聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的制作方法

專利名稱：：聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)聚乙二醇化修飾領(lǐng)域，更具體地說，涉及了一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)的制備和鑒定。
背景技術(shù)：
：天然人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)成熟蛋白具有174個氨基酸，分子量為19Kda。重組表達(dá)的人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)由于增加了一個起始密碼子(ATG,翻譯后為甲硫氨酸)，因此為175個氨基酸(如序列表所示)。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子可誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的增值和分化，導(dǎo)致血液中的中性粒細(xì)胞數(shù)增加；另外還能刺激成熟中性粒細(xì)胞數(shù)從骨髓中釋出，并激活中性粒細(xì)胞的功能。因此自1991年起rhG-CSF已經(jīng)廣泛用于治療因放療、化療等引起的中性粒細(xì)胞減少癥，可以顯著改善中性粒細(xì)胞減少癥的嚴(yán)重性和持續(xù)時間。但是和許多分子量小于30kDa的蛋白質(zhì)藥物一樣，rhG-CSF在其代謝過程中易由腎小球濾過，在通過腎小管時又被其中的蛋白酵部分降解并從尿中排出，因而半衰期短。rhG-CSF血清半衰期只有2-4小時，為維持一定的療效需要每天注射，持續(xù)注射5-7天，不僅增加了病人的痛苦而且易引發(fā)一系列副反應(yīng)(WelteK等，ProcNatAcadSci，82:1526-1530(1985);FramptonJE等，Drugs,48(5):731-60(1994))，這不僅增加了病人的痛苦，也增加了醫(yī)療費用。聚乙二醇(PEG)化學(xué)修飾是延長蛋白類藥物半衰期的一個有效途徑。聚乙二醇(簡稱PEG)是一種惰性、兩親、不帶電荷的柔性長鏈高分子聚合物，化學(xué)式為HO(CH2CH20)nCH2CH200H，n為聚合單元的個數(shù)。PEG分子量隨n的增加可由lkDa增至50kDa，有線性和分支兩種構(gòu)型，已經(jīng)作為多種藥物的安全載體用于臨床應(yīng)用。PEG通過共價鍵與蛋白質(zhì)連接，可與蛋白質(zhì)分子中的氨基(位于N末端的氨基或賴氨酸殘基)或者巰基(位于半胱氨酸)反應(yīng)對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行修飾。該修飾可以有效地改變蛋白類藥物在體內(nèi)的分布和藥物學(xué)特性，延長蛋白質(zhì)藥物的血藥濃度，同時還可降低免疫原性。目前已經(jīng)有多種聚乙二醇藥物應(yīng)用于臨床，如聚乙二醇單修飾重組人干擾素a2a(PEG-IFNa2a)(BailonP等，BioconjugateChem.，12:195-202(2001))、聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)(HarrisJM等，ClinPharmacokinet，40:539-551(2001))等。聚乙二醇(PEG)分子必須通過一個活化基團(tuán)活化，才能與蛋白質(zhì)表面的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)，以共價鍵形式連接到蛋白質(zhì)分子上。KinstlerOlafB等(美國專利US5985265,1999年公開)研究重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)的PEG修飾時就發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用6KD的mPEG-SCM(N-hydroxysuccinimidylesterofcarboxymethylmethoxypolyethyleneglycol)修飾時，最終制備獲得的單一修飾的PEG-rhG-CSF是由N端，Lys35，Lys41分別結(jié)合有一個PEG分子組成的混合物。進(jìn)一步分析這三種不同的PEG-rhG-CSF分子，發(fā)現(xiàn)N端修飾的PEG-rhG-CSF活性最高，保留了原有活性的68%，Lys35和Lys41修飾產(chǎn)物活性分別為56《和21M，而且Lys35修飾產(chǎn)物是不穩(wěn)定的，在體外很容易被降解。從中我們可以發(fā)現(xiàn)，用現(xiàn)有方法對rhG-CSF進(jìn)行PEG修飾以后，rhG-CSF的生物學(xué)活性都會下降，根據(jù)不同修飾位點和修飾數(shù)目，其體外活性可能下降幾倍到幾十倍。因此，如能制備出一種活性和穩(wěn)定性更高的PEG化rhG-CSF產(chǎn)物，以降低rhG-CSF的臨床用藥頻率和減少其毒副作用，具有很重要的臨床和經(jīng)濟(jì)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種具有更高生物學(xué)活性和穩(wěn)定性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rnihG-CSF)。本發(fā)明的另一個目的是改進(jìn)現(xiàn)有PEG修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子技術(shù)，提供高活性的聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種包含上述聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的藥物制劑及其在制備治療因放療、化療等引起的中性茅立細(xì)胞減少癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)最終目的通過點突變技術(shù)，將重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)18位的半胱氨酸(cys)突變?yōu)榻z氨酸(ser)，再通過噬菌體展示技術(shù)表達(dá)N端突變的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(其中18位的半胱氨酸已突變?yōu)榻z氨酸)，然后利用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子受體篩選出具有高生物學(xué)活性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)。