乳腺癌生物分子標(biāo)志物lass2蛋白,其修飾產(chǎn)物和藥物組合物的制作方法

專利名稱：：乳腺癌生物分子標(biāo)志物lass2蛋白,其修飾產(chǎn)物和藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蛋白，具體地說關(guān)于一種乳腺癌生物分子標(biāo)志物L(fēng)ASS2蛋白，其修飾產(chǎn)物和藥物組合物。技術(shù)背景乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，在過去的20年間，世界乳腺癌的發(fā)病率幾乎翻倍。近年來乳腺癌在中國，尤其是發(fā)達(dá)地區(qū)的發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長的趨勢，已躍居女性惡性腫瘤發(fā)病率之首，嚴(yán)重危害廣大婦女的健康。在乳腺癌的治療中，篩選出高?；颊哌M(jìn)行相應(yīng)的放療和化療，會(huì)使治療更加有的放矢。目前乳腺癌的診斷主要是基于體檢、鉬靶X線攝片、核磁共振、B超和病理診斷。這些物理檢査手段能夠從不同角度、不同側(cè)面對(duì)腫瘤進(jìn)行檢測，但各有局限性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在分子水平上發(fā)現(xiàn)了基因結(jié)構(gòu)和功能的改變以及具有一定生物功能的基因產(chǎn)物非正常表達(dá)，均與腫瘤的發(fā)生或存在有關(guān)，可作為腫瘤生物分子標(biāo)志物。腫瘤生物分子標(biāo)志物在腫瘤的早期篩査、出現(xiàn)腫瘤癥狀或可疑腫物后的鑒別診斷、疾病發(fā)展階段和療效觀察和判斷預(yù)后上有非常重要的價(jià)值和臨床意義。目前臨床廣泛應(yīng)用的預(yù)后指標(biāo)如下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、原發(fā)腫瘤大小、組織學(xué)分型及分級(jí)、年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、類固醇受體等。進(jìn)行乳腺癌預(yù)測和診斷的生物分子標(biāo)志物有組織生物分子標(biāo)志物和血清生物分子標(biāo)志物(Nofech-MozesS，et.Al.,AdvAnatPathol2005;12(5):256-264.)。目前乳腺癌的組織生物分子標(biāo)志物主要用于診斷和治療方案選擇。雌激素受體(estrogenreceptor,ER)禾口孕酮受體(progesteronereceptor,PR)的檢測用于判斷激素治療方法是否有效。Her-2基因在15-30%的浸潤性乳腺癌中高表達(dá)，目前檢測Her-2的表達(dá)水平主要用于診斷和治療效果預(yù)測(Herc印tin治療，內(nèi)分泌治療和化療)。uPA和PAI-l也用于乳腺癌的診斷，特別是淋巴結(jié)陰性的乳腺癌。乳腺癌血清生物分子標(biāo)志物有粘液素糖蛋白的MUC-l家族成員(例如CA15.3，BR27.29，MCA，CA549等)，癌胚抗原(CEA)等。雖然這些乳腺癌生物分子標(biāo)志物在臨床上已經(jīng)采用，但是檢測靈敏度和特異性不強(qiáng)，有些標(biāo)志物僅僅適用于某些亞型。在中國專利申請(qǐng)?zhí)?00480033043.4，公開了一種分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記可用于預(yù)測癌癥、特別是乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的診斷，但采用該分子標(biāo)記方法繁瑣，且靈敏度差。總之，雖然已經(jīng)有一些乳腺癌生物分子標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，但是這些指標(biāo)遠(yuǎn)不能滿足臨床的需要，因此迫切需要發(fā)展新的生物分子標(biāo)志物對(duì)乳腺癌進(jìn)行早期診斷和預(yù)后分析。