一種噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物及其作為Bcl-2家族蛋白拮抗劑的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：：一種噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物及其作為Bcl-2家族蛋白拮抗劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物及其作的小分子抑制劑為Bcl-2家族蛋白拮抗劑的應(yīng)用，特別是的-4-(2-(芳基亞肼基)-3-甲基-1-(4-芳基噻唑-2-基)-lH-吡唑-5(4H)-酮類化合物與作為Bcl-2家族蛋白拮抗劑的應(yīng)用。該類化合物能夠抑制Bcl-2家族蛋白成員Bcl-xl與天然底物多肽(BidBH3多肽)的結(jié)合，可作為Bcl-2家族蛋白用于抑制其抗凋亡活性，并有望開發(fā)成為一類新型的抗腫瘤藥物。
背景技術(shù)：
：細胞凋亡(某些情況下又可稱為細胞程序性死亡)是一種去除衰老細胞或異常細胞的正常死亡機制，該機制的紊亂與多種疾病的發(fā)生有直接的關(guān)系。自上世紀90年代以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生是細胞的增殖與凋亡失衡所致(Okada，H.;Mak,T.W.及evOmcer2004，《592-603)。研究表明在多種腫瘤細胞中凋亡機制被抑制，腫瘤細胞因而得以過度增生；另外，凋亡機制被抑制也使得腫瘤細胞對化療藥物的抵抗性增強(Igney，F(xiàn).H.;Krammer，P.H.iev.Ca"cer2002,2,277-288)。因此，設(shè)法恢復(fù)腫瘤細胞中的凋亡機制成為當今抗腫瘤藥物設(shè)計的一條新思路，在國際上得到了廣泛重視(Reed，J.C.A^.及ev.Dn/gIfecov.2002，厶111-121;Andersen,M.H.;Becker,J.C.;Straten，P.M2A及ev.Dn/gD&cov.2005,4,399-409.)。在與細胞凋亡有關(guān)的藥物靶點中，Bcl-2(B-celllymphoma2)相關(guān)蛋白是較早得到研究的一類。該類蛋白可分為三個家族Bcl-2家族，Bax家族和BH3-only家族。其中，Bcl-2家族成員(Bcl-2，BcI-xl,Mcl-l，Bcl-w等)起著抗細胞凋亡的作用，后兩個家族的成員起促細胞凋亡的作用。目前人們認為Bcl-2相關(guān)蛋白主要是在細胞凋亡的線粒體途徑中發(fā)揮作用。其中經(jīng)活化的Bax家族蛋白(Bax、Bak等)可以結(jié)合在線粒體膜上使得細胞色素C從線粒體中釋放出來從而最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生；而Bcl-2、Bcl-xl等抗凋亡蛋白則能夠與Bax和Bak相結(jié)合，使其不能發(fā)揮作用；另外，一些BH3-only家族成員(Bim，Bad,Bid,Bik等)又能夠與Bcl-2和Bc1-xl相結(jié)合，抑制其抗凋亡作用。因此，Bcl-2相關(guān)蛋白之間的平衡與否對細胞凋亡起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。研究表明，多種類型的腫瘤細胞至少過量表達其中一種Bel-2家族蛋白，但是在正常細胞中這些蛋白的表達水平則相對較低。使用有機小分子拮抗這些蛋白的功能有望恢復(fù)腫瘤細胞中的凋亡機制，從而達到消除腫瘤的目的(Huang，Z.CWr.i>wgZ)&cov.Z)eve/.2000，3，565-574;Cory，S.;Adams,J.M.及ev.Cawcer2002,2,647-656)。有機小分子對Bcl-2家族蛋白的抑制活性通常用熒光偏振(FluorescencePolarization,簡稱FP)方法檢測(Zhang，H.;Ni腿er，P.;Rosenberg,S.H.;Ng，S.C.;Joseph,M.爿"fl/.歷oc&附.2002，卯7,70-75)。該方法是基于分子在均相溶液中的自由旋轉(zhuǎn)，當一個熒光標記的分子被一個平面的極化光所激發(fā)時，其發(fā)射光可發(fā)射到一個固定的平面，而該發(fā)射光的極化水平與分子的旋轉(zhuǎn)速度成反比。熒光標記的小分子在均相體系里處于高速旋轉(zhuǎn)狀態(tài)，發(fā)射光表現(xiàn)為除極化，得到一個較低的極化值，而非熒光標記的大分子旋轉(zhuǎn)速度遠遠低于熒光標記的小分子，當小分子和大分子發(fā)生特異性結(jié)合后，復(fù)合物的旋轉(zhuǎn)速度與大分子的旋轉(zhuǎn)速度相比變化不明顯，而遠遠低于熒光標記小分子的旋轉(zhuǎn)速度，極化值顯著升高。當該方法用于檢測小分子抑制Bcl-2家族蛋白與天然底物多肽的結(jié)合時，在熒光標記多肽與蛋白共存的體系中加入待測化合物，如果化合物也能夠與蛋白特異性結(jié)合，則會與熒光標記多肽發(fā)生競爭從而抑制其與蛋白的結(jié)合，進而導(dǎo)致熒光極化值降低。因此通過檢測熒光極化值的變化情況就可以測得化合物的活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的是提供一種新的噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物。本發(fā)明的第二個目的是提供一種噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物用于制備抑制Bc1-xl與天然底物多肽結(jié)合的小分子抑制劑和抗腫瘤藥物的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的一種新的噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物具有如下的結(jié)構(gòu)式<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式中R!為o陽Ph、；-OMe、w-C02H、o-C02Me或8國喹啉；R2為H、/w-Ph、;-Ph、w-Bn、o-OMe、/w-OMe、w-N02、卩-萘基、p-N-四氫吡咯或8H-茚并[l，2誦d]噻唑-2-基。