專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種具有降血糖生物活性的苦瓜多肽基因工程制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程，具體涉及一種具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP的基因工程制備方法及其在制備防治糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病是現(xiàn)代社會(huì)對(duì)人類(lèi)威脅最大的疾病之一，患者呈逐年增加的趨勢(shì)。目前臨床除了靜脈注射胰島素外還主要應(yīng)用四類(lèi)口服降血糖藥物，它們是磺脲類(lèi)、雙胍類(lèi)、葡萄糖苷酶抑制劑和噻唑烷酮類(lèi)。這些口服化學(xué)類(lèi)降糖藥物會(huì)引起耐藥性，乳酸中毒和肝損傷等一系列毒副作用，而采用注射胰島素療往往給患者造成很多不便，因此迫切需要一種使用方便、療效好、副作用小、可長(zhǎng)期安全使用的治療新藥。苦瓜是東南亞國(guó)家的一種傳統(tǒng)植物藥材，經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都表明其具有顯著的降血糖活性，并且能夠緩和和減輕糖尿病引起的并發(fā)癥。(KathyAbascal等Alternative&ComplementaryTherapies,(2005)，179-184)同時(shí)在攝入正常劑量的情況下，不會(huì)引起任何的肝、腎毒性。(J.K.Grover等JournalofEthnophamacology,93(2004)123-132)Khanna等在1979年從苦瓜中分離出具有類(lèi)胰島素活性的多肽P具有顯著的降糖效果。(PushpaKhanna等JournalofNaturalProducts,44(6)，1979,648-654)其后研究者又從苦瓜中陸續(xù)分離出多種物質(zhì)，包括甙類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)等都具有顯著的降血糖效果。由于苦瓜中降血糖活性成分種類(lèi)多樣，作用方式呈多方位多靶點(diǎn)，而其單個(gè)活性組分含量較低。因此如何大量提供和生產(chǎn)這些活性組分舉作為藥品開(kāi)發(fā)需要解決的問(wèn)題。應(yīng)用現(xiàn)代生物工程技術(shù)將具有降血糖生物活性多肽在生物工程菌中高效表達(dá)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)是解決問(wèn)題的有效途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于應(yīng)用基因工程的方法，克隆目的蛋白基因，在工程菌中高效表達(dá)、純化和功能鑒定具有降血糖生物活性的苦瓜多肽。本發(fā)明提供一種發(fā)酵生產(chǎn)具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP的方法。該方法是按照苦瓜中已經(jīng)公開(kāi)的降血糖活性多肽的氨基酸序列，根據(jù)工程菌偏愛(ài)的密碼子特性，人工化學(xué)合成相應(yīng)的核苷酸序列，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，在適當(dāng)條件下誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的蛋白用親和層析介質(zhì)純化，將純化的目的蛋白透析去鹽，冷凍干燥。本發(fā)明方法包括下列步驟(1)PCR法合成兩端帶有限制性酶切位點(diǎn)的有如SEQID:1寡核苷酸序列的具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP核苷酸編碼序列，并進(jìn)一步優(yōu)化為SEQID:2;(2)將步驟(1)中得到的核苷酸序列連結(jié)到表達(dá)載體中，得到重組表達(dá)載體；(3)將步驟(2)中得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主中，并在表達(dá)步驟(1)中所述的核苷酸編碼序列的KGP的條件下，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)從步驟(3)培養(yǎng)的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中和細(xì)胞內(nèi)回收并純化表達(dá)產(chǎn)物具有降血糖生物活性的苦瓜多肽。所述步驟(1)限制性酶切位點(diǎn)N端是BamHI酶切位點(diǎn)，C端是HindIII酶切位點(diǎn)。采用的生物工程菌為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、面包酵母或畢赤酵母。步驟(2)表達(dá)載體是攜帶T7/T5啟動(dòng)子的pET/pQE質(zhì)粒及其衍生物。具體表達(dá)載體是pET32a/pQE8。步驟(3)的大腸桿菌宿主是大腸桿菌BL21(DE3)/M15細(xì)胞系。步驟(4)的回收并純化采用鎳柱親和純化。本發(fā)明的具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP核苷酸編碼序列是指從SEQID:2核酸序列的第21個(gè)堿基至第75個(gè)堿基。