Wang策略固相合成肽技術(shù)的制作方法

專利名稱：：Wang策略固相合成肽技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本項(xiàng)目涉及一些活性肽的固相合成方法，特別適用于經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的大批量制備原料藥的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
：半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，由Merrifidd教授發(fā)明的固相肽合成法極大地促進(jìn)了醫(yī)藥科學(xué)的發(fā)展。迄今為止，Boc/Bzl/強(qiáng)酸解樹脂方式及Fmoc/tBut/弱酸解樹脂方式是眾多固相肽合成技術(shù)中最廣泛被應(yīng)用的兩種保護(hù)策略。它們各自的匹配方式如圖1所示。上述經(jīng)典匹配策略中，Boc化學(xué)采用的是酸梯度選擇性脫保護(hù)方式。其中每步縮合后用弱酸(如TFA)只脫除a-氨基上的臨時(shí)保護(hù)Boc基；待全部縮合完成后，用強(qiáng)酸(如HF或TFMSA)脫除全部側(cè)保護(hù)基及固載樹脂。Fmoc化學(xué)采用的是正交選擇性脫保護(hù)方式。其中每步縮合后用有機(jī)堿(如20。/。哌啶/DMF或5%DBU/DMF)脫除a-氨基上的Fmoc基；待全部縮合完成后，用弱酸(如TFA)同時(shí)脫除全部側(cè)保護(hù)基及弱酸解型樹脂。從這兩種匹配策略的最后一步釋放游離肽的反應(yīng)中可見，它們共同之處是將脫除側(cè)保護(hù)及裂解載體樹脂反應(yīng)同時(shí)發(fā)生。然而，由此得到的產(chǎn)物肽必然與大量的酸解試劑、清除劑(Scavengers)及側(cè)保護(hù)基與清除劑鍵合的副產(chǎn)物混在一起。這是上述兩種經(jīng)典方式合成肽不可避免的結(jié)果，得到的粗產(chǎn)物純度較差，增加了進(jìn)一步純化的難度。
發(fā)明內(nèi)容鑒于現(xiàn)行的Boc化學(xué)及Fmoc化學(xué)在固相合成肽中經(jīng)典匹配策略上存在的不足，本發(fā)明提供一種全部縮合完成后的脫除側(cè)保護(hù)反應(yīng)與裂解樹脂反應(yīng)分步進(jìn)行的新策略。其目的是將固相合成特有的"過(guò)濾/淋洗/純化"功能進(jìn)一步延伸至脫除全部側(cè)保護(hù)基階段。在此階段，本發(fā)明合成的肽分子依然鍵合在固相樹脂上，因此可以用相應(yīng)的溶劑淋洗肽樹脂，充分除去脫保護(hù)試劑及游離下來(lái)的側(cè)保護(hù)基等雜質(zhì)。隨后對(duì)無(wú)保護(hù)基的赤裸肽-樹脂進(jìn)行氨解反應(yīng)，切除樹脂同時(shí)釋放出基本不含雜質(zhì)的產(chǎn)物肽。因此本發(fā)明提供的固相肽合成方式又可簡(jiǎn)稱為WANG(withoutacid-cleavage/nicegain)策略肽合成法。與固相肽合成中的經(jīng)典策略相比，WANG策略合成的粗產(chǎn)物純度明顯優(yōu)于前者(圖2)。在采用WANG策略合成肽中，本發(fā)明使用的Merrifidd樹脂是唯一的固相載體。不帶側(cè)保護(hù)基的Boc-氨基酸為Boc-Ala,Boc-Arg(.HCl),Boc-Gly,Boc-Ile,Boc-Leu,Boc-Phe，Boc-Pro,Boc國(guó)Ser，Boc國(guó)Thr,Boc-Tyr,Boc-Trp,Boc國(guó)Val,Boc-Asn,Boc-Gln,Boc-PAla，Boc-Abu(Y-氨基丁酸)及Boc-Aca(w-氨基己酸)。Fmoc-氨基酸的側(cè)保護(hù)情況為Fmoc-(Cys(Trt)、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Asp(O但u)及Fmoc-Glu(OtBu)?？s合劑組份分別為DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)與HOBt(N-羥基苯并三唑)的等摩爾混合物，HBTU(O-苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基脲翁六氟磷酸鹽)與HOBt及NMM(N-甲基嗎啉)的等摩爾混合物，或TBTU(0-苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基脲翁四氟硼酸鹽)的等摩爾混合物。其它試劑與溶劑的縮寫形式為H2NMe(甲胺)、H2NEt(乙胺)、H2NBu(正丁胺)、TEA(三乙胺)、H2NBn(節(jié)胺)、HNMe2(二甲胺)、TFA(三氟乙酸)、TESi(三乙基硅)、DMF(二甲基甲酰胺)、Py(吡啶)、DCM(二氯甲垸)、THF(四氫呋喃)、HOAc(乙酸)。脫除Boc試劑組合物3NHCl/HOAc或飽和HCl/EtOAc或50%TFA/DCM。脫除Fmoc試劑組合物20。/。哌啶/DMF。切除樹脂(氨解)組合物H2NR/H20-THF(1:1)。本發(fā)明涉及的化合物合成中，改變了Boc保護(hù)方式的肽合成必需經(jīng)強(qiáng)酸[如HF或HBr/HOAc或TFMSA(三氟甲磺酸)裂解切除樹脂，或Fmoc保護(hù)方式的合成必需使用昂貴的樹脂(如Wang樹脂、Rink樹脂等)而且用TFA裂解切除樹脂的兩種互為獨(dú)立的傳統(tǒng)方式。采用了交叉匹配的合成策略，以最廉價(jià)的氯甲基樹脂為固相載體、兼用Boc及Fmoc兩種保護(hù)方式的氨基酸為原料。其中正確使用Boc-氨基酸及Fmoc-氨基酸是確保本發(fā)明涉及的合成技術(shù)成功與否的關(guān)鍵。對(duì)此，本發(fā)明確定了如下合理使用保護(hù)方式的原則①Boc-氨基酸的縮合應(yīng)先于Fmoc-氨基酸。②Boc-氨基酸采用最小保護(hù)形式。