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的如下(1)提供一種乳腺癌生物分子標(biāo)志物L(fēng)ASS2蛋白；(2)提供一種乳腺癌生物分子標(biāo)志物L(fēng)ASS2蛋白修飾產(chǎn)物；(3)提供一種乳腺癌生物分子標(biāo)志物L(fēng)ASS2蛋白及其修飾產(chǎn)物在制備診斷試劑，治療或預(yù)防乳腺癌的藥物中的應(yīng)用；(4)提供一種檢測LASS2蛋白的試劑盒；(5)提供一種靶向于LASS2蛋白的造影劑；(6)提供一種靶向于LASS2蛋白的化學(xué)藥物；(7)提供一種靶向于LASS2蛋白的基因藥物。在本發(fā)明中，術(shù)語"LASS2基因"指具有酵母LAG1同源的人類長壽保障新基因(LAG1longevityassurancehomolog2，LASS2)基因序列的基因。在本發(fā)明中，術(shù)語"LASS2蛋白"指具有LASS2基因所表達(dá)蛋白氨基酸序列的蛋白。"LASS蛋白的修飾產(chǎn)物"指具有LASS2基因所表達(dá)蛋白氨基酸序列的蛋白前體的修飾產(chǎn)物，修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，這種修飾可以通過將蛋白暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸化絲氨酸，磷酸化蘇氨酸)的序列。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，利用高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)的先鋒性技術(shù)_—大規(guī)模平行信號(hào)測序(massivelyparallelsignaturesequencing,MPSS)技術(shù)對(duì)正常乳腺組織和乳腺癌組織的基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行測序，對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)酵母LAG1同源的人類長壽保障新基因(LAG1longevityassurancehomolog2，LASS2基因)在正常乳腺和乳腺癌中有明顯的差異表達(dá)。酵母LAG1同源的人類長壽保障新基因(LASS2基因)是2001年被克隆和鑒定的一個(gè)新基因，位于人染色體lqll的位置(PanH，etal.，Genomics2001:77(1-2):58-64)。該基因在人的肝和腎中高表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物為LASS2蛋白，該蛋白為一種膜蛋白，與多種膜蛋白受體有特異性相互作用，可能與細(xì)胞的生長、調(diào)控相關(guān)。該基因和相應(yīng)表達(dá)的蛋白與乳腺癌的相關(guān)研究目前還未見報(bào)道。本發(fā)明進(jìn)一步研究該新基因表達(dá)的蛋白LASS2蛋白在正常乳腺組織和乳腺癌組織之間的表達(dá)差異，提出將其作為乳腺癌生物分子標(biāo)志物及其在乳腺癌臨床診斷和乳腺癌靶向藥物治療中的應(yīng)用。本發(fā)明在此研究基礎(chǔ)上完成。用免疫組織化學(xué)方法對(duì)72例正常乳腺組織、癌旁乳腺組織和不同類型和分化程度的乳腺癌組織進(jìn)行人LASS2蛋白表達(dá)情況的研究，研究結(jié)果表明人LASS2蛋白在多種類型、不同分化程度的乳腺癌組織中高表達(dá)，在癌旁乳腺組織和正常乳腺組織中低表達(dá)或無表達(dá)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種乳腺癌生物分子標(biāo)志物L(fēng)ASS2蛋白，其中LASS2蛋白氨基酸序列如SEQIDN0:1所示，該蛋白在制備診斷試劑，治療性或預(yù)防性乳腺癌藥物中的應(yīng)用。LASS2蛋白修飾產(chǎn)物在制備診斷試劑，治療性或預(yù)防性乳腺癌藥物中的應(yīng)用，其中LASS2蛋白修飾產(chǎn)物是對(duì)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示LASS2蛋白前體化學(xué)衍生、磷酸化修飾、糖修飾的修飾產(chǎn)物。一種檢測LASS2蛋白的試劑盒，該試劑盒包括試劑和酶標(biāo)板，所述的試劑包括抗LASS2蛋白單克隆抗體l-5ml;稀釋液50-200ml;洗滌液300_700ml;顯色劑10-30ml;終止液30-70ml。