突變后的nnhG-CSF與帶有氨基反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇(PEG)反應(yīng)，經(jīng)分離純化，獲得了活性更高的聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)是一個由4個a-螺旋組成的結(jié)構(gòu)(Hill等，PNAS.，5167-5171(1993))，共有兩對半二硫鍵，其中37位和43位的半胱氨酸，65和75位的半胱氨酸分別組成二硫鍵，只剩下18位的半胱氨酸未成對；此外N端并不在G-CSF的結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，并且根據(jù)文獻(xiàn)報道(Schrader等，PNAS.，2458-2462(1986))，造血細(xì)胞因子具有N端結(jié)構(gòu)同源性。因此，通過定點突變技術(shù)先將18位的半胱氨酸突變成絲氨酸，可以增加蛋白復(fù)性收率和穩(wěn)定性。然后通過基因突變技術(shù)獲得N端突變的rmhG-CSF。為了得到高活性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)，需要利用噬菌體展示技術(shù)對突變后的rmhG-CSF進(jìn)行篩選。噬菌體展示技術(shù)是目前一種廣泛使用的高親和力和高活性蛋白質(zhì)篩選技術(shù)，該技術(shù)能夠在絲狀噬菌體表面上表達(dá)多種隨機(jī)的蛋白質(zhì)，再經(jīng)過與特定配基結(jié)合、洗脫和重復(fù)篩選，最后得到與受體或者配體有髙親和力蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，為了構(gòu)建具有高生物活性和穩(wěn)定性的rmhG-CSF，首先我們利用點突變技術(shù)將rhG-CSF18位的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，再用PCR法創(chuàng)建一編碼N端序列被隨機(jī)替代的rmhG-CSFcDNA文庫(具體方法見實例1)，然后通過噬菌體展示技術(shù)，用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子受體作為配體，通過多輪篩選后得到了21個活性基本保留的rmhG-CSF，其氨基酸序列見表1(其中克隆編號0為未突變的rhG-CSF)，其體外活性高于rhG-CSF(見表2)。生物學(xué)活性的測定可參照2005年版《中國藥典》第三部附錄58所示的方法。表121個高活性rmhG-CSF的N端氨基酸序列克隆編號N端17個氨基酸序列0MTPLGPASSLPQSF"K7MAPKRGTSSPFAELFLK13MT"ASPTGRAFSMLKL619MPKRTSTPFTEQLMRK26MFKPNDQEIHPSTWVYD31MYSSKARNDFSTWNIQE37MVGAGSHDNRSKRVA56MAPTYRASSPQSF匕LK63MRSKFQSVIWRAQEVD65MSFTKMPSTRRASSPTY70MAKYFNDQIKFSVRAS101MTPSQWSFIHEQFGATS112MAFKYSFGTYRTKRSYW140MLQALFAYRDNQKNEN151MTDAKTSKENAPSRKES169MAYTPRSTKSNGFDA170MFVASKTVRNQTDGTNP172MEAASTYWMDVEQDNQ173MPKSAYRVWIWYIHAE177MKVYSTAVSDTLPRDSK189MAMTAPSPYFRIPKGA195MEPKRRTTRTKDHYHTT表2G-CSF和rmhG-CSF的體外生物學(xué)活性比較SpecificbioactivityRelative克隆編號(X108IU/mg)bioactivity(%)00.8210071.28156131.17143191.25152261.16141311.31160371.16142561.53186631.09133651.27155701.371671011.301581121.121371401.341631511.051281691.351651701.401711721.391701731.211481771.071301891.161411951.11135篩選到的rmhG-CSF蛋白可以通過原核生物或真核生物宿主基因重組技術(shù)表達(dá)外源性DNA序列而得到，合適的原核生物宿主包括各種細(xì)菌(如Ecoli.);合適的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳動物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞)。依據(jù)所用的宿主的不同，rmhG-CSF表達(dá)產(chǎn)物可能會被哺乳動物或其它真核細(xì)胞中的碳水化合物所糖基化修飾。對于本發(fā)明所用的人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)，優(yōu)選的采用原核表達(dá)系統(tǒng)或酵母表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物，例如￡coW或甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)。通過原核生物或真核生物宿主基因重組技術(shù)表達(dá)外源性DNA序列而得到的rmhG-CSF，其中小部分為有活性的可溶表達(dá)的rmhG-CSF(可用于測活)，絕大部分為無活性的包涵體，需要通過合適的破菌、復(fù)性和分離純化方法，才能得到合格的rmhG-CSF。如中國專利96106418.8所示，原核表達(dá)rmhG-CSF通過中空纖維超濾透析方式復(fù)性，再經(jīng)過離子交換層析、疏水柱層析和分子篩層析順序組合，最終獲得的制品含有至少95%以上的rmhG-CSF。通過控制合適的反應(yīng)條件，帶有氨基反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇分子可與這些改構(gòu)的高活性的rmhG-CSF蛋白序列中存在的a-氨基或e-氨基發(fā)生定點修飾反應(yīng)，例如可與N末端甲硫氨酸殘基上的a-氨基或第35或第41位賴氨酸殘基上的e-氨基反應(yīng)。