③如果目標(biāo)結(jié)構(gòu)中含有側(cè)鏈需要保護(hù)的氨基酸殘基，則應(yīng)使用Fmoc氨基酸為原料。C端的Fmoc氨基酸不可能與氯甲基樹脂進(jìn)行上載(Loading)反應(yīng)。因此采用Boc-p-Ala，Boc-Abu或Boc-Aca作為空間臂(spacer)首先與氯甲基樹脂實(shí)現(xiàn)loading是必要的。本發(fā)明采用的WANG策略優(yōu)先合成了以下七個(gè)活性肽化合物TP5酰乙胺DeltorphinII衍生物RGD衍生物亮丙瑞林Ap蛋白片段肽Goralatide衍生物H-Arg-Lys隱Asp隱Val-Tyr陽(yáng)NHEt(1)H-Tyr-Arg-Phe陽(yáng)Glu-Val-Val-eAla-NHMe(2)H陽(yáng)Arg-Gly-Asp-Val-Tyr隱Ser-Leu-N畫e(3)Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt(4)Ac-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp-pAla-NH2(5)Ac-Ser-Asp-Lys\〉Lys-Aca-NHEt(6)Ac-Ser-Asp-Lys,陽(yáng)亮丙瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH2(7)為了比較本發(fā)明的新策略與經(jīng)典策略對(duì)肽產(chǎn)物純度的影響，還用常規(guī)的Boc-氨基酸(Bzl)-^1811\樹脂/了^48八裂解方式，也合成了[C-NH2]-亮丙瑞林(7)。兩種方式得到粗產(chǎn)物7的HPLC分析(圖3)表明它們的純度差別大。與經(jīng)典方式得到的粗產(chǎn)物(圖3A)相比，本發(fā)明得到的粗產(chǎn)物(圖3B)完全不含有保留時(shí)間較長(zhǎng)(RT>25min)的疏水性雜質(zhì)，因此再純化要容易得多，收率也高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)1.粗產(chǎn)物的純度明顯提高，為最終的純化操作提供了更便利的基礎(chǔ)。2.由于以最廉價(jià)的Merrifield樹脂代替Fmoc保護(hù)策略所需的昂貴樹脂(表1);而且部分殘基的組裝可用Boc-氨基酸代替Fmoc-氨基酸，所以生產(chǎn)成本可以降低30~50%，此點(diǎn)是本發(fā)明的最大優(yōu)勢(shì)之一。表l.幾種常見功能樹脂的售價(jià)比較*<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*價(jià)格引自天津南開和成科貿(mào)有限公司的產(chǎn)品目錄3.最后一步的氨解釋放產(chǎn)物(同時(shí)切除樹脂)反應(yīng)收率均在95%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于經(jīng)典的酸裂解反應(yīng)。4.由于完全避免了強(qiáng)酸(HF，TFMSA)裂解樹脂操作，在改善大生產(chǎn)可行性的同時(shí)，還降低了對(duì)環(huán)境的污染。5.綜合上述諸點(diǎn)，本發(fā)明特別適用于肽類藥物的大規(guī)模生產(chǎn)。圖1固相肽合成中的經(jīng)典匹配策略圖2WANG策略與經(jīng)典策略合成肽方式及產(chǎn)物純度比較圖3兩種方式合成[C-NH2]-亮丙瑞林(7)的粗產(chǎn)物HPLC純度分析(A)Boc-AA-MBHAresin/TFMSACleavage方式合成的產(chǎn)物(B)WANG策略合成的產(chǎn)物(C)兩種方式產(chǎn)物的混合(coinjection)HPLCAlltechP3426;固定相C18.10n.;流動(dòng)相30%CH3CN—70%H20-0.1%TFA(05min);35%CH3CN-65%H20-0.1%TFA(5~15min);45%CH3CN-55%H20-0.1%TFA(15~25min);55%CH3CN—45%H20-0.1%TFA(25~35min);65%CH3CN—35%H20-0.1%TFA(3545min);100%CH3CN-0.1%TFA(4550min);檢測(cè)波長(zhǎng)214nm;流速1.0ml/min;色譜工作站Sage具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.TP5酰乙胺H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-NHeT(1)的合成①Boc-Tyr-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取10g(10mmol)氯甲基(又名Merrifield)樹脂(取代當(dāng)量1mmol/g，粒度100~200目，交聯(lián)度1%)，與三倍摩爾數(shù)的Boc-Tyr-OH.K2C03及1/10摩爾數(shù)的KI共混于150mLDMF中?；鞈乙河?(TC熱浴上轉(zhuǎn)動(dòng)反應(yīng)25h，將反應(yīng)混懸物移入G2號(hào)砂板過(guò)濾管中。用于約60。C的DMF洗濾5次，每次約50mL。隨后依次用下列溶劑洗濾(x次數(shù))95%EtOHx3,DMFx3,50%EtOH/H2Ox3，DMFx3,無(wú)水乙醇x3。充分抽干后取出樹脂置于約5(TC的紅外燈下，風(fēng)干至恒重。稱量得12.33g，增重2.33g(理論增重應(yīng)為2.445g)?；谠鲋刂担瞬疆a(chǎn)率為95.2%。②脫除Boc，HCl.Tyr-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備取上述Boc-Tyr-OCH2-聚苯乙烯樹脂2g置于容量為100mL的具砂濾及上口可密封的肽反應(yīng)管內(nèi)與70mL30%TFA/DCM溶液混合搖動(dòng)5min，抽除酸液。再加入70mL30%TFA/DCM溶液，再于室溫中搖動(dòng)30min。