所述的試劑包括抗LASS2蛋白單克隆抗體lml;含2%牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液的稀釋液100ml;含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液的洗滌液500ml;0.4%3，3'5，5—四甲基聯(lián)苯胺的顯色劑20ml;2%硫酸溶液的終止液50ml。一種靶向于LASS2蛋白的造影劑，該造影劑包括LASS2蛋白的單克隆抗體，造影劑，所述的造影劑選自非離子碘造影劑、離子型碘造影劑或微泡造影劑，非離子碘造影劑選自碘帕醇、碘曲倫，離子型碘造影劑選自泛影葡胺、碘克沙酸，微泡造影劑選擇脂質(zhì)體微泡造影劑。一種耙向于LASS2蛋白的化學(xué)藥物，該藥物包括化學(xué)類藥物，LASS2蛋白的單克隆抗體，化學(xué)類藥物選自化療藥物和抗癌化學(xué)藥物，化療藥物選自MIS0、SR-2508和AK-2123，抗癌化學(xué)藥物選自阿霉素、紫杉醇或羥基喜樹堿，化學(xué)類藥物包括無脂質(zhì)體包裹藥物和脂質(zhì)體包裹藥物，脂質(zhì)體包裹藥物包括藥物及其脂質(zhì)體包裹體。一種耙向于LASS2蛋白的基因藥物，該藥物包括基因類藥物，LASS2蛋白單克隆抗體，基因藥物包括無載體包裹的基因藥物和載體包裹的基因藥物，所述的載體選自病毒載體、脂質(zhì)體載體或聚陽離子載體。本發(fā)明所公開一種乳腺癌生物分子標(biāo)志物L(fēng)ASS2蛋白，其修飾產(chǎn)物和藥物組合物，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在乳腺癌生物分子標(biāo)志物人LASS2蛋白在不同類型和分化程度的乳腺癌組織中有特異性高表達(dá)的發(fā)明，在分子水平上提供了更精確地區(qū)別正常乳腺組織和乳腺癌組織的能力。基于LASS2蛋白建立的乳腺癌臨床診斷方法，能大大提高乳腺癌的診斷準(zhǔn)確率和分辨率，提高早期乳腺癌的發(fā)現(xiàn)率和不同發(fā)展階段乳腺癌的判斷，將大大推進(jìn)乳腺癌早發(fā)現(xiàn)早治療。建立靶向于LASS2蛋白的乳腺癌藥物治療方法，將抗癌藥物集中于腫瘤部位，對(duì)于提高乳腺癌治療藥物的有效性，減少副作用和并發(fā)癥有非常重要的作用。圖1顯示了LASS2蛋白在非特殊性導(dǎo)管癌I期組織中的表達(dá)情況。圖2顯示了LASS2蛋白在非特殊性導(dǎo)管癌II期組織中的表達(dá)情況。圖3顯示了LASS2蛋白在非特殊性導(dǎo)管癌III期組織中的表達(dá)情況。圖4顯示了LASS2蛋白在浸潤性小葉癌組織中的表達(dá)情況。圖5顯示了LASS2蛋白在粘液癌組織中的表達(dá)情況。圖6顯示了LASS2蛋白在乳腺腺病伴導(dǎo)管上皮增生組織中的表達(dá)情況。圖7顯示了LASS2蛋白在癌旁乳腺組織中的表達(dá)情況。圖8顯示了LASS2蛋白在癌旁乳腺腺病中的表達(dá)情況。圖9顯示了LASS2蛋白在正常乳腺組織中的表達(dá)情況。圖IO顯示了LASS2蛋白在正常乳腺腺病中的表達(dá)情況。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的闡述。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的任何限定。實(shí)施例1提供利用免疫組織化學(xué)方法檢測LASS2蛋白在組織中表達(dá)情況的方法，并分析LASS2蛋白在正常乳腺組織、癌旁組織和不同乳腺癌組織中的表達(dá)差異。為了確定LASS2蛋白在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)情況，利用免疫組化技術(shù)對(duì)LASS2蛋白進(jìn)行表達(dá)情況分析。共選取了已確診的24對(duì)乳腺癌組織以及癌旁、正常組織對(duì)照。其中癌組織為腫瘤部位，癌旁組織為距腫瘤部位1.5cm的組織，正常組織為癌旁的遠(yuǎn)端組織，這些組織類型已通過醫(yī)院病理科鑒定。利用LASS2蛋白鼠抗人的單克隆抗體，用免疫組化方法檢測LASS2蛋白表達(dá)水平。實(shí)施方法1.抗體稀釋濃度1:500;2.陰性對(duì)照用一抗稀釋液代替；3.