCTGMCTGGTTGACGCT CTG CAG TTC GTTTGCGGTGAC60
CGTGGT TTCTACTTCAACMACCGACCGGTTACGGTTCT TCT TCT CGT CGTGCTCCGCAG120
ACCGGT ATCGTTGACGAATGCTGCTTCCGTTCTTGCGAC CTG CGT CGT CTGGMATGTAC180
TGCGCT CCGCTGAAACCGGCT嵐TCTGCT210
〈210〉
〈211〉
〈212〉
〈213〉 <400>
Gly Pro 1
Arg Gly Thr Gly Cys Ala
2
70
PRT
人 2
Glu Thr Phe Tyr lie Val Pro Leu
Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu
5 10
Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr G土y Ser Ser
25 30
Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu
45 50
Lys Pro Ala Lys Ser Ala
Gin Phe Val Cys Gly Asp 15 20 Ser Arg Arg Ala Pro Gin
35 40 Arg Arg Leu Glu Met Tyr
55 60
65 70
權(quán)利要求
1、一種重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)融合蛋白的制備方法，其特征在于采用基因菌發(fā)酵法生產(chǎn)a.重組人IGF-1-1融合蛋白基因設(shè)計(jì)和合成；b.構(gòu)建重組人IGF-1-1融合蛋白表達(dá)載體；c.用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主構(gòu)建基因工程菌；d.用基因工程菌發(fā)酵重組人IGF-1融合蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子-l(IGF-l)融合蛋 白的制備方法，其特征在于所述的基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是組成融合蛋白的兩個(gè)蛋 白分別是硫氧還蛋白和IGF-1，兩個(gè)蛋白之間引入了一個(gè)二肽鍵Asn-Gly;含6組氨酸系列的純化工藝。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因發(fā)酵重組人IGF-1-1融合蛋白的工藝流程如 下挑選單菌落基因工程菌，進(jìn)行放大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌液進(jìn)行細(xì)胞破 碎，分離出包涵體，破壞包涵體，釋放出融合蛋白，過(guò)Nr-金屬金屬螯合柱獲 得融合蛋白，融合蛋白在羥胺溶液中裂解，釋放重組人IGF-1，分離純化IGF-1， 再脫鹽，冷凍干燥樣品，質(zhì)檢得最終樣品。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子-l(IGF-l)融合蛋 白的制備方法，其特征在于所述的載體為商品化的pET32a ( + )，及其替代品。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子-l(IGF-l)融合蛋 白的制備方法，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為DH5a及其替代品。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子-l(IGF-l)融合蛋 白的制備方法，其特征在于所述的融合蛋白中是采用優(yōu)化的裂解條件，羥胺 濃度為2 — 3M，反應(yīng)的溫度為40—45。C，采用LiOH控制pH8. 5-9. 5，反應(yīng)時(shí)間 為5 — 10小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)融合蛋白的制備方法，屬生物技術(shù)中的生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明采用基因工程菌發(fā)酵法生產(chǎn)a.重組人IGF-1融合蛋白相關(guān)基因設(shè)計(jì)和合成；b.構(gòu)建重組人IGF-1融合蛋白表達(dá)載體；c.用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主構(gòu)建基因工程菌；d.用所述基因工程菌發(fā)酵重組人IGF-1融合蛋白。由于本發(fā)明根據(jù)天然IGF-I的第一個(gè)氨基酸為甘氨酸(Gly，G)的特點(diǎn)，在天然的IGF-I前面加上前導(dǎo)肽，而前導(dǎo)肽和IGF-I之間設(shè)計(jì)一個(gè)羥胺的特異裂解部位(Asn-Gly肽鍵)，使表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定，減低純化成本。本發(fā)明采用串聯(lián)表達(dá)的融合蛋白，N端為硫氧還蛋白，C端為IGF-1，使表達(dá)產(chǎn)物更加穩(wěn)定，分離方法簡(jiǎn)單，價(jià)廉。因此，本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K14/65GK101429519SQ20081007237
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月16日
發(fā)明者俞昌喜, 廖聯(lián)明, 漸 楊, 盈 許 申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)