抽干液體后樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DCMx5,Et202，95%EtOHx3，DMFx3，95%EtOHx2，DMFx3，95%EtOHx3,充分抽干。③Boc-Val-Tyr-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取三倍摩爾量的Boc-Val-OH、HOBt及HBTU混懸于適量DMF中，在冰水外浴冷卻下加入四倍摩爾量的NMM，放置約10min后，將此活化組份與HCl.Tyr-OCH2-聚苯乙烯樹脂。室溫中搖動(dòng)反應(yīng)3h。抽除上清液后肽樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DMFx5，95%EtOHx3,DMFx3,95%EtOHx4，抽千。取小樣約l~2mg進(jìn)行茚三酮顏色反應(yīng)，結(jié)果小樣樹脂為淺黃色，表明Boc-Val-OH與Tyr的縮合完全。Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Tyr-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除二肽樹脂的Boc基。Fmoc-Asp(OtBu)-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑤脫除Fmoc反應(yīng)將上述的Fmoc-三肽樹脂按10mL20。/。哌啶/DMF溶液與lg樹脂的比例相混合。搖動(dòng)5min后抽干上清液，再加入同樣比例的哌啶DMF溶液，再搖動(dòng)20min，抽干上清液，肽樹脂依次進(jìn)行與③中方式相同的洗滌。⑥Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備按照縮合Fmoc-Asp(OtBu)-OH的條件進(jìn)行Fmoc-Lys(Boc)-OH的縮合。3h反應(yīng)已完全。⑦H-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備按照與上述脫除Fmoc基及縮合反應(yīng)的同樣操作進(jìn)行Boc-Arg(.HCl)-OH的縮合，得到中間體Boc-Arg(.HCl)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr-OCHr聚苯乙烯樹脂。脫除Boc及tBu使用80%TFA/DCM操作與②的方式相同。洗濾后加入6%TEA/DMF溶液反應(yīng)20min完成中和，再進(jìn)行與上述縮合洗濾相同的順序?qū)ξ咫臉渲M(jìn)行洗濾、抽干。⑧乙胺解切除樹脂，TP5酰乙胺(1)的制備將含65~70%乙胺的水液與等體積的THF混合。然后取2g肽樹脂與20mL氨解溶液相混，封嚴(yán)反應(yīng)管后室溫反應(yīng)24小時(shí)，收集上清液，再用95。/。EtOH洗濾殘余樹脂，并與上清液合并，濾液在455(TC下減壓濃縮，蒸干溶劑，得到的半固體剩余物再與適量無(wú)水EtOH混合，再蒸干。如此重復(fù)兩次后用無(wú)水乙醚適量與殘余物充分研磨，得白色粉末產(chǎn)物l重783mg(理論值847mg)，粗品總收率92%,FAB-MS分析707.5(M+l)。2.DeltorphinII衍生物H-Tyr-Arg-Phe國(guó)Glu-Val-Val-(3Ala-NHMe(2)的合成①Boc-|3Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取10g(10mmol)氯甲基(又名Merrifield)樹脂(取代當(dāng)量1mmol/g,粒度100200目，交聯(lián)度1%)，與三倍摩爾數(shù)的Boc-j3AIa-OH.K2C03及1/10摩爾數(shù)的KI共混于150mLDMF中。混懸液于6(TC熱浴上轉(zhuǎn)動(dòng)反應(yīng)25h，將反應(yīng)混懸物移入G2號(hào)砂板過(guò)濾管中。用于約60。C的DMF洗濾5次，每次約50mL。隨后依次用下列溶劑洗濾(x次數(shù))95%EtOHx3，DMFx3，50%Et0H/H2O3，DMFx3，無(wú)水乙醇x3。充分抽干后取出樹脂置于約5(TC的紅外燈下，風(fēng)干至恒重。稱量得11.467g，增重1.467g(理論增重應(yīng)為1.525g)?；谠鲋刂担瞬疆a(chǎn)率為96.2%。②脫除Boc，HC1.pAla-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備取上述Boc-(3Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂g置于容量為100mL的具砂濾及上口可密封的肽反應(yīng)管內(nèi)與70mL30%TFA/DCM溶液混合搖動(dòng)5min，抽除酸液。再加入70mL30%TFA/DCM溶液，再于室溫中搖動(dòng)30min。抽干液體后樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DCMx5，Et20x2，95%EtOH><3，DMFx3，95%EtOHx2，DMFx3，95。/。EtOHx3,充分抽干。③Boc-Val-pAla-0012-聚苯乙烯樹脂的制備稱取三倍摩爾量的Boc-Val-OH、HOBt及HBTU混懸于適量DMF中，在冰水外浴冷卻下加入四倍摩爾量的NMM，放置約10min后，將此活化組份與HC1.(3Ala-0(^2-聚苯乙烯樹脂。室溫中搖動(dòng)反應(yīng)3h。抽除上清液后肽樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DMFx5，95%EtOHx3,DMFx3,95%EtOHx4，抽干。取小樣約l~2mg進(jìn)行茚三酮顏色反應(yīng)，結(jié)果小樣樹脂為淺黃色，表明Boc-Val-OH與(3Ala的縮合完全。