實(shí)驗(yàn)詳細(xì)染色步驟1)60'C烤片30分鐘，常規(guī)脫蠟水化，去離子水洗2次；2)以0.01M擰檬酸鹽緩沖液(CB，p服.0)高溫高壓修復(fù)抗原，冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5分鐘，重復(fù)2次；3)滴加正常非免疫動(dòng)物血清封閉液，室溫15分鐘，甩去多余液體；4)滴加一抗，4匸過夜；5)0.1%吐溫磷酸鹽緩沖液(Tween-PBS)洗5分鐘，重復(fù)3次；6)滴加生物素標(biāo)記第二抗體工作液，37。C孵育15分鐘；7)0.1%吐溫磷酸鹽緩沖液(Tween-PBS)洗5分鐘，重復(fù)3次；8)滴加鏈霉親和素-HRP工作液，37'C孵育15分鐘；9)0.1%吐溫磷酸鹽緩沖液(Tween-PBS)洗5分鐘，重復(fù)3次；10)過氧化物酶底物作用液(DAB)顯色，水洗終止顯色；11)蘇木素復(fù)染、水洗、分化后充分水洗返藍(lán)；12)常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片；免疫組化的結(jié)果表明1)LASS2蛋白在不同的乳腺癌中高表達(dá)，如在非特殊性導(dǎo)管癌(圖3)浸潤性小葉癌(圖4)、粘液癌(圖5)和乳腺腺病伴導(dǎo)管上皮增生(圖6)中高表達(dá)。2)LASS2蛋白的表達(dá)量隨非特殊性導(dǎo)管癌的惡化逐步提高，如圖l，圖2，圖3。3)LASS2蛋白在癌旁乳腺組織(圖7)，癌旁乳腺腺病(圖8)，正常乳腺組織(圖9)和正常乳腺腺病(圖IO)中低表達(dá)或無表達(dá)。4)表1對(duì)72例人乳腺癌組織、癌旁組織和正常乳腺組織中LASS蛋白表達(dá)情況的免疫組化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果的判定方法為，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞的比例判斷陽性染色染色強(qiáng)度為0，無染色；染色強(qiáng)度為l，染色強(qiáng)度弱，細(xì)胞有零星的染色(不超過50%);染色強(qiáng)度為2，染色強(qiáng)度弱，超過50%的細(xì)胞有染色；染色強(qiáng)度為3，染色強(qiáng)度強(qiáng)，細(xì)胞有彌漫性的胞漿染色(不超過50%);染色強(qiáng)度為4，染色強(qiáng)度強(qiáng)，超過50%的細(xì)胞有染色。染色強(qiáng)度為3和4的認(rèn)為是LASS2蛋白表達(dá)陽性。LASS2蛋白在79.2%的乳腺癌組織中表達(dá)陽性，在91.7%的乳腺癌旁組織中表達(dá)陰性，在95.8%的正常乳腺組織中表達(dá)陰性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從研究結(jié)果可以看出，說明LASS2蛋白在乳腺癌組織中具有很好的特異性表達(dá)。LASS2蛋白在24對(duì)乳腺癌組織中的大多數(shù)乳腺癌組織的表達(dá)量都高于癌旁組織和正常組織。由于LASS2蛋白在正常組織和癌旁組織中表達(dá)量很少或者基本沒有表達(dá)，且在乳腺癌組織中特異性表達(dá)，因此可以作為乳腺癌的生物分子標(biāo)志物，作為臨床診斷的指標(biāo)之一。實(shí)施例2提供用免疫印跡(WesternBlot)法檢測LASS2蛋白在組織和體液中的表達(dá)情況；對(duì)于手術(shù)中獲得的組織、血液和尿液等臨床樣品，按照常規(guī)步驟提取總蛋白。按照常規(guī)步驟將提取的總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，然后轉(zhuǎn)印在PVDF膜上。按照常規(guī)步驟用LASS2蛋白單克隆抗體雜交PVDF膜，顯影檢測LASS2蛋白在總蛋白中的表達(dá)。LASS2蛋白在乳腺癌組織和體液中存在，印證了以上免疫組織化學(xué)的發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例3LASS2蛋白單克隆抗體預(yù)包被酶標(biāo)板(條)試劑盒及其應(yīng)用LASS2蛋白單克隆抗體預(yù)包被酶標(biāo)板(條)試劑盒中包括1)LASS2蛋白單克隆抗體預(yù)包被酶標(biāo)板(條)用pH9.6碳酸鹽緩沖液按1:3000-5000的比例稀釋LASS2蛋白單克隆抗體。將酶標(biāo)板每孔中滴加100ul抗體稀釋液，置室溫4小時(shí)。