其中的KGP核苷酸編碼序列是從SEQID:2的第23位，第35位的密碼子為A;第29位，第38位的密碼子為T(mén);第68位和第71位的密碼子為A和G中的一種。根據(jù)本發(fā)明，首先依據(jù)已公開(kāi)的苦瓜降糖活性多肽序列如SEQID:3序列，根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子，提供了人工設(shè)計(jì)合成帶有BamHI酶切位點(diǎn)和HindIII酶切位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQID:1序列。經(jīng)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增(實(shí)施例1)和雙酶切反應(yīng)(實(shí)施例2)后連接到pET32a或者pQE8表達(dá)載體上，從而得到重組表達(dá)載體。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主BL21或者M(jìn)15，于37i:在LB+抗生素的培養(yǎng)基中加入0.4mMIPTG(異丙基-P-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，重組表達(dá)得到的表達(dá)產(chǎn)物具有降血糖生物活性的苦瓜多肽N端帶有多個(gè)(至少5個(gè))連續(xù)的組氨酸，最優(yōu)方案采用鎳柱親和洗脫的方式分離純化表達(dá)產(chǎn)物，步驟少，純度高，活性損失小。按照本發(fā)明，融合表達(dá)的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽和非融合表達(dá)的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽均具有顯著的降血糖效應(yīng)(pO.01或p0.05)，采用pET32a和pQE8表達(dá)載體表達(dá)該活性多肽對(duì)其活性基本沒(méi)有影響。pET和pQE載體其他的衍生物均可用于該多肽的表達(dá)。本發(fā)明的另一目的提供了上述具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP在制備防治糖尿病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人將上述具有降血糖生物活性的苦瓜多肽用生理鹽水配置成高、中、低三個(gè)劑量的溶液對(duì)糖尿病模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行靜脈注射，測(cè)定不同給藥時(shí)間動(dòng)物血糖值，以正常組和模型對(duì)照組做參比，確定該苦瓜降糖活性多肽蛋白具有明顯的降血糖作用。本發(fā)明人用PCR、雙酶切和DNA系列測(cè)定表明該具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核酸序列約80bp已經(jīng)整合到表達(dá)載體質(zhì)粒上，SDS-PAGE凝膠電泳圖表明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在預(yù)測(cè)的目的蛋白分子量大小處有新的蛋白出現(xiàn)，親和層析后的樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)表現(xiàn)為一條單一的條帶。純化的目的蛋白苦瓜降糖活性多肽的藥理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，與模型對(duì)照組比較，兩種表達(dá)載體表達(dá)的蛋白苦瓜降糖活性多肽，在靜脈給藥4小時(shí)后均能顯著降低四氧嘧啶糖尿病動(dòng)物模型組血糖值，其中表達(dá)載體C血糖值p0.05，表達(dá)載體D血糖值pO.Ol，證明目的蛋白苦瓜降糖活性多肽具有明顯的降血糖作用。表l不同受試藥物對(duì)四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖值的影響(n=10，組別劑量體重測(cè)得血糖值(mmol/L)(mg/kg)(g)給藥后0.5h給藥后2h給藥后4h正常對(duì)照組-25.17±1.066.89土0.76A厶6.25士0.96AA5.84士0.82AA模型對(duì)照組-23.83±2.2124.62±1.99**22.38±2.61**20.98±2.53**二甲雙胍組125025.80士2.62厶16.32±2.58**厶厶8.44士3.69AA5.80士4.02A厶c空載體組25.61±1.6825.05±3.67**23.75±4.14**20.59±4.33**c高劑量組2023.98±3.0825.66±1.72**22.98±2.20**17.08±3.06**厶c中劑量組1025.00±2.6724.32±2.41**22.53±2.92**16.75±5.63**厶c低劑量組524.65±1.5123.58±2.56**21.84±1.87**18.02±4.71**D高劑量組4.325.00±2.3024.06±1.46**22.47±2.33**18.20±4.80**D中劑量組2.123.99±2.0624.76±2.44**22.88±2.61**19.49±4.52**D低劑量組124.86±2.1222.87±3.05**21.26±3.02**14.77±4.54**厶厶注**表示與正常對(duì)照組比較，P〈0.01;A表示與模型對(duì)照組比較，P〈0.05;AA表示與模型對(duì)照組比較，P<0.01。