Boc-Val-Val-pAla-0(:112-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除二肽樹脂的Boc基。Boc-Val-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑤Fmoc-Glu-Val-Val-pAla-0012-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除三肽樹脂的Boc基。Fmoc-Glu-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑥脫除Fmoc反應(yīng)將上述的Fmoc-四肽樹脂按10mL20。/。哌啶/DMF溶液與lg樹脂的比例相混合。搖動(dòng)5min后抽干上清液，再加入同樣比例的哌啶DMF溶液，再搖動(dòng)20min，抽干上清液，肽樹脂依次進(jìn)行與③中方式相同的洗滌。⑦Fmoc-Phe-Glu-Val-Val-pAla-0012-聚苯乙烯樹脂的制備按照縮合Fmoc-Glu-OH的條件進(jìn)行Fmoc-Phe-OH的縮合。3h反應(yīng)已完全。⑧Fmoc-Arg(Pbf)-Phe-Glu-Val-Val-J3Ala-0012-聚苯乙烯樹脂的制備按照與上述脫除Fmoc基及縮合反應(yīng)的同樣操作進(jìn)行Fmoc-Arg(Pbf)-OH的縮合，得到中間體Fmoc-Arg(Pbf)-Phe-Glu-Val-Val-pAla-0。112-聚苯乙烯樹脂。⑨H-Tyr-Arg(Pbf)-Phe-Glu-Val-Val-卩Ala-0012-聚苯乙烯樹脂的制備按照與上述脫除Fmoc基及縮合反應(yīng)的同樣操作進(jìn)行Boc-Tyr-OH的縮合，得到Boc-Tyr-Arg(Pbf)-Phe-Glu-Val-Val-J3Ala-0(^2-聚苯乙烯樹脂。然后進(jìn)行Boc、Pbf的脫除，得到H-Tyr-Arg-Phe-Glu-Val-Val-卩Ala-0(^2-聚苯乙烯樹脂⑩甲胺解切除樹脂，DdtorphinII衍生物(2)的制備將含65~70%甲胺的水液與等體積的THF混合。然后取2g肽樹脂與20mL氨解溶液相混，封嚴(yán)反應(yīng)管后室溫反應(yīng)24小時(shí)，收集上清液，再用95。/。EtOH洗濾殘余樹脂，并與上清液合并，濾液在455(TC下減壓濃縮，蒸干溶劑，得到的半固體剩余物再與適量無(wú)水EtOH混合，再蒸干。如此重復(fù)兩次后用無(wú)水乙醚適量與殘余物充分研磨，得白色粉末產(chǎn)物2，重801mg(理論值895mg),粗品總收率89%,FAB-MS分析896.4(M+H)。3.RGD衍生物H-Arg-Gly-Asp-Val-Tyr-Ser-Leu-NHMe(3)的合成①Boc-Leu-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取10g(10mmol)氯甲基(又名Merrifield)樹脂(取代當(dāng)量1mmol/g，粒度100-200目，交聯(lián)度1%)，與三倍摩爾數(shù)的Boc-Leu-OH.K2C03及1/10摩爾數(shù)的KI共混于150mLDMF中?；鞈乙河?(TC熱浴上轉(zhuǎn)動(dòng)反應(yīng)25h，將反應(yīng)混懸物移入G2號(hào)砂板過(guò)濾管中。用于約60'C的DMF洗濾5次，每次約50mL。隨后依次用下列溶劑洗濾(x次數(shù))95%EtOHx3,DMFx3,50%EtOH/H2Ox3,DMFx3,無(wú)水乙醇x3。充分抽干后取出樹脂置于約5(TC的紅外燈下，風(fēng)干至恒重。稱量得11.868g，增重1.868g(理論增重應(yīng)為1.95g)。基于增重值，此步產(chǎn)率為95.8%。②HCl.Leu-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備取上述Boc-Leu-OCH2-聚苯乙烯樹脂2g置于容量為100mL的具砂濾及上口可密封的肽反應(yīng)管內(nèi)與70mL30%TFA/DCM溶液混合搖動(dòng)5min，抽除酸液。再加入70mL30%TFA/DCM溶液，再于室溫中搖動(dòng)30min。抽干液體后樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DCMx5，Et202，95%EtOHx3，DMFx3，95%EtOHx2，DMFx3，95n/。EtOHx3,充分抽干。③Boc-Ser-Leu-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取三倍摩爾量的Boc-Ser-OH、HOBt及HBTU混懸于適量DMF中，在冰水外浴冷卻下加入四倍摩爾量的NMM，放置約10min后，將此活化組份與HC1.Leu-OCH2-聚苯乙烯樹脂。室溫中搖動(dòng)反應(yīng)3h。抽除上清液后肽樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DMFx5，95%EtOHx3，DMFx3,95%EtOHx4，抽干。取小樣約l2mg進(jìn)行茚三酮顏色反應(yīng)，結(jié)果小樣樹脂為淺黃色，表明Boc-Ser-OH與Leu的縮合完全。④Boc-Tyr-Ser-Leu-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除二肽樹脂的Boc基。Boc-Tyr-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑤Boc-Val-Tyr-Ser-Leu-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除二肽樹脂的Boc基。Boc-Val-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑥Fmoc-Asp(tBu)-Val-Tyr-Ser-Leu-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除二肽樹脂的Boc基。