限制條件是當Ri為w-C02H時，R2為w-Ph、/-Ph、w-Bn、o-OMe、/w-OMe、w-N02、P-萘基、p-N-四氫吡咯或8H-茚并[l，2-d]噻唑-2-基；當Ri為o-Ph、,OMe、o-C02Me或8-喹啉時，R2為H。本發(fā)明的用于制備抑制Bcl-化與天然底物多肽結(jié)合的小分子抑制劑和抗腫瘤藥物的噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物沒有上述的限制，具體地說是具有如下結(jié)構(gòu)式的(E)-4-(2-(芳基亞肼基)-3-甲基-l-(4-芳基噻唑-2-基)-lH-吡唑-5(4H)-酮類化合物<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式中Ri為H，w-Me，；-Me，o-Ph，p-F，o-Cl，w-Cl，；-Cl，p-Br，/n-OH，;-OMe,;陽OEt，w-CH2OH，o-C02H,w-C02H，/-C02H，o-C02Me，；>CONH2，p-S03H，；-S02NH2，p國NMeCOMe，3，4-二氯，2，4，6-三溴或8-喹啉；R2為H，;-Me，附隱Ph，p-Ph，w-Bn，o-OMe，附-OMe，；-OMe，；陽Br，w-N02，卩-萘基，p-N-四氫吡咯或8H-茚射l，2-d]噻唑-2-基。沒有前述的限制條件。可以進一步描述為如下的化合物<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage7</formula>實驗表明，上述噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物為抑制Bcl-2家族蛋白成員Bc1-xl與天然底物多肽(BidBH3多肽)相結(jié)合的有效成分，基于熒光偏振(FP)原理的活性測試表明該類化合物具有微摩爾級的活性。FP方法檢測此類化合物抑制Bcl-xL與N端用5陽FAM標記的BidBH3多肽(序列為5-FAM畫QEDIIRNIARH陽LAQVGDSMDR)結(jié)合的活性如下1)(E)-4-(2-(3-羥甲基苯基)亞肼基)-l-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-01)在10nM下的抑制率為78.7%;2)(E)-2-(2-(1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-02)在10nM下的抑制率為77.0n/o;3)(E)-3-(2-(l-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-03)在10下的抑制率為92.4%;4)(E)-3-(2-(l-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-04)的抑制常數(shù)&為0.74pM;5)(E)-3-(2-(l-(4-(聯(lián)苯-3-基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-05)在10nM下的抑制率為32.8%;6)(E)-3-(2-(l-(4-(3-芐基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-06)在10nM下的抑制率為31.4%;7)(E)-3-(2-(3-甲基-l-(4-(萘基-2-)噻唑-2-基)-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-07)的抑制常數(shù)&為2.2nM;8)(E)-4-(2-(3-甲基-5-氧代-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯基磺酰胺(式X-08)在10nM下的抑制率為43.0%;9)(E)-3-(2-(3-甲基-5-氧代-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-09)在10pM下的抑制率為35.3%;10)(E)-4-(2-(3-甲基-5-氧代-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-IO)的抑制常數(shù)&為13.1^tM;11)(E)-l-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-4-(2-苯基亞肼基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-ll)在10jxM下的抑制率為68.4%;12)(E)-4-(2-(l-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯磺酸(式X-12)在10pM下的抑制率為56.5%;13)(E)-4-(2-(4-甲基苯基)亞肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-13)在10nM下的抑制率為54.0%;14)(E)-N-(4-(2-(1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5印-亞基)肼基)苯基)->^-甲基乙酰胺(式X-14)在10nM下的抑制率為48.8%;15)(E)-3-甲基-1-(4-(3-硝基苯基)噻唑-2-基)-4-(2-(2，4,6-三溴苯基)亞肼基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-15)在10pM下的抑制率為43.9%;16)(￡)-4-(2-(1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-111-吡唑-4(511)-亞基)肼基)苯磺酰胺(式X-16)在10pM下的抑制率為42.8%;17)(E)-l-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-4-(2-(3-氯苯基)亞肼基)-3-甲基-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-17)在10下的抑制率為42.6%;18)(E)-4-(2-(4-溴苯基)亞肼基)-l-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-18)在10nM下的抑制率為36.0%;19