其中C為pET32a重組表達(dá)載體，D為pQE8重組表達(dá)載體。通過(guò)生物工程技術(shù)，利用基因工程菌大量生產(chǎn)苦瓜中具有降血糖活性的多肽KGP，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其降血糖生物學(xué)活性在細(xì)菌中仍然存在，能夠顯著降低糖尿病模型動(dòng)物的血糖值，并且維持較長(zhǎng)的作用時(shí)間。為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供有效的途徑。以細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)植物活性多肽的方法，具有生長(zhǎng)迅速、成本低廉、純化工藝簡(jiǎn)單、易于擴(kuò)大培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)。序列說(shuō)明SEQID:1，SEQID:2序列中所用的堿基符號(hào)含義如下R=A或G;Y=C或T;H=A，C或T;N=A，C，G或TA:腺嘌呤核苷G:鳥(niǎo)嘌呤核苷C:胞嘧啶核苷T:胸腺嘧啶核苷?qǐng)D1目的蛋白不同誘導(dǎo)時(shí)間的12%SDS-PAGE凝膠電泳圖泳道1:加入0.4mMIPTG誘導(dǎo)4h后分離的包涵體；泳道2:加入0.4mMIPTG誘導(dǎo)2h后分離的包涵體；泳道3:加入0.4mMIPTG誘導(dǎo)0.5h后分離的包涵體；泳道4:加入0.4mMIPTG誘導(dǎo)0h后分離的包涵體；泳道5:分子量標(biāo)準(zhǔn)品；泳道6:加入0.4mMIPTG誘導(dǎo)4h后的細(xì)胞裂解液；泳道7:加入0.4mMIPTG誘導(dǎo)2h后的細(xì)胞裂解液；泳道8:加入0.4mMIPTG誘導(dǎo)0.5h后的細(xì)胞裂解液；泳道9:加入0.4mMIPTG誘導(dǎo)Oh后的細(xì)胞裂解液。圖2過(guò)親和層析柱(Ni-NTA)后樣品的12%SDS-PAGE凝膠電泳圖泳道1:洗脫液(elutebuffer)洗脫第三次收集的溶液；泳道2:洗脫液(elutebuffer)洗脫第二次收集的溶液；泳道3:洗脫液(elutebuffer)洗脫第一次收集的溶液；泳道4:洗滌液(washbuffer)洗脫第二次收集的溶液；泳道5:洗滌液(washbuffer)洗脫第一次收集的溶液；泳道6:細(xì)胞裂解液經(jīng)過(guò)Ni-NTA柱后剩余溶液；泳道7:細(xì)胞裂解液；泳道8:分子量標(biāo)準(zhǔn)品。具體實(shí)施方式實(shí)施例lPCR法得到具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP核苷酸序列片段根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的有如SEQID:3多肽序列的苦瓜降血糖活性多肽KGP氨基酸序列，按照生物工程菌偏愛(ài)的密碼子設(shè)計(jì)并人工化學(xué)合成兩端帶有酶切位點(diǎn)的核苷酸序列，以該序列為模板，用核苷酸序列兩端15-35bp的片段(包括酶切位點(diǎn))合成引物，PCR反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>72°C5minPCR產(chǎn)物經(jīng)1.0-2.5。/。瓊脂糖電泳檢測(cè)分離，切下苦瓜降糖活性多肽目的條帶，用膠回收試劑盒純化，克隆到中間pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，經(jīng)PCR鑒定后選擇陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序，鑒定序列順序正確。實(shí)施例2表達(dá)載體(pET32a-KGP/pQE8-KGP)的構(gòu)建用相應(yīng)的酶切位點(diǎn)分別消化鑒定序列正確的召的基因PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET32a/pQE8，酶切體系如下回收的PCR產(chǎn)物43pl10x緩沖液5pl酶11^1合計(jì)50ul37°C酶切l(wèi)-4h用膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。抽提表達(dá)質(zhì)粒方法如下(1)從平板上挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有5mlLB(Amp+)液體培養(yǎng)基的試管中，于37。C劇烈振搖培養(yǎng)1620h，搖床速度為250卬m;(2)取菌液于離心管中4X:，12000rpm離心30s，棄上清液，干燥沉淀；(3)將細(xì)菌沉淀重懸于10(^1用冰預(yù)冷的溶液I中，冰上放置10min;(4)加入溶液II200W，快速顛倒5次，置于冰上；(5)加入溶液III150i:i1，振蕩10s，冰浴1015fnin;(6)4。C，12000rpm離心5min，取上清液于另一試管中；(7)加入等量的酚氯仿(1:1),振蕩混合，于4。C,12000rpm離心2min;(8)取上清液于另一試管中，加入200嗎/mlRNA酶5^1在37。C30min后加入等量的氯仿異戊醇(24:1)混合，于4r,12000卬m離心2min;(9)取上清液于另一試管中后加入2倍體積的乙醇，振蕩混合，一2(TC放置30min;后4°C以12000rpm離心5min，棄上清液；(10)用lml70%乙醇洗滌振蕩，于4°C,12000rpm離心5min;(11)棄上清，倒置約30min使其干燥；(12)加入1050ul的水溶解，置于冰箱中備用。