用含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗滌酶標(biāo)板孔3遍，然后每孔加200ul2%牛血清白蛋白。置酶標(biāo)板于37'C2小時(shí)，吹干后放入錫箔袋中真空封上，4'C保存。2)抗LASS2蛋白單克隆抗體lml，用辣根過氧化物酶常規(guī)標(biāo)記。3)稀釋液100ml:含2%牛血清白蛋白(BSA)、磷酸鹽緩沖液(PBS)。4)洗滌液500ml:含0.05%吐溫_20的磷酸鹽緩沖液。5)顯色劑20ml:0.4%3，3，5，5—四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。6)終止液50ml:2%硫酸溶液。利用LASS2蛋白單克隆抗體預(yù)包被酶標(biāo)板(條)試劑盒檢測LASS2蛋白的方法按常規(guī)方法勻漿腫瘤組織，提取腫瘤組織總蛋白。將待測組織總蛋白用樣品稀釋液稀釋4000倍后，加100ul于ELISA板樣品孔中。37"C下放置1小時(shí)。洗滌液洗5遍，加用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗LASS2蛋白單克隆抗體100ul，37'C下反應(yīng)1小時(shí)。用洗滌液洗5遍。每孔加顯色劑lOOul,37'C下反應(yīng)15分鐘。每孔加終止液50ul，于酶標(biāo)儀測各孔的吸光度值。根據(jù)各孔吸光度值的大小，與對(duì)照板吸光度值比較，計(jì)算結(jié)果。實(shí)施例4:靶向造影劑在乳腺癌診斷中的應(yīng)用通過在造影劑上偶聯(lián)腫瘤特異性抗體可以使造影劑具有靶向功能，這能大大提高對(duì)腫瘤診斷的準(zhǔn)確性，為腫瘤的臨床診斷和治療提供必要的手段。目前常用的造影劑有非離子碘造影劑(如碘帕醇、碘曲倫)、離子型碘造影劑(如泛影葡胺、碘克沙酸)和微泡造影劑等。以靶向超聲微泡造影劑在乳腺癌診斷中的應(yīng)用為例。造影劑增強(qiáng)超聲掃描較傳統(tǒng)的彩超能更好地顯示惡性腫瘤血管的特點(diǎn)，提高局部病灶的診斷敏感性，在超聲造影劑上連接LASS2蛋白的單克隆抗體制備成靶向超聲造影劑，在增強(qiáng)檢測信號(hào)的基礎(chǔ)上大大提高了對(duì)乳腺癌檢測的準(zhǔn)確性，能夠?qū)w內(nèi)組織器官微觀病變進(jìn)行分子水平的探測和顯像。使用自制已NHS活化的脂質(zhì)體微泡造影劑，將造影劑與LASS2蛋白的單克隆抗體以按l:l摩爾比混合，4。C孵育2小時(shí)，數(shù)次洗滌、離心，分層后取上浮液，即得連接有攜LASS2蛋白單抗的靶向超聲微泡造影劑，_20°〇保存。將制備好的耙向脂質(zhì)體微泡造影劑lml，加入稀釋后的兔抗山羊FITC-IgG充分混勻，避光室溫反應(yīng)30分鐘，低速離心分層后棄下清，PBS洗滌3次，于光鏡和熒光顯微鏡下觀察微泡的大小、分布和染色情況，以對(duì)制備的靶向脂質(zhì)體的連接效率和質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。在熒光顯微鏡下靶向脂質(zhì)體微泡分布較均勻，發(fā)出明亮的綠色熒光，說明LASS2蛋白單抗成功連接在脂質(zhì)體微泡上。經(jīng)外周靜脈注射靶向型超聲造影劑，通過檢測多普勒信號(hào)，對(duì)乳腺癌的腫瘤血管進(jìn)行分析和診斷。與非靶向超聲造影劑相比，靶向超聲造影劑更多地聚集在腫瘤微血管內(nèi)，超聲信號(hào)強(qiáng)弱與腫瘤內(nèi)血管呈顯著相關(guān)。因此，LASS2蛋白單抗介導(dǎo)的靶向超聲造影技術(shù)能非侵入性地提高乳腺癌的診斷效果。實(shí)施例5:以LASS2蛋白單抗為基礎(chǔ)建立的乳腺癌靶向型化學(xué)藥物制劑靶向制劑是一類能使藥物濃度集于靶器官、靶組織、靶細(xì)胞且療效高、毒副作用小的靶向給藥系統(tǒng)，為第四代藥物劑型，被認(rèn)為是抗癌藥物的適宜劑型。乳腺癌是一種體內(nèi)的惡性疾病，通過靜脈注射靶向型抗癌藥物能將藥物通過體內(nèi)循環(huán)輸送到癌細(xì)胞的表面，使藥物具有藥理活性的專一性，增加藥物對(duì)靶組織的指向性和滯留性，降低藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒性，減少劑量，提高藥物制劑的生物利用度?；瘜W(xué)類藥物可以是化療藥物和化學(xué)藥物。