Fmoc-Asp(OtBu)-OH的活化反應(yīng)與(D的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑦Fmoc-Gly-Asp(tBu)-Val-Tyr-Ser-Leu-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備將上述的Fmoc-五肽樹脂按10mL20n/。哌啶/DMF溶液與lg樹脂的比例相混合。搖動(dòng)5min后抽干上清液，再加入同樣比例的哌啶DMF溶液，再搖動(dòng)20min，抽干上清液，肽樹脂依次進(jìn)行與③中方式相同的洗滌。Boc-Gly-OH的縮合，活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。得到中間體Fmoc-Gly-Asp(tBu)-Val-Tyr-Ser-Leu-OCH2-聚苯乙烯樹脂。⑧H-Arg-Gly-Asp(tBu)-Val-Tyr-Ser-Leu-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照⑦中的方式脫除二肽樹脂的Fmoc基。Boc-Arg(HCl.)-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。脫除Boc及tBu使用80%TFA/DCM操作與②的方式相同。洗濾后加入6%TEA/DMF溶液反應(yīng)20min完成中和，再進(jìn)行與上述縮合洗濾相同的順序?qū)ξ咫臉渲M(jìn)行洗濾、抽干?！蚣装方馇谐龢渲?，RGD衍生物(3)的制備將含65~70%甲胺的水液與等體積的THF混合。然后取2g肽樹脂與20mL氨解溶液相混，封嚴(yán)反應(yīng)管后室溫反應(yīng)24小時(shí)，收集上清液，再用95o/。EtOH洗濾殘余樹脂，并與上清液合并，濾液在4550'C下減壓濃縮，蒸干溶劑，得到的半固體剩余物再與適量無(wú)水EtOH混合，再蒸干。如此重復(fù)兩次后用無(wú)水乙醚適量與殘余物充分研磨，得白色粉末產(chǎn)物3重829mg(理論值903mg),粗品總收率91%,FAB-MS分析822.5(M+H)。4.亮丙瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt(4)的合成①Boc-Pro-6CH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取10g(10mmol)氯甲基(又名Merrifield)樹脂(取代當(dāng)量1mmol/g，粒度100~200目，交聯(lián)度1%)，與三倍摩爾數(shù)的Boc-Pro-OH.K2C03及1/10摩爾數(shù)的KI共混于150mLDMF中?；鞈乙河?(TC熱浴上轉(zhuǎn)動(dòng)反應(yīng)25h，將反應(yīng)混懸物移入G2號(hào)砂板過(guò)濾管中。用于約6(TC的DMF洗濾5次，每次約50mL。隨后依次用下列溶劑洗濾(x次數(shù))95%EtOHx3,DMFx3,50%Et0H/H2O3，DMFx3，無(wú)水乙醇x3。充分抽干后取出樹脂置于約5(TC的紅外燈下，風(fēng)干至恒重。稱量得11.66g，增重1.66g(理論增重應(yīng)為1.785g)?；谠鲋刂担瞬疆a(chǎn)率為93.2%。②Boc-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備取上述Boc-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂2g置于容量為100mL的具砂濾及上口可密封的肽反應(yīng)管內(nèi)與70mL30%TFA/DCM溶液混合搖動(dòng)5min，抽除酸液。再加入70mL30。/。TFA/DCM溶液，再于室溫中搖動(dòng)30min。抽干液體后樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DCMx5，Et20x2，95%EtOHx3，DMFx3，95%EtOH><2，DMFx3，95%EtOHx3,充分抽干。稱取三倍摩爾量的Boc-Arg(HCl.)-OH、HOBt及HBTU混懸于適量DMF中，在冰水外浴冷卻下加入四倍摩爾量的NMM，放置約10min后，將此活化組份與HC1.Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂。室溫中搖動(dòng)反應(yīng)3h。抽除上清液后肽樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DMFx5，95%EtOHx3,DMFx3,95%EtOHx4，抽干。取小樣約l2mg進(jìn)行茚三酮顏色反應(yīng)，結(jié)果小樣樹脂為淺黃色，表明Boc-Arg-OH與Pro的縮合完全。③Boc-Leu-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除二肽樹脂的Boc基。稱取三倍摩爾量的Boc-Leu-OH、HOBt及HBTU混懸于適量DMF中，在冰水外浴冷卻下加入四倍摩爾量的NMM，放置約10min后，將此活化組份與HCl.Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂。室溫中搖動(dòng)反應(yīng)3h。抽除上清液后肽樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DMFx5，95%EtOHx3,DMFx3，95%EtOHx4，抽干。取小樣約l2mg進(jìn)行茚三酮顏色反應(yīng)，結(jié)果小樣樹脂為淺黃色，表明縮合完全。Boc-D-Leu-Leu-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除三肽樹脂的Boc基。Boc-D-Leu-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑤Boc-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除四肽樹脂的Boc基。