其中溶液I，II，III配方按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》附錄l:1579-1580。酶切消化載體，體系如下'<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>37'C酶切l(wèi)-4h用膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。載體和具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP目的基因的連接連接體系IOX連接酶緩沖液2^1酶切回收后的載體大片段2^1酶切后的苦瓜降糖活性多肽目的基因片段T4DNA連接酶_M合計(jì)20^122'C連接0.5-4個(gè)小時(shí)，將連接反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a菌株中，挑取單菌落，在裝有l(wèi)mlLB+抗生素的1.5ml離心管中37'C培養(yǎng)810h。將每管進(jìn)行編號(hào)，每管取50^11培養(yǎng)物，用作模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。剩余95(^1培養(yǎng)物保存于4"C。電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物，抽提重組質(zhì)粒并雙酶切鑒定，選擇陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序，進(jìn)一步確證苦瓜降糖活性多肽目的基因己正確插入到載體中。證明表達(dá)載體構(gòu)建成功。實(shí)施例3具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP目的蛋白的表達(dá)抽提重組質(zhì)粒pET32a-KGP/pQE8-KGP,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化相應(yīng)表達(dá)菌株BL21/M15。隨機(jī)挑取長(zhǎng)出的單菌落，在LB+Amp/Kan(氨芐青霉素/卡那青霉素)(100mg/ml)的液體培養(yǎng)基37'C培養(yǎng)過(guò)夜，吸取50^1，然后煮沸5min，2000rpm離心lmin，取上清為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)重組子。將PCR陽(yáng)性的重組菌接種于1.5ml的LB+Amp/Kan(100mg/ml)的液體培養(yǎng)基中。另外接種一份培養(yǎng)物作為未誘導(dǎo)的對(duì)照。37。C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。再?gòu)倪^(guò)夜培養(yǎng)物中各取500pl接種到100ml預(yù)熱的LB培養(yǎng)液(加入抗生素)中，37'C振蕩培養(yǎng)至吸光度OD6oo為0.3-0.9。在菌液中加入IPTG，分幾種終濃度(0.1-2.5mM)，篩選最佳誘導(dǎo)濃度，誘導(dǎo)表達(dá)，分別在lh、2h、3h、4h、5h、6h取出lml菌液，12000rpm離心2分鐘收集菌體，棄上清。細(xì)菌沉淀用100lU1X裂解液(lysisbuffer)(PBS或STE)懸浮，超聲破碎，IO(TC加熱5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。對(duì)照也用同樣的方法處理。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物隨著時(shí)間的變化情況。SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物1)在一個(gè)三角瓶中配制分離膠溶液(12%)。依次混合各成分，加入TEMED(N，N,N'，N'-四甲基乙二胺)后，迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液。在丙烯酰胺溶液上覆蓋一層水。放置于室溫下至凝膠完全聚合。2)分離膠聚合完全后，傾出覆蓋的水，用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的丙烯酰胺。用紙巾吸凈殘留液體。3)配制濃縮膠，在已聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠液體中插入干凈的梳子。放置于室溫下凝固。4)濃縮膠聚合完全后，小心移出梳子，用去離子水洗滌加樣槽以除去未聚合的丙烯酰胺。加樣，每樣品加2(Htl。5)將電泳裝置與電源相接(正極接下槽)，凝膠上所加電壓為8V/cm。當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15V/cm。6)電泳結(jié)束后，取出凝膠，放于染色液(甲醇:水:冰乙酸=4.5:4.5:1，加0.25g考馬斯亮藍(lán))中染色過(guò)夜。7)用脫色液(甲醇:水:冰乙酸=4.5:4.5:1)脫色至蛋白條帶清晰沒(méi)有背景為止。注對(duì)于不同的表達(dá)載體為了檢測(cè)表達(dá)蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP可以適當(dāng)?shù)奶岣叻蛛x膠的濃度12%-15%。