)(E)-3-(2-(3-甲基-l-(4-(3-硝基苯基)噻唑-2-基)-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-19)在10下的抑制率為34.6%;20)(E)-3-甲基-4-(2-苯基亞肼基)-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-20)在10nM下的抑制率為28.2%;21)(￡)-4-(2-(4-氯苯基)亞肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-111-吡唑-5(4印-酮(式X-21)在10下的抑制率為26.6%;22)(E)-4-(2-(2-氯苯基)亞肼基)-3-甲基-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-22)在10下的抑制率為25.5%;23)(E)-l-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-4-(2-(3-羥苯基)亞肼基)-3-甲基-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-23)在10nM下的抑制率為25.4%;24)(￡)-3-(2-(1-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-111-吡唑-4(511)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-24)在10pM下的抑制率為25.3。/o;25)(￡)-1-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-4-(2-附-甲苯亞肼基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-25)在10下的抑制率為23.7%;26)(E)-4-(2-(4-甲氧基苯基)亞肼基)-3-甲基-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-26)在10nM下的抑制率為22.5%;27)(E)-3-(2-(3-甲基-5-氧代-l-(4-(4-(四氫吡咯-l-基)苯基)噻唑-2-基)-lH-吡唑-4(5印-亞基)肼基)苯甲酸(式X-27)在10nM下的抑制率為20.5。/。；28)(E)-4-(2-(3-甲基-5-氧代-1-(4少-甲苯噻唑-2-基)-1H-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酰胺(式X-28)在10jiM下的抑制率為19.5%;29)(￡)-1-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-4-(2-(4-甲氧基苯基)亞肼基)-3-甲基-111-吡唑-5(4H)-酮(式X-29)在10nM下的抑制率為18.9%;30)(E)-l-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-4-(2-w-甲苯亞肼基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-30)在10pM下的抑制率為18.0%;31)(￡)-3-(2-(1-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-111-吡唑-4(511)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-31)在10^M下的抑制率為17.5%;32)(￡)-4-(2-(4-氟苯基)亞肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-111-吡唑-5(4印-酮(式X-32)在10jiM下的抑制率為14.5%;33)(￡)-4-(2-(3-氯苯基)亞肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-111-吡唑-5(411)-酮(式X-33)在10pM下的抑制率為14.2%;34)(E)-3-(2-(1-(SH-茚并[1，2-d]噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-卩比唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-34)在10pM下的抑制率為13.5%;35)(E)-4-(2-(3,4-二氯苯基)亞肼基)-3-甲基-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-35)在10pM下的抑制率為13.2%;36)(￡)-4-(2-(1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)_3-甲基-5-氧代-111-吡唑-4(511)-亞基)肼基)苯甲酰胺(式X-36)在10pM下的抑制率為8.9%;37)(E)-3-(2-(l-(4-(聯(lián)苯-4-基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-37)在10[iM下的抑制率為8.2%;38)問-1-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-4-(2-(4-乙氧基苯基)亞肼基)-3-甲基-111-吡唑-5(4H)-酮(式X-38)在10nM下的抑制率為6.3y。；39)(￡)-4-(2-(聯(lián)苯-2-基)亞肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-111-吡唑-5(411)-酮(式X-39)在10下的抑制率為6.3%;40)(E)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-4-(2-(喹啉-8-基)亞肼基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-40)在10下的抑制率為4.4%;41)(E)-2-(2-(3-甲基-5-氧代-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸甲酯(式X-41)在10nM下的抑制率為1.2%。