常用的放療藥物有MISO、SR-2508和AK-2123等，有放射增敏作用。常用的化學(xué)類藥物有阿霉素、紫杉醇和羥基喜樹堿等，將放療和化療藥物制備成靶向制劑，能大大提高藥物在腫瘤部位的濃度，提高治療效果并減少并發(fā)癥的發(fā)生。目前通過劑型改進(jìn)，通常對(duì)放療藥物和化學(xué)藥物進(jìn)行脂質(zhì)體包裹，來提高藥物的輸送效率。目前靶向型的放療和化療藥物主要采用在脂質(zhì)體上連接靶向分子來實(shí)現(xiàn)，以化學(xué)藥物阿霉素脂質(zhì)體為例，將LASS2蛋白單克隆抗體連接在阿霉素脂質(zhì)體上作為"彈頭"，可以實(shí)現(xiàn)乳腺癌的靶向藥物輸送。將氫化卵磷脂(冊(cè)PC)、膽固醇(Chol)、聚乙二醇-硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)、N-戊二酰硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-NG)(2:1:0.2:0.2，摩爾比)溶于氯仿，4(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成透明薄膜，加入O.120mol(順4)2304溶液適量，漩渦震蕩使脂膜完全脫落，6(TC攪拌lh使水化完全，60'C浴式超聲30min，得到長循環(huán)脂質(zhì)體。將制備的脂質(zhì)體按N-羥基磺基琥珀酰亞胺(S-NHS)與脂質(zhì)摩爾比10:1加入，室溫反應(yīng)10min，加入LASS2蛋白單克隆抗體，4'C攪拌過夜。次曰以層析柱分離，收集脂質(zhì)體部分，得到LASS2蛋白單抗修飾的長循環(huán)脂質(zhì)體。將LASS2蛋白單抗修飾的脂質(zhì)體與阿霉素(ADM)按20:1混合，6(TC溫育30min，得到載有阿霉素的靶向型脂質(zhì)體。制備的靶向型阿霉素脂質(zhì)體的包封率為87%。通過靜脈注射的方式，將連接有LASS2蛋白單抗的阿霉素脂質(zhì)體注射入小鼠乳腺癌模型，通過觀察腫瘤的大小變化考察靶向型阿霉素脂質(zhì)體的藥效。和沒有連接LASS2蛋白單抗的阿霉素脂質(zhì)體相比,連接有LASS2單抗的阿霉素脂質(zhì)體能高效、特異性地殺死乳腺癌細(xì)胞。實(shí)施例6:以LASS2蛋白單抗為基礎(chǔ)建立的乳腺癌靶向基因藥物制劑基因藥物通過將取代、修復(fù)有問題的基因或者表達(dá)需要的蛋白而起到治療的作用，對(duì)于目前難以治療的重大疾病有特效。在腫瘤治療領(lǐng)域，制備靶向型的基因藥物能實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性識(shí)別與攻擊，從而攻克癌癥治療的關(guān)鍵障礙。目前在研究中的基因藥物，為了提高基因藥物的輸送效率，往往采用載體對(duì)基因藥物進(jìn)行包裝。常用的載體技術(shù)有病毒載體、脂質(zhì)體載體和聚陽離子載體。耙向性的基因藥物制劑往往是在載體上裝配靶向分子來實(shí)現(xiàn)靶向基因藥物的輸送。以常用的聚陽離子載體聚賴氨酸為例，將LASS2蛋白的單克隆抗體連接在聚賴氨酸上形成靶向性載體，用該載體包裝基因藥物形成靶向型基因，提高對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的基因藥物輸送效率。LASS2蛋白單克隆抗體溶液(pH7.2，50mM磷酸鹽緩沖液，5mMEDTA)用e-巰基乙胺(反應(yīng)摩爾比為e-巰基乙胺LASS2蛋白單克隆抗體=2:1)25。C活化90分鐘，然后用除鹽柱脫鹽，同時(shí)除去未反應(yīng)的e-巰基乙胺。在聚賴氨酸(PLL)溶液中(pH7.2，50mM磷酸緩沖液，5mMEDTA)中加入異雙功能基團(tuán)化合物SMCC作為連接劑(PLL:SMC04:1)，在25。C中反應(yīng)30分鐘形成PLL-tnaleimide，反應(yīng)產(chǎn)物用脫鹽柱脫鹽(脫鹽柱填充S印hadexTMG-25)。將活化的LASS2蛋白單克隆抗體溶液和PLL-maleimide混合，在4。C時(shí)反應(yīng)過夜，最后合成修飾有LASS2蛋白單克隆抗體的PLL基因載體，將產(chǎn)物透析純化(截至分子量為10000道爾頓)，凍干保存。