電泳結(jié)果顯示在預(yù)測(cè)的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP目的蛋白分子量大小處有新的蛋白出現(xiàn)，而對(duì)照沒(méi)有，證明具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP目的蛋白成功表達(dá)，并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加蛋白表達(dá)量也增加。實(shí)施例2和3的(1)LB培養(yǎng)基組成(g/L)胰化蛋白胨10酵母提取物5NaCl10調(diào)pH值至7.0后高壓滅菌(2)12%濃度分離膠的配方水3.3ml30%丙烯酰胺溶液4.0ml1.5mMTris(pH8.8)2.5ml腦SDS0.1ml10%過(guò)硫酸銨0.1mlTEMED0.004ml(3)濃縮膠的配方水3.4ml30°/。丙烯酰胺溶液0.83ml1.0mMTris(pH6.8)0.63ml10%SDS0.05ml10%過(guò)硫酸銨0.05mlTEMED0.005ml實(shí)施例4目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP的純化1)放大體系誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP，方法同實(shí)施例3，誘導(dǎo)時(shí)間為2-6小時(shí)。2)12000rpm離心5分鐘收集菌體，棄上清。3)用原始菌液l/25體積的裂解液懸浮菌體，在室溫下緩慢攪拌0.5-1小時(shí)，超聲破碎，裂解完全后菌的懸浮液會(huì)變得澄清。4)12000rpm下離心30分鐘以移去細(xì)胞碎片，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新鮮的管內(nèi)。5)用裂解液平衡親和介質(zhì)。6)將裂解得到的上清加到平衡好的鎳柱柱子上。7)等液體流盡后，用洗滌液洗柱子，洗三次。8)用洗脫液洗脫目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP，收集洗脫液。9)將含有目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP的液體放入透析袋內(nèi)，在蒸餾水中4"C透析過(guò)夜，期間經(jīng)常更換蒸餾水。10)冷凍干燥，SDS-PAGE檢測(cè)純化的目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP。SDS-PAGE凝膠電泳顯示經(jīng)過(guò)洗脫液洗脫數(shù)次后，在目的蛋白分子量大小處，純化的目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP表現(xiàn)為單一的條帶。裂解液，洗滌液和洗脫液系Tris-HCl緩沖體系或磷酸緩沖體系pH值6.8-8.5。實(shí)施例5目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP降血糖活性藥理實(shí)驗(yàn)昆明種小鼠，體重27-30g，雄性，飼養(yǎng)一天后，禁食不禁水12h，尾靜脈注射8mg/ml的四氧嘧啶生理鹽水溶液50-80mg/kg(iv0.1ml/10g)，誘導(dǎo)小鼠發(fā)生糖尿病，4-5小時(shí)后，灌胃50。/。葡萄糖0.8ml/只。72h后(禁食12小時(shí))用穩(wěn)捷基礎(chǔ)加倍型血糖檢測(cè)儀測(cè)定小鼠血糖，選取血糖范圍在15-25mmol/L者隨機(jī)分為9組，每組10只。模型對(duì)照組，給予等體積生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組，給予鹽酸二甲雙胍1250mg/kgBW;C組高、中、低劑量組分別給予本發(fā)明表達(dá)蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGPl(融合表達(dá)的目的蛋白)，劑量在30mg/kg-2mg/kg范圍內(nèi)；D組高、中、低劑量組，分別給予本發(fā)明表達(dá)蛋白苦瓜降糖活性多肽2(非融合表達(dá)的目的蛋白)，劑量同蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP1?？蛰d體組給予空載體5mg/ml。另取10只正常小鼠作為正常對(duì)照組。小鼠禁食不禁水12h后，除陽(yáng)性對(duì)照組為灌胃給藥外，其余各組均尾靜脈注射給予受試藥物或等體積生理鹽水0.1ml/10g體重，給藥后0.5h，2h及4h用試紙法測(cè)定空腹血糖值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，二甲雙胍1250mg/kg口服后0.5h、2h、4h均能顯著降低四氧喳啶糖尿病小鼠血糖值PO.01;C高劑量組和中劑量組靜脈給藥4h后均能顯著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖值P<0.05;D低劑量組靜脈給藥4h后也能顯著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖值PO:Ol，見(jiàn)表l，證明利用生物工程菌能夠表達(dá)出具有和本發(fā)明的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP相同功能的活性蛋白。