本發(fā)明的噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物還可以用于制備抗腫瘤藥物。實驗表明，噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物對人乳腺癌MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞顯示出抑制活性，是一類具有廣泛應(yīng)用價值的抗腫瘤先導(dǎo)化合物。其中化合物X-01和X-15對MDA-MB-231的CCso值(50%CytotoxicConcentration,半數(shù)細胞毒濃度)分別為3.5和0.95jiM;化合物X-01對MCF-7的CC5o值為16.8^M。本發(fā)明的有益效果在于所涉及的噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物是一類結(jié)構(gòu)新穎的Bcl-2家族蛋白抑制劑，具有微摩爾級的分子水平抑制活性，而且對腫瘤細胞具有較強的細胞毒活性，因此作為先導(dǎo)化合物具有良好的潛力和應(yīng)用前景，有望開發(fā)成為耙向Bcl-2家族蛋白的抗腫瘤藥物。圖1-圖3為噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物的熒光偏振測活曲線；圖4-圖6為噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物的MTT測活曲線。其中，圖4為噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物X-01對MDA-MB-231細胞系細胞毒性測定；圖5為噻哇聯(lián)吡唑酮類化合物X-15對MDA-MB-231細胞系細胞毒性測定；圖6為噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物X-01對MCF-7細胞系細胞毒性測定。具體實施例方式實施例1:制備(￡)-4-(2-(4-氯苯基)亞肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-111-吡唑-5(4H)-酮一、(Z)-2-(2-(4-氯苯萄亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-05)的合成.OEtN、NHww1)NaN02,HCI人^)"1+義義2)NaOAc,EtOHn。、OEt-、^"RlNH2■■■式IIRi式n的產(chǎn)率(%)0571將1.276g(10mmol)4-氯苯胺(式1-05)懸浮在8mL水中，控制約室溫下慢慢注入5mL濃HC1，降至低溫(0QC)下慢慢注入含0.690g(10mmol)亞硝酸鈉的5mL水溶液，之后直接過濾到含1.28mL(10mmol)乙酰乙酸乙酯和8g(97.5mmol)乙酸鈉的25mL乙醇溶液中，有黃色固體析出，抽濾，水洗，無水乙醇重結(jié)晶得黃色針狀晶體1.914g(產(chǎn)率71%)。經(jīng)檢測，結(jié)構(gòu)正確，檢測結(jié)果如下mp80—84°C;IR(KBr):v2994，1704,1617，1587,1528，1495，1474,1456，1419，1396,1372,1330，1276，1205，1167，1116,1093，1021,1008，977，836，818,784,657，512,457cm";'HNMR(300MHz，CDC13):(514.76(s,1H)，7.35(s,4H)，4.34(q，/=7.2Hz，2H)，2.60(s,3H),1.40(t，7=7.2Hz，3H);MS(ESI)(w/z力269(M+H^，291(M+Na+),323(M+MeOH+Na+)，349(M+acetone+Na+);Anal.CalcdforC12H13C1N203:C53.64，H4.88，N10.43.Found:C53.60，H4.89，N10.42.二、(E)-4-(2-(4-氯苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4,5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式III-05)的合成■i,"式IIIRi式III的產(chǎn)率(%)05<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage12</formula>將1.904g(7.08mmol)的(Z)-2-(2-(4-氯苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-05)加入15mL乙酸中溶解，再加入0.646g(7.08mmol)氨基硫脲，加熱回流4小時，冷卻后抽濾，依次用乙酸和冷凍的乙醇洗滌，直接抽干，得黃色固體I.898g(產(chǎn)率91%)。經(jīng)檢測，結(jié)構(gòu)正確，檢測結(jié)果如下mp215—220。C;IR(KBr):v3375，3264，1693,1600,1549,1481,1446,1397，1313，1288，1269，1234，1087,1045，997,871,823,771,595，547cm-1;&NMR(300MHz,DMSO—^):<513.05(s，1H)，9.48(s，1H),8.92(s，1H),7.69(d，/=9.0Hz，2H),7.51(d，/=8.7Hz,2H)，2.26(s,3H);13CNMR(75MHz,DMSO—^):5176.7，156.4，149.6,140.4,129.8，129.4，126.7,118.2,II.5;MS(ESI)(一296(M+H+)，318(M+Na+);HRMS(EI)(附/z):CalcdforChHk)C1NsOS(M+):295.0295，F(xiàn)ound:295,0294.三、(￡)-4-(2-(4-氯苯基)亞肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-111-吡唑-5(411)-酮(式X-21)的合成<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage13</formula>將0.148g(0.5rnrno1)的(E)-4-(2-(4-氯苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式III-05)加入15mL二氧六環(huán)中，加熱回流至溶解，停止加熱，加入0.249g(1.25腿ol)2-溴-l-(3-芐基苯基)乙酮，加熱回流0.5h，停止加熱，濃縮除去二噁垸，依次用石油醚和乙醇洗滌，得化合物X-06(0.198g，產(chǎn)率100%)。