將熒光素酶報(bào)告基因和修飾有LASS2蛋白單克隆抗體的PLL基因載體混合(pH7.2，50mM磷酸鹽緩沖液，按電荷比1:1混合)，形成DNA復(fù)合物，對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，用熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒，以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶的表達(dá)量。與沒有LASS2蛋白單克隆抗體修飾的DNA復(fù)合物相比，修飾有LASS2蛋白單克隆抗體的DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率高12倍，說明LASS2蛋白單克隆抗體介導(dǎo)的靶向型的基因輸送系統(tǒng)大大提高基因藥物輸送的定向性。SEQUENCELISTING〈110〉上海交通大學(xué)〈120〉乳腺癌生物分子標(biāo)志物L(fēng)ASS2蛋白，其修飾產(chǎn)物和藥物組合物〈130〉/<160〉1<170〉Patentlnversion3.1<210〉1〈211〉380〈212〉PRT<213>智人<400〉1MetLeu1Pro(Homosapiens)GinThrLeuTyrAspTyrPheTrpTrpGluArgLeuTrpLeuValAsnTyrAlaPheAla65AsnLeu50AlaLys35lieLeu20Ala5ThrTrpAlaAspSerAspLeuValArgTyrLeuLeuAsnAlaThrLeuGinValGluGinValLeulie145TyrLeu130AlaGlu115LysVal100Glu85Glulie70HisPhelieAlaGly150Phe55LysLysPheArgGlu135MetTyr40PheTrpPheArgArg120AlaLeu25lieLeuLeuSerArg105Arg10GluAspArgAspThrLeuProGluLeuTyrGluLysThrPheTyrLeuThr90GinArg75SerAlaVallieVal155Val60LeuSerTrpArgPhe140AspLeu45AlaGly30AlaSerGlyLeuArgAsnGinAsp125ThrSer110Arg15ArgArgAlaProGlyLysGinPro95GlyAspMetLysLysValTrpGluGlyTyrProlieGinSerThrValLeuLeuThrProLeuPro80LysArgProSerPheTyrLeuLysProTrpPhe160lie165TrpTyrTyrMetProSerGinTyr180LeuLeuPheSerlieAlaSerAsp195200lieHisHisValAlaThrlielie170lieGluLeuSerPhe185ValLysArgLys175TrpSerTyr190PheLysGluGinAla215AlaGlyThrLeuArg230LeuGluSerlie210PheAlaAsnTyrlie225SerSerAspTyrLeu245TrpLysAsnThrCys260lielieThrArgLeuVallieLeu275280TyrProLeuGluLeuTyrProAlaAsp205SerPheSerTrpLeulie220lieMetAlaLeuHis235MetPheAsnTyrAsp240GlyPheLeuVal290PheAsnSerMetMet305TyrLeulieLeuArg325GluAspGluArgSer340AlaGlyGlyGlyAlaLysMetPheAsnTyrAla250255AsnAsnliePhelieValPheAlalieVal265270ProPheTrplieLeuHisCysThr285GlyTyrTyrPheLeu295ValPhePhe300GlyValLeuGinLeuLeuHisliePheTrp310315MetAlaHisLysPhelieThrGlyLysGluAlaAla355HisProlieLeuAsnAsn370LysPhe330AspArgGluGluThrGluSerSer345LysSerArgProLeu335GlyAla320ValGluAsn375Ala360HisArgLysLeu365Glu350AlaAsnGlyAsnAsp380權(quán)利要求1、一種乳腺癌生物分子標(biāo)志物L(fēng)ASS2蛋白，其中LASS2蛋白氨基酸序列如SEQIDNO1所示。