Boc-Tyr-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。Boc-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除五肽樹脂的Boc基。Boc-Ser-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑦Fmoc-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除六肽樹脂的Boc基。Fmoc-Trp-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑧Fmoc-His(Trt)-T。-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備將上述的Fmoc-七肽樹脂按10mL20。/。哌啶/DMF溶液與lg樹脂的比例相混合。搖動(dòng)5min后抽干上清液，再加入同樣比例的哌啶DMF溶液，再搖動(dòng)20min，抽干上清液，肽樹脂依次進(jìn)行與③中方式相同的洗滌。Fmoc-His(Trt)-OH的縮合，活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑨H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備將上述的Fmoc-八肽樹脂按10mL2(P/。哌啶/DMF溶液與lg樹脂的比例相混合。搖動(dòng)5min后抽干上清液，再加入同樣比例的哌啶DMF溶液，再搖動(dòng)20min，抽干上清液，肽樹脂依次進(jìn)行與③中方式相同的洗滌。H-Pyr-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。脫除Trt使用5。/。TES(三乙基硅)/5n/。TFA/DCM,其它操作與②的方式相同。洗濾后加入6%TEA/DMF溶液反應(yīng)20min完成中和，再進(jìn)行與上述縮合洗濾相同的順序?qū)ξ咫臉渲M(jìn)行洗濾、抽干。⑩乙胺解切除樹脂，亮丙瑞林(4)的制備將氨水與等體積的THF混合。然后取2g肽樹脂與20mL氨解溶液相混，封嚴(yán)反應(yīng)管后室溫反應(yīng)24小時(shí)，收集上清液，再用95。/。EtOH洗濾殘余樹脂，并與上清液合并，濾液在455(TC下減壓濃縮，蒸干溶劑，得到的半固體剩余物再與適量無(wú)水EtOH混合，再蒸干。如此重復(fù)兩次后用無(wú)水乙醚適量與殘余物充分研磨，得到產(chǎn)物4約重996mg(理論值1208mg),粗品總收率82%,FAB-MS分析1209.6(M+H)。5.Ap蛋白(17-21)衍生物Ac-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp-pAla-NH2(5)的合成①Boc-(3Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取10g(10mmol)氯甲基(又名Merrifield)樹脂(取代當(dāng)量1mmol/g，粒度100200目，交聯(lián)度1%)，與三倍摩爾數(shù)的Boc-pAla-OH.K2C03及1/10摩爾數(shù)的KI共混于150mLDMF中?；鞈乙河?0'C熱浴上轉(zhuǎn)動(dòng)反應(yīng)25h，將反應(yīng)混懸物移入G2號(hào)砂板過(guò)濾管中。用于約6(TC的DMF洗濾5次，每次約50mL。隨后依次用下列溶劑洗濾(x次數(shù))95%EtOHx3，DMFx3,50%EtOH/H2Ox3,DMFx3，無(wú)水乙醇x3。充分抽干后取出樹脂置于約5(TC的紅外燈下，風(fēng)干至恒重。稱量得11.467g，增重1.467g(理論增重應(yīng)為1.525g)?；谠鲋刂?，此步產(chǎn)率為96.2%。②HCl.pAla-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備取上述Boc-pAla-OCH2-聚苯乙烯樹脂2g置于容量為100mL的具砂濾及上口可密封的肽反應(yīng)管內(nèi)與70mL30%TFA/DCM溶液混合搖動(dòng)5min，抽除酸液。再加入70mL30%TFA/DCM溶液，再于室溫中搖動(dòng)30min。抽干液體后樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DCMx5，Et20x2，95%EtOHx3，DMFx3，95%EtOHx2，DMFx3，95。/。EtOHx3,充分抽干。③Fmoc-Asp(tBu)-pAla-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取三倍摩爾量的Fmoc-Asp(tBu)-OH、HOBt及HBTU混懸于適量DMF中，在冰水外浴冷卻下加入四倍摩爾量的NMM，放置約10min后，將此活化組份與HC1.卩Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂。室溫中搖動(dòng)反應(yīng)3h。抽除上清液后肽樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DMFx5，95%EtOHx3,DMFx3,95%EtOHx4，抽干。取小樣約l2mg進(jìn)行茚三酮顏色反應(yīng)，結(jié)果小樣樹脂為淺黃色，表明縮合完全。Fmoc-Phe-Asp(tBu)-pAla-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備將上述的Fmoc-二肽樹脂按10mL20。/。哌啶/DMF溶液與lg樹脂的比例相混合。搖動(dòng)5min后抽干上清液，再加入同樣比例的哌啶DMF溶液，再搖動(dòng)20min，抽干上清液，肽樹脂依次進(jìn)行與③中方式相同的洗滌。