經(jīng)檢測，結(jié)構(gòu)正確，檢測結(jié)果如下mp216—223。C;IR(KBr):v1664,1592，1551，1519，1480，1445，1373,1325，1280,1263，1229,1184，1100,1085，1023,1004，922，884，824，775，728cm.1;NMR(300MHz，CDC13):<513.25(s,1H)，7.96(dd，/=7.8Hz,/=1.5Hz，2H),7.43—7.26(m，8H),2.45(s,3H);13C畫R(75MHz，CDC13):(5156.4，154.9,151.8，151.2,139.3，133.9，131.8，129.9,128.5，128.1，127.2，126.4，117.1，107.8,11.9;MS(ESI)(m/z力396(M+H^，418(M+Na+)，450(M+MeOH+Na+);HRMS(ESI)(附/z):CalcdforC19H15C1N50S(M+K):396.0686，F(xiàn)ound:396.0682.實施例2:式X-04,X-05，X-06，X-07，X-09，X-10,X-13，X-19，X-20,X-24，X-26，X-27,X-31,X-32，X-33，X-34,X-35，X-37，X-39,X-40，X-41化合物的合成一、式n-oi-04和式n-06-17的合成式IIRi式II的產(chǎn)率(％)<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage13</formula>01H7802,F6403o-Cl6804;7-Cl70063,4-二氯7307o-Mc59086809/-Me5010;-OMe4111w-C02H6112/7-C02H8013o-C02Me7414;-COOnBu4515o-Ph5516l-萘基41178-喹啉基42在與實施實例一中合成式11-05化合物類似的條件下，從相應(yīng)的式1-01-04和式1-06-17得到化合物式11-01-04和式11-06-17:(Z)-2-(2-苯基亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-01);(Z)-2-(2-(4-氟苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-02);(Z)-2-(2-(2-氯苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-03);(Z)-2-(2-(3-氯苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-04);(Z)-2-(2-(3，4-二氯苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-06);(Z)-2-(2-(2-甲基苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-07);(Z)-2-(2-(3-甲基苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-08);(Z)-2-(2-(4-甲基苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-09);(Z)-2-(2-(4-甲氧基苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-10);(Z)-2-(2-(3-羧基苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-11);(Z)-2-(2-(4-羧基苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-12);02-(2-(2-甲氧羰基苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-13);(Z)-2-(2-(4-正丁氧羰基苯基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-14);(Z)-2-(2-(聯(lián)苯-2-基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-15);(Z)-2-(2-(l-萘基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-16);(Z)-2-(2-(8-喹啉基)亞肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式11-17)。二、式III-01-04和式111-06-17合成14<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage15</formula><table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在與實施實例一中合成式111-05化合物類似的條件下，從相應(yīng)的式11-01-04和式11-06-17得到化合物式式111-01-04和式111-06-17:(E)-4-(2-苯基亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式111-01);(E)-4-(2-(4-氟苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代4，5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式m-02);(E)4-(2-(2-氯苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式III-03);(E)-4-(2-(3-氯苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