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的LASS2蛋白，其特征在于該蛋白在制備診斷試劑，治療性或預(yù)防性乳腺癌藥物中的應(yīng)用。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的LASS2蛋白，其特征在于該蛋白修飾產(chǎn)物在制備診斷試劑，治療性或預(yù)防性乳腺癌藥物中的應(yīng)用，其中LASS2蛋白修飾產(chǎn)物是對(duì)氨基酸序列如SEQIDN0:1所示LASS2蛋白前體化學(xué)衍生、磷酸化修飾、糖修飾的修飾產(chǎn)物。4、一種檢測權(quán)利要求1所述的LASS2蛋白的試劑盒，該試劑盒包括試劑和酶標(biāo)板，所述的試劑包括抗LASS2蛋白單克隆抗體l-5ml;稀釋液50-200ml;洗滌液300-700ml;顯色劑10-30ml;終止液30-70ml。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，該試劑盒包括試劑和酶標(biāo)板，所述的試劑包括抗LASS2蛋白單克隆抗體lml;含2%牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液的稀釋液100ml;含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液的洗滌液500ml;0.4%3，3'5，5—四甲基聯(lián)苯胺的顯色劑20ml;2%硫酸溶液的終止液50ml。6、一種耙向于權(quán)利要求1所述的LASS2蛋白的造影劑，該造影劑包括LASS2蛋白的單克隆抗體，造影劑，所述的造影劑選自非離子碘造影劑、離子型碘造影劑或微泡造影劑。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的造影劑，其特征在于非離子碘造影劑選自碘帕醇、碘曲倫，離子型碘造影劑選自泛影葡胺、碘克沙酸，微泡造影劑選自脂質(zhì)體微泡造影劑。8、一種靶向于權(quán)利要求1所述的LASS2蛋白的化學(xué)藥物，該藥物包括LASS2蛋白單克隆抗體，化學(xué)類藥物。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的化學(xué)藥物，其特征在于化學(xué)類藥物選自化療藥物和抗癌化學(xué)藥物，化療藥物選自MISO、SR-2508和AK-2123，抗癌化學(xué)藥物選自阿霉素、紫杉醇或羥基喜樹堿，化學(xué)類藥物包括非脂質(zhì)體包裹藥物和脂質(zhì)體包裹藥物。10、一種靶向于權(quán)利要求1所述的LASS2蛋白的基因藥物，該藥物包括基因類藥物，LASS2蛋白單克隆抗體。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的基因藥物，其特征在于基因類藥物包括無載體包裹的基因藥物和載體包裹的基因藥物，所述的載體選自病毒載體、脂質(zhì)體載體或聚陽離子載體。全文摘要本發(fā)明涉及一種蛋白，具體地說關(guān)于一種乳腺癌生物分子標(biāo)志物L(fēng)ASS2蛋白，其修飾產(chǎn)物和藥物組合物。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種乳腺癌生物分子標(biāo)志物L(fēng)ASS2蛋白，其中LASS2蛋白氨基酸序列如SEQIDNO1所示，該乳腺癌生物分子標(biāo)志物在制備診斷試劑，治療性或預(yù)防性乳腺癌藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在乳腺癌生物分子標(biāo)志物人LASS2蛋白在不同類型和分化程度的乳腺癌組織中有特異性高表達(dá)的發(fā)明，對(duì)于建立新的乳腺癌臨床診斷方法，以及建立新的受體介導(dǎo)的乳腺癌靶向藥物治療方法有非常重要的作用。文檔編號(hào)C07K1/107GK101240020SQ20081003456公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2008年3月13日優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日發(fā)明者徐學(xué)敏,林標(biāo)揚(yáng),妍郭申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)