聚乙二醇分子詳細(xì)可參考StevenM(ModificationofCD4ImmunoadhesinwithMonomethoxypoly(ethyleneglycol)aldehydeviaReductiveAlkylation,Bioconjugate.Chem,1994，5:133-140)論文中第134頁表1中列舉的PEG種類以及姜忠義等(蛋白質(zhì)和肽類分子的聚乙二醇化化學(xué)，《有機(jī)化學(xué)》2003年第23巻12期1340-1347)論文中所描述的那些PEG衍生物，包括但不局限于PEG琥珀酰亞胺碳酸酯，PEG對硝基苯碳酸酯，PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯，PEG碳酰咪唑，PEG苯并三唑碳酸酯(BTC-PEG),PEG苯基琥珀酰亞胺碳酸酯，甲氧聚乙二醇羥琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidylcarbonate,mPEG-SC)，甲氧聚乙二醇醛如甲氧聚乙二醇丙醛(mPEG-propinaldehyde，mPEG-ALD)、甲氧聚乙二醇丁醛等，以及將兩個線性的BTC-PEG或mPEG-SC鏈連到賴氨酸的a-氨基和e-氨基形成的分支狀的PEG衍生物等。聚乙二醇氨基反應(yīng)試劑可以和rrahG-CSF的氨基基團(tuán)特異性的結(jié)合,分離純化獲得聚乙二醇定點單修飾的產(chǎn)物。這些活性聚乙二醇可以是分子量大于5kDa的任意大小的PEG，其形狀可以是單鏈或者分支狀，其中優(yōu)選分子量在5kDa到40kDa之間的線性或分枝PEGs,更優(yōu)選分子量為20kDa的單鏈聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD2,)。本發(fā)明還提供一種聚乙二醇(PEG)單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)的制備方法，其包括如下步驟(1)在含水介質(zhì)中，帶有氨基反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇分子與重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)中的氨基反應(yīng)；(2)任選地從反應(yīng)混合物中分離聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)的產(chǎn)物。較合適的修飾反應(yīng)條件是rmhG-CSF濃度為0.5-20毫克/毫升，優(yōu)選3-6毫克/毫升。蛋白質(zhì):PEG分子的比例在1:1-1:20之間，優(yōu)選1:3-l:5之間。pH條件為酸性、中性或堿性，優(yōu)選為酸性或堿性，更優(yōu)選為pH4.5-6.0或pH7.5-9.5。帶有氨基反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇分子可選用上述的那些PEG衍生物，優(yōu)選甲氧聚乙二醇羥琥珀酰酯(例如甲氧聚乙二醇羥琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succiru阻dy1carbonate,mPEG-SC)或甲氧聚乙二醇醛，例如甲氧聚乙二醇丙醛(mPEG-propinaldehyde，mPEG-ALD)或甲氧聚乙二醇丁酵等。在酸性條件下(優(yōu)選pH4.5-6.0),由于賴氨酸殘基上e-氨基和N-末端a-氨基的pKa差異，在反應(yīng)溶液中未質(zhì)子化的N-末端a-氨基的分子數(shù)相對要比賴氨酸殘基上e-氨基多，因而帶有未共用電子對的N-末端a-氨基更容易對上述優(yōu)選的聚乙二醇衍生物(例如聚乙二醇丙醛)的羰基發(fā)生親核進(jìn)攻，通過西佛堿的形成聚乙二醇丙醛可以偶聯(lián)到a-氨基上，在還原劑如氰基硼酸鈉的催化下形成穩(wěn)定的胺鍵(其反應(yīng)原理如下所示)因此，在足夠酸性的條件下我們可以得到比較均一的rmhG-CSF的N-末端a-氨基被聚乙二醇單修飾的產(chǎn)物。如果提高反應(yīng)的pH值(例如pH7.5-9.5)，則發(fā)生在非N端的(例如在lys35或lys41殘基e-氨基位點單修飾形成穩(wěn)定的胺鍵)聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的比例會比較大，可以通過合適的分離純化方法分離得到單修飾的產(chǎn)物。經(jīng)修飾反應(yīng)后獲得的為含有PEG-rmhG-CSF的混合物，其中含有PEG-rmhG-CSF、未反應(yīng)的活性PEG分子和rmhG-CSF等。需要通過合適的分離純化方法，例如通過離子交換層析和分子篩層析的組合來純化上述混合物體系，最終獲得的制品含有至少90%以上的PEG-mihG-CSF和至多10%的未發(fā)生聚乙二醇化的rmhG-CSF，優(yōu)選制品含有至少95%以上的PEG-rmhG-CSF和至多5%的未發(fā)生聚乙二醇化的rmhG-CSF，更優(yōu)選制品含有至少99%以上的PEG-rmhG-CSF和至多1%的未發(fā)生聚乙二醇化的rmhG-CSF。so=另外，在分離純化聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體中，發(fā)現(xiàn)聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體中(N端修飾)的活性不如某些聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體中(非N端修飾)，具體例子見實例2。因此，我們可以適當(dāng)提高反應(yīng)的pH條件，例如堿性，優(yōu)選pH7.5_9.5，以增加反應(yīng)產(chǎn)物中發(fā)生在非N端的(例如在lys35或lys41殘基e-氨基位點單修飾)聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的比例，然后通過分離純化得到這些聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體本發(fā)明所制備的PEG-rmhG-CSF，與以前的方法相比，由于采用了點突變技術(shù)、N端隨機(jī)突變技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)，得到了高活性和高穩(wěn)定性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)，再通過和聚乙二醇氨基反應(yīng)試劑相結(jié)合的技術(shù)方案，因而在提高經(jīng)聚乙二醇單修飾的蛋白質(zhì)活性和穩(wěn)定性方面獲得了顯著的有益效果。對采用上述方法形成的蛋白分子進(jìn)行檢驗，得到如下結(jié)果(1)提高了體外生物學(xué)活性，PEG-rmhG-CSF的活性與rhG-CSF活性相當(dāng)，高于PEG-rhG-CSF的活性；而且其體外穩(wěn)定性更高，在pH4.0和4'C條件下可存放3個月而不發(fā)生降解。(2)體內(nèi)活性實驗明顯長效，動物實驗證實，其體內(nèi)半衰期延長到了14.6小時，比未修飾的G-CSF(T1/2=2.2小時)提高了7倍，達(dá)到了長效、減少給藥次數(shù)的目的。本發(fā)明還提供了一種含有聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)的藥用組合物，該藥物制劑含有上述的有效量的生物制品和藥用稀釋劑、佐劑或載體等。