式111-04);(E)-4-(2-(3,4-二氯苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式111-06);(E)-4-(2-(2-甲基苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4,5-二氫-lH-吡唑小硫代酰胺(式III-07);(E)-4-(2-(3-甲基苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式111-08);(￡)-4-(2-(4-甲基苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4,5-二氫-111-吡唑-l-硫代酰胺(式III-09);(￡)-4-(2-(4-甲氧基苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4,5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式111-10);(￡)-4-(2-(3-羧基苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式III-11);陽-4-(2-(4-羧基苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4,5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式III-12);(E)-4-(2-(2-甲氧羰基苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式III-13);(E)-4-(2-(4-正丁氧羰基苯基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式111-14);(E)-4-(2-(聯(lián)苯-2-基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4,5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式m-15);(E)-4-(2-(l-萘基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式111-16);(E)-4-(2-(8-喹啉基)亞肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氫-lH-吡唑-l-硫代酰胺(式m-n)。三、式X陽04，X-05，X-06，X-07，X-09，X-IO，X-13,X-19，X-20，X隱24，X-26,X-27,X-31，X國32，X-33，X墨34，X-35，X-37,X國39，X-40，X-41化合物的合成<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式xRiR2式x的產(chǎn)率(％)04/n-C02HN/A05w-C02H;w-PhN/A06w-C02H82.307w-C02HP-萘基9509w-C02HH8110/-C02HH7313/隱MeH9119w-C02H94.620HH7624/n-C02H附陽OMe83.126;-OMeHN/A27w-C02H,N-四氫吡咯N/A31w-C02Ho-OMe45<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>在與實施實例一中合成式X-21化合物類似的條件下，從相應(yīng)的式111-01-04和式111-06-17和式IV-01-04和式IV-06-17得到化合物式X-04，X-05，X-06，X-07，X誦09，X國IO,X-13，X-19，X-20,X-24，X-26，X-27，X-31，X-32，X-33,X-34，X-35，X-37，X-39，X-40，X-41:(E)-3-(2-(l-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-04)，(E)-3-(2-(l-(4-(聯(lián)苯-3-基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-05)，(E)-3-(2-(l-(4-(3-芐基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-06),(E)-3-(2-(3-甲基-l-(4-(萘基-2-)噻唑-2-基)-5-氧代-lH-吡唑-4(5印-亞基)肼基)苯甲酸(式X-07)，(E)-3-(2-(3-甲基-5-氧代-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-09),(E)-4-(2-(3-甲基-5-氧代-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-IO)，(E)-4-(2-(4-甲基苯基)亞肼基)-3-甲基-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-13)，(E)-3-(2-(3隱甲基小(4-(3-硝基苯基)噻唑-2-基)-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-19)，(E)-3-甲基-4-(2-苯基亞肼基H-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-20)，(E)-3-(2-(1-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-24)，(E)-4-(2-(4-甲氧基苯基)亞肼基)-3-甲基-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-26)，(E)-3-(2-(3-甲基-5-氧代-l-(4-(4-(四氫吡咯-1-基)苯基)噻唑-2-基)-111-吡唑-4(5印-亞基)肼基)苯甲酸(式X-27)，(E)-3-(2-(l-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-31)，問-4-(2-(4-氟苯基)亞肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