Fmoc-Phe-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑤Fmoc-Phe-Phe-Asp(tBu)-卩Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照④中的方式脫除三肽樹脂的Fmoc基。Fmoc-Phe-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑥Fmoc-Pro-Phe-Phe-Asp(tBu)-卩Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照④中的方式脫除三肽樹脂的Fmoc基。Fmoc-Pro-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑦Fmoc-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp(tBu)-pAla-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照④中的方式脫除三肽樹脂的Fmoc基。Fmoc-Leu-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑧Ac-Leu-Pro-Phe-Phe-Asp(tBu)-卩Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照④中的方式脫除三肽樹脂的Fmoc基。然后用10倍摩爾量的Ac20/Py/DMF反應(yīng)lh完成N端的乙?；?。⑨氨解切除樹脂，A(3蛋白(17-21)衍生物(5)的制備將飽和氨水的MeOH溶液與等體積的THF混合。然后取2g肽樹脂與20mL氨解溶液相混，封嚴(yán)反應(yīng)管后室溫反應(yīng)24小時(shí)，收集上清液，再用95MEtOH洗濾殘余樹脂，并與上清液合并，濾液在455(TC下減壓濃縮，蒸干溶劑，得到的半固體剩余物再與適量無(wú)水EtOH混合，再蒸干。如此重復(fù)兩次后用無(wú)水乙醚適量與殘余物充分研磨，得到產(chǎn)物5重776mg(理論值853mg),粗品總收率91%,FAB-MS分析750.5(M+H)。6.Goralatide衍生物①Boc-Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取10g(10mmol)氯甲基(又名Merrifield)樹脂(取代當(dāng)量1mmol/g，粒度100200目，交聯(lián)度1%),與三倍摩爾數(shù)的Boc-Aca-OH.K2C03及1/10摩爾數(shù)的KI共混于150mLDMF中。混懸液于60'C熱浴上轉(zhuǎn)動(dòng)反應(yīng)25h，將反應(yīng)混懸物移入G2號(hào)砂板過(guò)濾管中。用于約6(TC的DMF洗濾5次，每次約50mL。隨后依次用下列溶劑洗濾(x次數(shù))95%EtOHx3，DMFx3,50%Et0H/H2O3,DMFx3，無(wú)水乙醇x3。充分抽干后取出樹脂置于約50'C的紅外燈下，風(fēng)干至恒重。稱量得11.88g，增重1.88g(理論增重應(yīng)為1.945g)?；谠鲋刂?，此步產(chǎn)率為96.6%。②HCl.Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備取上述Boc-Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂2g置于容量為100mL的具砂濾及上口可密封的肽反應(yīng)管內(nèi)與70mL30%TFA/DCM溶液混合搖動(dòng)5min，抽除酸液。再加入70mL30。/。TFA/DCM溶液，再于室溫中搖動(dòng)30min。抽干液體后樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DCMx5，Et20><2，95%EtOH><3，DMFx3，95%EtOH><2，DMFx3，95%EtOHx3,充分抽干?！駼oc-Lys(Boc)-Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取三倍摩爾量的Boc-Lys(Boc)-OH、HOBt及HBTU混懸于適量DMF中，在冰水外浴冷卻下加入四倍摩爾量的NMM，放置約10min后，將此活化組份與HC1.Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂。室溫中搖動(dòng)反應(yīng)3h。抽除上清液后肽樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DMFx5，95%EtOHx3，DMFx3，95%EtOHx4，抽干。取小樣約l~2mg進(jìn)行茚三酮顏色反應(yīng)，結(jié)果小樣樹脂為淺黃色，表明縮合完全。將上述的Boc-二肽樹脂按②中的方式脫除Boc基團(tuán)，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。將上述的Fmoc-樹脂按10mL20。/。哌啶/DMF溶液與lg樹脂的比例相混合。搖動(dòng)5min后抽干上清液，再加入同樣比例的哌啶DMF溶液，再搖動(dòng)20min，抽干上清液，肽樹脂依次進(jìn)行與③中方式相同的洗滌。Fmoc-Asp(tBu)-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。將上述的Fmoc-樹脂按10mL20n/。哌啶/DMF溶液與lg樹脂的比例相混合。搖動(dòng)5min后抽干上清液，再加入同樣比例的哌啶DMF溶液，再搖動(dòng)20min，抽干上清液，肽樹脂依次進(jìn)行與③中方式相同的洗滌。Fmoc-Ser-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。將上述的Fmoc-樹脂按10mL20。/。哌啶/DMF溶液與lg樹脂的比例相混合。