該藥劑可用于治療因放療、化療等引起的中性粒細(xì)胞減少癥，由于半衰期延長，因此可實現(xiàn)每周只給藥l次。優(yōu)選制劑為注射水針，每毫升含6mgmPEG-rmhG-CSF，0.35mg乙酸鈉，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20和0.02mg的氯化鈉，pH為4.0。以下實例將進(jìn)一步說明本發(fā)明。附圖1SeqIDNo.卜SeqIDNo.21為表1所示21種陽性克隆中重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的175個氨基酸序列。附圖2圖2為rmhG-CSF的PEG修飾和純化的SDS-PAGE電泳圖.，其中11l為marker,從上到下為97，67，41，33，21，14KDa;2為純化的rmhG-CSF;3為rmhG-CSFPEG修飾反應(yīng)混合物；4為ResourceS洗脫峰1;5為ResourceS洗脫峰2;6為ResourceS洗脫峰3，附圖3為ReourceS分離純化PEG-rmhG—CSF的層析圖，洗脫峰1為修飾位點在第41位賴氨酸殘基的￡-氨基上的PEG-rmhG-CSF(lys41),洗脫峰2為修飾位點在第35位賴氨酸殘基的e-氨基上的PEG-rmhG-CSF(lys35),洗脫峰3為修飾位點在N-末端甲硫氨酸a-氨基上的PEG-rmhG-CSF(N端)附圖4為小鼠皮下給藥后rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF的血藥濃度-時間圖附圖5為小鼠皮下給藥后rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF和空白對照的白細(xì)胞總數(shù)變化情況具體實施例方式實例1高活性重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)的獲得(1)突變的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子基因rmhG-CSF18的獲得為了獲得第18位Cys突變?yōu)镾er的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子基因rmhG-CSF18，首先我們要先獲得重組人粒細(xì)胞集落刺激因子基因rhG-CSF。rhG-CSF基因的克隆方法可參考中國專利CN96106418.8實施例1。以獲得的cDNA為模板，設(shè)計引物如下上游引物l:5GMTTCATGACACCATTAGGC-3，下游引物2:5，-AMGGATCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT-3，，用常規(guī)PCR方法進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化，裝到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，將陽性克隆送測序檢領(lǐng)!l。將測序正確的克隆基因用EcoRI和BaraHI從pGEM-T上切割回收，即成功獲得了rhG-CSF基因。以上述成功獲得的rhG-CSF基因為模板，設(shè)計引物如下上游引物3:5GAATTCATGACACCATTAGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAGTCCTTAGAGCAAGTGAGG-3，該引物與人G-CSFcDNA負(fù)鏈的第169個核苷酸互補，其中突變了編碼第18個氨基酸的密碼子。下游引物2:5'-AAAGGATCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT-3'該引物與人G-CSFcDNA正鏈的第506534個核苷酸互補(上海生工生物工程12技術(shù)服務(wù)有限公司合成)，用常規(guī)PCR方法進(jìn)行目的基因的擴(kuò)±曾。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化，裝到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，做藍(lán)白斑篩選，將陽性克隆送測序檢測。將測序正確的克隆基因用EcoRI和BamHI從pGEM-T上切割回收，即成功獲得了第18位的Cys突變?yōu)镾er的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子基因rmhG-CSF18。(2)高活性重組人粒細(xì)胞集落刺激因子rmhG-CSF的獲得為了獲得高活性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子，我們對目前市場上流通的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子蛋白進(jìn)行突變篩選。具體操作如下a.展示隨機(jī)突變的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子基因(rmhG-CSF)噬菌體文庫構(gòu)建據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，重組人粒細(xì)胞集落剌激因子的生物活性的關(guān)鍵區(qū)域是在蛋白的N端，為了獲得具有高生物活性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rmhG-CSF)，我們用隨機(jī)突變的方法來對重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端進(jìn)行突變來獲得rmhG-CSF的cDNA文庫。為了對重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端進(jìn)纟亍隨機(jī)突變，設(shè)計了一個隨機(jī)的引物庫，如下隨機(jī)上游引物5GMTTCATG---------------------TGCTTAGAGCAA-3，；其中"---------------------"代表的是48個堿基的隨機(jī)組合，來編碼隨機(jī)的16個20種人體常見的氨基酸，"TGCTTAGAGCAA"是與編碼重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的第18-21個氨基酸的密碼子互補的堿基序列。該引物序列在合成過程中形成一個隨機(jī)的引物庫。下游引物2:5，-嵐GGATCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT—3，。