-111-吡唑-5(4H)-酮(式X-32)，(￡)-4-(2-(3-氯苯基)亞肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-33),(￡)-3-(2-(1-(811-茚并[1，2-(1]噻唑-2-基)-3-甲基國5-氧代-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-34)，(E)-4-(2-(3，4-二氯苯基)亞肼基)-3-甲基-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-35)，(E)-3-(2-(l-(4-(聯(lián)苯-4-基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-lH-吡哇-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸(式X-37)，(E)-4-(2-(聯(lián)苯-2-基)亞肼基)-3-甲基-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-5(4H)-酮(式X-39)，(￡)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-4-(2-(喹啉-8-基)亞肼基)-111-吡唑-5(411)-酮(式X-40)，(E)-2-(2-(3-甲基-5-氧代-l-(4-苯基噻唑-2-基)-lH-吡唑-4(5H)-亞基)肼基)苯甲酸甲酯(式X-41)。實施例3:噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物對Bcl-"抑制作用的熒光偏振檢測谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合的Bcl-xL(GST-Bc1-xl)蛋白在大腸桿菌BL21中表達，經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱親和層析的方法分離純化；熒光標記多肽為N端用5-FAM標記的BidBH3多肽(序列為5-FAM-QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR);化合物X隱04，X-05，X-06，X隱07，X-09，X-IO，X-13，X-19，X陽20，X-21，X-24，X-26，X-27，X陽31，X-32,X-33，X隱34，X-35，X-37，X-39，X-40，X-41用上述方法制備，其余化合物購自SPECS公司。一、化合物式X-04,X-07和X-10的抑制常數(shù)測定在測試緩沖液(lx磷酸鹽緩沖溶液，含0.02%(w/v)NaN3)中加入GST-Bcl-Xlj的lxPBS溶液和化合物不同濃度的DMSO溶液，混勻后室溫避光孵育30min;再加入熒光標記多肽的lxPBS溶液(終濃度為10nM)，使各溶液的總體積均為200nL，混勻后室溫避光孵育20min;將上述溶液及校正溶液l(1nMfluorescein)和校正溶液2(10mMNaOH)各取60nL轉(zhuǎn)移至黑色384孔板中(平行三組)，立即在酶標儀上進行熒光偏振的檢測，以485nM為激發(fā)波長，535nM為發(fā)射波長，將校正溶液的熒光偏振值定為20mP，測得各濃度下的熒光偏振值(mP)并計算抑制率，擬合得到半數(shù)抑制濃度/C5C，抑制常數(shù)使用如下公式求得&=M50/([丄]50/尺d+[尸]0^d+l)([Z]50:達到半數(shù)抑制時游離的抑制劑的濃度；[丄]50:達到半數(shù)抑制時游離的熒光標記多肽的濃度；[P]o:沒有抑制時游離的蛋白濃度；蛋白與熒光標記多肽的解離常數(shù))。結(jié)果見表l-表3:表l:化合物X-04的熒光偏振檢測結(jié)果<table>complextableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>二、化合物式X-Ol-X-03，X-05，X-06，X-08，X-09，X-ll-X-41的抑制活性檢測在測試緩沖液(lx磷酸鹽緩沖溶液，含0.02%(w/v)NaN3)中加入GST-Bcl-xL的lxPBS溶液，分別加入DMSO(2pL)和待測化合物的DMSO溶液(終濃度為'10pM)，混勻后室溫避光孵育30min;再加入熒光標記多肽的lxPBS溶液(終濃度為10nM)，使各溶液的總體積均為200pL,混勻后室溫避光孵育20min;將上述溶液及校正溶液1(1nMfluorescein)和校正溶液2(10mMNaOH)各取60^L轉(zhuǎn)移至黑色384孔板中(平行三組)，立即在酶標儀上進行熒光偏振的檢測，以485nM為激發(fā)波長，535nM為發(fā)射波長，將校正溶液的熒光偏振值定為20mP，測得各化合物的熒光偏振值(mP)。怖先||隸<^=對照(GST-Bcl-xL/DMSO/熒光標記多肽)mP值-待測化合物mP值°—對照(GST-Bcl-xL/DMSO/熒光標記多肽)mP值-熒光標記多肽mP值x結(jié)果見表4:表4:化合物式X-Ol-X-03,X-05，X曙06，X-08，X國09，X-ll-X-41的熒光偏<table>complextableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實施例4:噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物對人乳腺癌mda-mb-231細胞系的細胞毒性檢測一、化合物X-Ol，X-02，X-15在10hM下對MDA-MB-231細胞抑制率測定4X104/mlMDA-MB-231細胞懸液100^L每孔，孵育一天后，與不同的待測化合物溶液混合(終濃度10pM)，37°C，5%<:02培養(yǎng)2天，采用MTT比色法檢測細胞毒性。570nmTECANGENiosPro多功能酶標儀測定OD值，計算細胞抑制率。細胞抑制率％=陰性對照組OD值-化合物組OD值xl00%陰性對照組OD值化合物X-Ol，X-02，X-15在10nM下對MDA-MB-231細胞抑制率測定化合物抑制率％平均抑制率%誤差％X-0115.641.802.066.507.92X-0215.4220.3114.1416.623.26X-1526.5527.6015.4623.206.73二、化合物X-01對MDA-MB-231的細胞毒性檢測4xl04/mlMDA-MB-231細胞懸液100pL每孔，孵育一天后，加入混合了不同濃度化合物的DMEM培養(yǎng)液，37°C，5%(:02培養(yǎng)2天，采用MTT比色法檢測細胞毒性。