序列表SEQID:1的信息序列特征長(zhǎng)度83個(gè)堿基類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形序列描述CGGGATCCATCGAAGGTCGT驗(yàn)鷗CN血ATG騸幽詹輔縱翻G纖(Sllgai輸錢(qián)g贈(zèng)詢tP,iM濕GCT工GG鏈型SEQID:2的信息序列特征長(zhǎng)度83個(gè)堿基核酸單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形序列描述CGGGATCCATCGAAGGTCGT喊,鏐^^p賊驗(yàn)？G鑕〖'J^KfTAAGCTTGGSEQID:3的信息序列特征長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸類(lèi)型氨基酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形序列描述K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A-A國(guó)A-G隱A-V-V-G權(quán)利要求1、一種具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)PCR法得到兩端帶有限制性酶切位點(diǎn)的有如SEQID1寡核苷酸序列的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核苷酸編碼序列；并進(jìn)一步優(yōu)化為SEQID2；(2)將步驟(1)中得到的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核苷酸序列連結(jié)到表達(dá)載體中，得到具有降血糖生物活性的苦瓜多肽重組表達(dá)載體；(3)將步驟(2)中得到的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主中，并在表達(dá)步驟(1)中所述的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核苷酸編碼序列的條件下，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)從步驟(3)培養(yǎng)的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中和細(xì)胞內(nèi)回收并純化表達(dá)產(chǎn)物具有降血糖生物活性的苦瓜多肽。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制備方法，其特征在于所述具有降血糖生物活性苦瓜多肽核苷酸編碼序列為SEQID:2核酸序列的第21個(gè)堿基至第75個(gè)堿基；其中的SEQID:2的第23位、第35位的密碼子為A;第29位、第38位的密碼子為T(mén);第68位和第71位的密碼子為A或G。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制備方法，其特征在于其中所述步驟(1)的限制性酶切位點(diǎn)N端為BamHI酶切位點(diǎn)，C端為HindIII酶切位點(diǎn)。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制備方法，其特征在于其中所述步驟(1)采用的生物工程菌為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、面包酵母或畢赤酵母。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制備方法，其特征在于其中所述步驟(2)的表達(dá)載體是攜帶T7/T5啟動(dòng)子的pET/pQE質(zhì)粒及其衍生物。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制備方法，其特征在于其中所述步驟(2)的表達(dá)載體是pET32a/pQE8。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制備方法，其特征在于其中所述步驟(3)的大腸桿菌宿主是大腸桿菌BL21DE3/M15細(xì)胞系。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苦瓜降糖活性多肽的基因工程制備方法，其特征在于其中所述步驟(4)的回收并純化采用鎳柱親和純化。全文摘要本發(fā)明提供了一種具有降血糖生物活性的苦瓜多肽基因工程制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明方法包括表達(dá)載體的構(gòu)建，表達(dá)、純化等。本發(fā)明方法能夠定向、穩(wěn)定、高效的表達(dá)出具有生物學(xué)活性的功能多肽，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明制備的多肽能顯著降低糖尿病模型動(dòng)物的血糖值，可用于制備防治糖尿病的藥物。文檔編號(hào)C07K14/415GK101544981SQ20081003293公開(kāi)日2009年9月30日申請(qǐng)日期2008年1月23日優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日發(fā)明者付中平,劉思秀,周吉燕,王富軍,胡之璧申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)