為了對重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端進(jìn)^亍隨機(jī)突變，我們重新構(gòu)建了一個PCR模板，即以實例一中獲得的rmhG-CSF'8基因為模板，以上游引物4和下游引物2為引物對進(jìn)行常規(guī)的PCR基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化，裝到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，將陽性克隆送測序檢測。將測序正確的克隆基因用EcoRI和BamHI從pGEM-T上切割回收，即獲得了對重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端進(jìn)行隨t幾突變的前模板基因rtnhG-CSF0。上游引物4:5，-GAATTCTCCTTAGAGCAAGTGAGGAAGATC-3'。然后將獲得的rmhG-CSFe和隨機(jī)上游引物等摩爾混合，利用低溫PCR條件進(jìn)行退火連接，并以此連接產(chǎn)物作為最終的對重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)的N端進(jìn)行隨機(jī)突變的模板基因，在此連接體系中在補加隨機(jī)上游引物和下游引物2，進(jìn)行常規(guī)PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增。最終的PCR產(chǎn)物回收后用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI切割，將一部分回收的酶切產(chǎn)物用DNA連接酶和同樣用EcoRI和BamHI切割的噬菌粒載體pUC118連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布含有A即和IPTG及X-gal的2XYT平板(配方見分子克隆第2版附錄，冷泉港出版社)，37'C培養(yǎng)過夜，挑取白色的單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后少量提取質(zhì)粒，進(jìn)一步酶切鑒定證實已獲得重組的噬菌粒pUC118-重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rmhG-CSF)(具體的操作參見分子克隆)。含重組噬菌粒的大腸桿菌TG1培養(yǎng)液以10niL/L接種于含Amp的2XYT培養(yǎng)基中，37'C搖床培養(yǎng)至A600nm值為0.6，加入輔助噬菌體M13K07繼續(xù)培養(yǎng)1h，4000g離心15min，收集的菌體加入到新鮮的含Amp，Kan的2XYT培養(yǎng)基中，30。C搖床培養(yǎng)14~18h。將上述培養(yǎng)物10800g，4'C離心10min，收集上清。加入1/6體積PEG/NaCl(200g/LPEG8000,2.5mol/LNaCl)，充分混勻后4。C靜置lh，10800g，4。C離心30min'TBS溶解，加入1/6體積的PEG/NaCl，充分混勻后(TC放置20min，10800g，4。C離心30min，TBS溶解，10800g，4°C離心10min，吸取上清，即為表面呈現(xiàn)隨即突變的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rmhG-CSF)的重組噬菌體。b.高活性的人粒細(xì)胞集落刺激因子(rmhG-CSF)文庫篩選取提前配制好含0.1g/L疊氮鈉的封閉液14mL稀釋PEG沉淀的16ml重組噬菌體，室溫下孵育IO~15min后，取20mL加入G-CSF受體(R&D公司)包被的錐形培養(yǎng)瓶中，37。C孵育2h。PBS，PBST洗培養(yǎng)瓶，然后將10mL培養(yǎng)至對數(shù)生長期的TG1細(xì)胞加入上述免疫吸附后的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37"孵育lh，讓吸附的重組噬菌體感染TG1細(xì)胞，完成第一輪篩選。將10raL感染了重組噬菌體的TGl細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50mL細(xì)菌培養(yǎng)管中，加氨芐青霉素至100mg/L、葡萄糖至終濃度20g/L，再加入輔助噬菌體M13K07，37°C，250r/min震蕩培養(yǎng)1h，同前述方法一樣進(jìn)行又一輪篩選.用相同方法完成第3、第4輪篩選，再感染TG1細(xì)胞，得到富集的噬菌體克隆。隨機(jī)挑選經(jīng)篩選后的單克隆500個，利用NFS-60細(xì)胞的生長對G-CSF的依賴性進(jìn)行體外生物活性檢測，以天然的G-CSF為對照，MTT色素還原法測定樣品的生物學(xué)活性。結(jié)果顯示在這些克隆中有21個克隆的生物活性和天然的G-CSF相似或者比天然的G-CSF活性高。選取這21個陽性克隆進(jìn)行DNA序列分析，結(jié)果如下表3表321個高活性rmhG-CSF的N端基因序列克隆編號N端堿基序列0ATGACACCATTAGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAG7ATGGCACCAAAGCGCGGTACCAGCTCCCCATTCGCAGAACTGTTCCTCAAG13ATGACACTATTAGCCTCCCCGACGGGACGCGCCTTTAGCATGCTGAAGCTC19ATGCTACCAAAGCGCACATCGACCCCCTTCACAGAACAGTTGATGAGMAG26ATGTTCMGCCCAACGACCAAG嵐TCCACCCMGTACCTGGGTATATGAC31ATGTACAGCAGCAAAGCCAGTAACGACTTCAGTACGTGGMTATCCMGAG37ATGGTCGGAGCCGGTAGTCTTCATGACAACCGCAGT組CGCGTCGCTCTA56ATGGCACCAACATACCGTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAG63ATGAGATCCAAATTCCAATCCGTAATATGGCTAAGAGCTCAAGAAGTCGAC65ATGAGCTTCACAAAGATCCCCTCGACTAGMGAGCATCTAGTCCMCATAC70ATGGCCAAATACTTCMCGATCAAATTCTGAAATTCTCGGTCAGAGCCAGT101ATGACACCATCGCAATGGAGTTTTATCCACGMCAGTTCGGCGCMCTTCC112ATGGCATTCMGTATTCCTTCGGGACATACAGAACTAMCGGTCTTACTGG140ATGCTACMGCGTTATTTGCCTATCGGGACAACCAGAAGMTGAGTTGAAC151ATGACCGACGCGAAMCTTCTAMGAGMTGCGCCATCCAGMAGGAGTCA169ATGGCATATACGCCGAGMGTACCAAGTCTTTGAACGGACTGTTCGACGCA170ATGTTCGTCGCGAGTAAAACCGTTAGAAACCMACTGACGGGACTMCCCC172ATGGAAGCCGCAAGTACCTATTGGATGGACGTTGAGCAAGATAACCTGCAA173ATGCCGMAAGTGCCTACAGAGTCTGGATTCTGTGGAACATCCACGCCGM177ATGAAGGTCTATTCCACAGCTGTATCCGATACGCTTCCCAGGGATAGCAAG189ATGGCCATGACAGCACCTTCCCCCTATTTTCTACGCATACCCAAGGGCGCC195ATGGAACCTAAGCGTCGTACAACAAGGACTAAAGACCATTATCACACAACC其相應(yīng)的氨基酸序列如下表所示表421個高活性rmhG-CSF的N端氨基酸序列克隆編號N端17個氨基酸序列0MTPLGPASsPQSFLK7MAPKRGTSsPFAELFK13MTLLASPTGRAFSMK19MLPKRTSTPFTEQLMRK26MFKPNDQEIHPSTWVYD31MYSSKARNDFSTWNIQE37MVGAGSHDNRSKRVA56MAPTYRASSPQSFK63MRSKFQSVIWRAQEVD65MSFTKMPSTRRASSPTY70MAKYFNDQIKFSVRAS101MTPSQWSFIHEQFGATS112MAFKYSFGTYRTKRSYW140MLQAFAYRDNQKNEN151MTDAKTSKENAPSRKES169MAYTPRSTKSNGFDA170MFVASKTVRNQTDGTNP172MEAASTYWMDVEQDNLQ173MPKSAYRVWIffYIHAE177MKVYSTAVSDTPRDSK189MAMTAPSpYFRIPKGA195MEPKRRTTRTKDHYHTTc.高活性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rmhG-CSF)在原核系統(tǒng)中的表達(dá)、純化和性質(zhì)鑒定取上述21個包含高活性的突變的人粒細(xì)胞集落刺激因子(mihG-CSF)基因的16陽性克隆參照中國專利(96106418.8)進(jìn)行克隆表達(dá)、純化和性質(zhì)鑒定，最后獲得純度、和活性等都符合要求的rmhG-CSF，其活性測定數(shù)據(jù)見表2(生物學(xué)活性的測定可參照2005年版《中國藥典》第三部附錄58所示的方法)。選取活性最高的56號克隆參照中國專利(96106418.8)進(jìn)行克隆表達(dá)和純化，以用于下一步的PEG修飾實驗。實例2PEG-rmhG-CSF的制備a.rmhG-CSF的PEG修飾rmhG-CSF的PEG修飾準(zhǔn)備50ml2mg/ml的rmhG-CSF(陽性克隆56號)，100mMPBS(pH7.5)，然后加入300rag平均分子量為20KDa的MPEG-ALD(聚乙二醇-丙醛，直鏈)和20raMNaCN朋4，在4"下輕輕攪動6h后，SDS-PAGE分析結(jié)果表明4個小時后rmhG—CSF的修飾率己經(jīng)達(dá)到85W以上(圖2，泳道3)。b.PEG-rmhG-CSF的制備然后用注射用水把反應(yīng)液稀釋到1mg/ml，pH以稀鹽酸調(diào)至4.0，過Resource30S離子交換柱(16X10)，在0-0.5MNaCl，20mMNaAc(pH4.0)中梯度洗脫，其中三種單修飾的PEG-rmhG-CSF在2%-40%梯度洗脫下，分別為洗脫峰l，2，3。收集和合并峰(圖3)，SDS-PAGE電泳顯示該峰為單條帶(圖2，泳道4，5，6)，純度均在95%以上。c.PEG-rmhG-CSF單修飾異構(gòu)體的鑒定根據(jù)KinstlerOlafB等(美國專利US5985265,1999年公開)專利文獻(xiàn)說明書15-16頁關(guān)于PEG蛋白質(zhì)鑒定的方法，鑒定得到洗脫峰1為PEG-rmhG-CSF(lys41)，洗脫峰2為PEG-rmhG-CSF(lys35),洗脫峰3為PEG-rmhG-CSF(N端)實例3PEG-rmhG"CSF等生物學(xué)活性的分析體外生物活性的測定采用MTT方法((WelteK等，ProcNatAcadSci，82:1526-1530(1985))。具體步驟為在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種一定濃度的細(xì)胞懸液(50uL/孔)，將rhG-CSF標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)和修飾rhG-CSF樣品系列對倍稀釋，各取50uL加入培養(yǎng)板相應(yīng)孔中。設(shè)陽性對照、陰性對照(不含rhG-CSF)和空白對照(只含培養(yǎng)液)，37°C，5%C02培養(yǎng)36-48h，加MTT溶解液100wL/孔，次日測定各孔A5;。/AM。值。經(jīng)生物學(xué)活性測定顯示(表5)修飾前的rhG-CSF和rmhG-CSF分別為0.82xl08IU/mg和1.53x108IU/mg，后者活性高出86%，說明我們篩選到高活性的rmhG-CSF;而修飾后的PEG-rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF(N端)、PEG-rmhG-CSF(lys35)PEG-rmhG-CSF(lys41)活性分別為0.58x10sIU/mg、0.71xl08IU/mg、0.80xl08IU/mg、0.83x10sIU/mg，PEG-rmhG-CSF的活性比PEG-rhG-CSF高，說明得到了高活性的PEG-rmhG-CSF。而且PEG-rmhG-CSF(非N端修飾)，包括PEG-rmhG-CSF(lys35)和PEG-rmhG-CSF(lys41)的活性比PEG-rmhG-CSF(N端修飾)的活性高，說明在該rmhG-CSF的PEG修飾過程中，N端修飾由于阻礙了受體和配體的結(jié)合，活性反而降低。而且，初步實驗證明，在pH4.0和4。C條件下PEG-rmhG-CSF(N端)、PEG-rmhG-CSF(lys35)和PEG-rmhG-CSF(lys41)放置3個月，SEC-HPLC檢測未發(fā)生降解，顯示其在體外比較穩(wěn)定。表5各種G-CSF體外生物學(xué)活性比較SpecificbioactivityRelative(X108IU/mg)bioactivity(%)rhG-CSF0.82100PEG-rhG-CSF0.5871rmhG-CSF1.53186PEG-rmhG-CSF(N端)0.7187PEG-rmhG-CSF(lys35)0.8098PEG-rmhG-CSF(lys41)0.83101實例4PEG^rmhG"CSF體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)和藥效動力學(xué)的分析藥代動力學(xué)的測定采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣品中rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF(PEG-rmhG-CSF(lys41)為例，在這個實驗中也簡稱為PEG-rmhG-CSF)以的血藥濃度。