570nmTECANGENiosPro多功能酶標儀測定OD值，計算CC50值(50%CytotoxicConcentration)為3.5jjM。細胞蹄率^lll^lll^l",對照孔OD值-空白孔OD值表6:化合物X-01對MDA-MB-231細胞毒性<table>complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>三、化合物X-15對MDA-MB-231的細胞毒性檢測4xl04/mlMDA-MB-231細胞懸液100nL每孔，孵育一天后，加入混合了不同濃度化合物的DMEM培養(yǎng)液，37°C，5y。C02培養(yǎng)2天，采用MTT比色法檢測細胞毒性。570nmTECANGENiosPro多功能酶標儀測定OD值，計算CC50值(50%CytotoxicConcentration)為0.95jiM。細胞存活率％=|||^5||^|適％對照孔OD值-空白孔OD值表7:化合物X-15對MDA-MB-231細胞毒性<table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例5:噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物對人乳腺癌MCF-7細胞系的細胞毒性檢-,化合物X-Ol，X-02，X-03，X-ll，X-15在10下對MCF-7細胞抑制率測定6X104/mlMCF-7細胞懸液100^L每孑L，孵育一天后，與不同的待測化合物溶液混合(終濃度10pM)，37°C，5。/。C02培養(yǎng)4天，采用MTT比色法檢測細胞毒性。570nmTECANGENiosPro多功能酶標儀測定OD值，計算細胞抑制率。細胞抑制率%=陰性對照組OD值-化合物組OD值/陰性對照組OD值*100%表8:化合物X-Ol，X-02，X-03，X-ll，X-15在10pM下對MCF-7細胞抑制率測定<table>complextableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>二、化合物X-01對MCF-7的細胞毒性檢測6xl04/mlMCF-7細胞懸液100|aL每孔，孵育一天后，加入混合了不同濃度化合物的DMEM培養(yǎng)液，37°C，5%<:02培養(yǎng)4天，采用MTT比色法檢測細胞毒性。570nmTECANGENiosPro多功能酶標儀測定OD值，計算CC5Q值(50%CytotoxicConcentration)為16.8pM。細胞存活率％=實驗孑LOD值-空白孔OD值對照孔OD值-空白孔OD值表9:化合物X-01對MCF-7細胞毒性xl00%表9:化合物X-01對MCF-7細胞毒性<table>complextableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>權(quán)利要求1、一類噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物，其特征是具有如下的結(jié)構(gòu)式式中R1為o-Ph、p-OMe、m-CO2H、o-CO2Me或8-喹啉；R2為H、m-Ph、p-Ph、m-Bn、o-OMe、m-OMe、m-NO2、β-萘基、p-N-四氫吡咯或8H-茚并[1，2-d]噻唑-2-基。限制條件是當R1為m-CO2H時，R2為m-Ph、p-Ph、m-Bn、o-OMe、m-OMe、m-NO2、β-萘基、p-N-四氫吡咯或8H-茚并[1，2-d]噻唑-2-基；當R1為o-Ph、p-OMe、o-CO2Me或8-喹啉時，R2為H。2、一種噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物用于制備Bcl-2家族蛋白的小分子抑制劑和抗腫瘤藥物的應(yīng)用，所述的噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物具有如下的結(jié)構(gòu)式<formula>seeoriginaldocumentpage2</formula>式中R1為H，m-Me，p-Me，o-Ph，p-F，o-Cl，m-Cl，p-Cl,p-Br，m-OH，p-OMe，p-OEt，m-CH2OH，o-C02H，m-C02H，；p-C02H，o-C02Me，p-CONH2，p-S03H，pS02NH2，p-NMeCOMe，3,4-二氯，2，4,6-三溴或8-喹啉；R2為H，p-Me，m-Ph，；m-Ph，m-Bn，o-OMe，w-OMe，p-OMe，p-Br，m-N02，β-萘基，p-N-四氫吡咯或8H-茚并[l,2-d]噻唑-2-基。3、如權(quán)利要求2所述的一類噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物的應(yīng)用，其特征是所述的Bc1-2家族蛋白是Bc1-xl、Bcl-2或Mcl-l。全文摘要本發(fā)明公開了一類噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物及其制備Bcl-2家族蛋白的小分子抑制劑和抗腫瘤藥物的應(yīng)用，本發(fā)明的噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物具有如上的結(jié)構(gòu)式，該噻唑聯(lián)吡唑酮類化合物具有微摩爾級的抑制Bcl-x_L與天然底物多肽(BidBH3多肽)結(jié)合的活性，可作為Bcl-2家族蛋白的小分子抑制劑，抑制其抗凋亡活性；而且該類化合物對人乳腺癌MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞顯示出一定的抑制活性，有望開發(fā)成為靶向Bcl-2家族蛋白的抗腫瘤藥物。文檔編號C07D417/00GK101343268SQ200810041909公開日2009年1月14日申請日期2008年8月20日優(yōu)先權(quán)日2008年8月20日發(fā)明者周炳城,威孫,張興龍,朱翠俠,勛李,李雯雯,王任小,石志敏,馬大為申請人:中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所