每組三只18~22g雄性SPF級ICR小鼠，參照表6進(jìn)行注射和采集血樣后，再將血樣離心30min后分離血清，-20'C保存待測。用雙抗體夾心ELISA法檢測樣品中rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF的血藥濃度，具體操作參見HumanG-CSFDuoSet試劑盒(R&DSystems)的操作手冊。得到標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)用MicroCalOrigin軟件中的四參數(shù)邏輯曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求回歸方程及相關(guān)統(tǒng)計參數(shù)；用MicrosoftExcel2003軟件將樣品數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算相關(guān)數(shù)值并作圖；最后用3P87軟件進(jìn)行曲線擬合并計算主要藥代動力學(xué)參數(shù)。表6皮下給藥和取樣方法樣品動物數(shù)量劑量給藥給藥取樣時間途徑時間39mg/kgSCDl0，0.5,2，4，8，12，24，48，72，96，120h30lmg/kgSCDl0,5，15,30min，1,2，4，8,12，24,48h*SC=subcutaneous;Dl=firstday結(jié)果rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF小鼠皮下給藥(subcutaneous,SC)后的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)主要藥動學(xué)參數(shù)見表7，PEG-rmhG-CSF與rhG-CSF在小鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間曲線比較見圖4。從表7中可看到rhG-CSF和PEG-rnihG-CSF血清中藥物的半衰期(T1/2)分別為2.2h和14.8h,后者是前者的7倍；PEG-rmhG-CSF的AUC值為14489nghml-1，是rhG-CSF的16倍；從圖3的血藥濃度-時間曲線圖可直觀看出，達(dá)峰時間PEG-rmhG-CSF明顯大于rhG-CSF，并且在70h后在血液中可以檢測到PEG-rmhG-CSF的血藥濃度，血藥濃度的波動顯著減少。從上述藥代參數(shù)對比來看，PEG修飾技術(shù)確實可以延長rhG-CSF的半衰期，從而達(dá)到長效的目的。表7小鼠皮下給藥后rhG-CSF和PEG-rmhG-CSF的藥代參數(shù)valueparameter-—rhG-CSFPEG—rmhG-CSFRouteSCLagtimeH0.032±0.0041.449±0.034Tl/2H2.212±0.02414.845±0.378T(peak)H1.365±0.21420.378±0.81819PEG-rmhG-CSFrhG-CS<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>Abbreviations:SC=subcutaneous;T1/2=terminalhalf-life;T(peak)=timeofmaximumconcentration;C(max)=maximumconcentration;AUC=areaunderthecurve;CL/f(s)=clearanceoverbioavailability;V/f=volumeofdistributionusingtheterminalphase.藥效動力學(xué)的分析自中科院上海實驗動物中心購入1923glCR小鼠245只(125只雄性，120只為雌性)，除正常對照組注射等量的生理鹽^C外，其余小鼠注射環(huán)磷酰胺lmg/10g體重，連續(xù)3天，隨機(jī)取正常和造模小鼠5只，經(jīng)測試造模成功。將造模成功小鼠隨機(jī)分成3組，分組和給藥見下表8，給藥劑型為水針，每毫升含6mg的mPEG-rrahG-CSF，0.35mg乙酸鈉，30.0mg山梨醇，0.02mg聚山梨醇酯20，和0.02mg的氯化鈉，pH為4.0。采集各組給藥后D2、D4、D6、D8天各5只小鼠血樣進(jìn)行血細(xì)胞計數(shù)和白細(xì)胞分類計數(shù)和評價。表8分組和給藥<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>結(jié)果如下表9、圖5分別為小鼠皮下給藥后rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF和對照的白細(xì)胞總數(shù)表和圖。從中可看出PEG-rmhG-CSF對環(huán)磷酰胺引起的小鼠白細(xì)胞減少癥有升白作用，其5天一次注射的效果與每天注射的rhG-CSF效果相當(dāng)。表9小鼠皮下給藥后rhG-CSF、PEG-rmhG-CSF和對照的的白細(xì)胞總數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>序列表〈110〉杭州九源基因工程有限公司<120>聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體〈160〉1〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉175〈212〉PRT〈213〉智人(Homosapiens)<400>1MetThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGinSerPheLeuLeu151015LysCysLeuGluGinValArgLyslieGinGlyAspGlyAlaAlaLeu202530GinGluLysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeu354045ValLeuLeuGlyHisSerLeuGlylieProTrpAlaProLeuSerSer505560CysProSerGinAlaLeuGinLeuAlaGlyCysLeuSerGinLeuHis65707580SerGlyLeuPheLeuTyrGinGlyLeuLeuGinAlaLeuGluGlylie859095SerProGluLeuGlyProThrUuAspThrLeuGinLeuAspValAla100105110AspPheAlaThrThrlieTrpGinGinMetGluGluLeuGlyMetAla115120125ProAlaLeuGinProThrGinGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAla130135140PheGinArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGinSer145150155160PheLeuGluValSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGinPro16517017權(quán)利要求1、一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體，其特征在于(1)所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體氨基酸序列與SeqIDNo.1-SeqIDNo.21任一項所示的氨基酸序列相同；(2)所述的聚乙二醇為帶有氨基反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇分子，其定點結(jié)合于重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體蛋白序列中的α-氨基或ε-氨基。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體，其特征在于:所述的聚乙二醇分子為PEG琥珀酰亞胺碳酸酯、PEG對硝基苯碳酸酯、PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯、PEG碳酰咪唑、PEG苯并三唑碳酸酯(BTC-PEG)、PEG苯基琥珀酰亞胺碳酸酯、甲氧聚乙二醇羥琥珀酰酯乙酸酯(mPEG-succinimidylcarbonate,mPEG-SC)、甲氧聚乙二醇醛或?qū)蓚€線性的BTC-PEG或mPEG-SC鏈連到賴氨酸的a-氨基和e-氨基形成的分支狀的PEG衍生物等。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落剌激因子突變體，其特征在于(1)所述的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體氨基酸序列與SeqIDNo.7所示的氨基酸序列相同；(2)所述的聚乙二醇為甲氧聚乙二醇丙醛，其與重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體蛋白序列中N末端甲硫氨酸殘基上的a-氨基反應(yīng)后形成胺鍵相連。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體，其特征在于(1)所述的重組人粒細(xì)胞集落剌激因子突變體氨基酸序列與SeqIDNo.7所示的氨基酸序列相同；(2)所述的聚乙二醇為甲氧聚乙二醇丙醛，其與重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體蛋白序列中第35位賴氨酸殘基上的e-氨基反應(yīng)后形成胺鍵相連。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體，其特征在于(1)所述的重組人粒細(xì)胞集落剌激因子突變體氨基酸序列與SeqIDNo.7所示的氨基酸序列相同；(2)所述的聚乙二醇為甲氧聚乙二醇丙醛，其與重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體蛋白序列中第41位賴氨酸殘基上的e-氨基反應(yīng)后形成胺鍵相連。6、權(quán)利要求1-5中任一項所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體在制備治療因放療、化療等引起的中性粒細(xì)胞減少癥藥物中的應(yīng)用。7、一種含有如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的生物制品，其特征在于所述制品含有至少90%以上的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體和至多10%的未發(fā)生聚乙二醇化的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體。8、一種制備如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的方法，其包括如下步驟(1)在含水介質(zhì)中，帶有氨基反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇分子與重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)中的氨基反應(yīng)；(2)任選地從反應(yīng)混合物中分離聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)的產(chǎn)物。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體:聚乙二醇分子的比例在1:1-1:20之間。10、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體，其氨基酸序列與SeqIDNo.1-SeqIDNo.21任一項所示的氨基酸序列相同。，全文摘要本發(fā)明涉及一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)的制備和鑒定。通過點突變技術(shù)，將重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)18位的半胱氨酸(cys)突變?yōu)榻z氨酸(ser)，再通過噬菌體展示技術(shù)表達(dá)N端突變的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(其中18位的半胱氨酸已突變?yōu)榻z氨酸)，然后利用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子受體篩選出具有高穩(wěn)定性和生物學(xué)活性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(rmhG-CSF)。突變后的rmhG-CSF與帶有氨基反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇(PEG)反應(yīng)，經(jīng)分離純化，獲得了活性和穩(wěn)定性更高的聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體(PEG-rmhG-CSF)。文檔編號C07K1/00GK101602801SQ20081006251公開日2009年12月16日申請日期2008年6月13日優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日發(fā)明者劉曉妮,單劍峰,徐飛虎,戎亞雯,方井晉,琳朱,汪軍遠(yuǎn),王同映,王昌梅,榮金申請人:杭州九源基因工程有限公司