搖動(dòng)5min后抽干上清液，再加入同樣比例的哌啶DMF溶液，再搖動(dòng)20min，抽干上清液，肽樹脂依次進(jìn)行與③中方式相同的洗滌。然后用10倍摩爾量的Ac20/Py/DMF反應(yīng)lh完成N端的乙?；＝又芒谥械姆椒摮鼴oc、tBu等側(cè)鏈保護(hù)基⑧氨解切除樹脂，Goralatide衍生物將含65~70%乙胺的水液與等體積的THF混合。然后取2g肽樹脂與20mL氨解溶液相混，封嚴(yán)反應(yīng)管后室溫反應(yīng)24小時(shí)，收集上清液，再用95y。EtOH洗濾殘余樹脂，并與上清液合并，濾液在4550'C下減壓濃縮，蒸干溶劑，得到的半固體剩余物再與適量無(wú)水EtOH混合，再蒸干。如此重復(fù)兩次后用無(wú)水乙醚適量與殘余物充分研磨，得到產(chǎn)物6重931mg(理論值1030mg)，粗品總收率90%,FAB-MS分析1031.6(M+H)。7.[C-NH2]-亮丙瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH2(7)①Boc-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取10g(10mmol)氯甲基(又名Merrifield)樹脂(取代當(dāng)量1mmol/g，粒度100-200目，交聯(lián)度1%),與三倍摩爾數(shù)的Boc-Pro-OH.K2C03及1/10摩爾數(shù)的KI共混于150mLDMF中?；鞈乙河?0。C熱浴上轉(zhuǎn)動(dòng)反應(yīng)25h，將反應(yīng)混懸物移入G2號(hào)砂板過(guò)濾管中。用于約60°C的DMF洗濾5次，每次約50mL。隨后依次用下列溶劑洗濾(x次數(shù))95%EtOHx3,DMFx3,50%EtOH/H203,DMFx3,無(wú)水乙醇x3。充分抽干后取出樹脂置于約5(TC的紅外燈下，風(fēng)干至恒重。稱量得11.66g，增重L66g(理論增重應(yīng)為1.785g)。基于增重值，此步產(chǎn)率為93.2%。②Boc-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備取上述Boc-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂g置于容量為100mL的具砂濾及上口可密封的肽反應(yīng)管內(nèi)與70mL30%TFA/DCM溶液混合搖動(dòng)5min，抽除酸液。再加入70mL30y。TFA/DCM溶液，再于室溫中搖動(dòng)30min。抽干液體后樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DCMx5，Et202，95%EtOHx3，DMFx3，95%EtOHx2，DMFx3,95。/。EtOHx3,充分抽干。稱取三倍摩爾量的Boc-Arg-OH、HOBt及HBTU混懸于適量DMF中，在冰水外浴冷卻下加入四倍摩爾量的NMM，放置約10min后，將此活化組份與HC1.Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂。室溫中搖動(dòng)反應(yīng)3h。抽除上清液后肽樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DMFx5，95%EtOHx3，DMFx3,95%EtOHx4，抽干。取小樣約l2mg進(jìn)行茚三酮顏色反應(yīng)，結(jié)果小樣樹脂為淺黃色，表明Boc-Arg-OH與Pro的縮合完全。③Boc-Leu-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除二肽樹脂的Boc基。稱取三倍摩爾量的Boc-Leu-OH、HOBt及HBTU混懸于適量DMF中，在冰水外浴冷卻下加入四倍摩爾量的NMM，放置約10min后，將此活化組份與HCl.Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂。室溫中搖動(dòng)反應(yīng)3h。抽除上清液后肽樹脂依次進(jìn)行下列洗濾DMFx5，95%EtOHx3,DMFx3,95%EtOHx4，抽干。取小樣約12mg進(jìn)行茚三酮顏色反應(yīng)，結(jié)果小樣樹脂為淺黃色，表明縮合完全。Boc-D-Leu-Leu-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除三肽樹脂的Boc基。Boc-D-Leu-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑤Boc-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除四肽樹脂的Boc基。Boc-Tyr-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑥Boc-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除五肽樹脂的Boc基。Boc-Ser-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑦Fmoc-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備首先按照②中的方式脫除六肽樹脂的Boc基。Fmoc-Trp-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑧Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(HCl.)-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備將上述的Fmoc-七肽樹脂按10mL20。/。哌啶/DMF溶液與lg樹脂的比例相混合。搖動(dòng)5min后抽干上清液，再加入同樣比例的哌啶DMF溶液，再搖動(dòng)20min，抽干上清液，肽樹脂依次進(jìn)行與③中方式相同的洗滌。Fmoc-His(Trt)-OH的縮合，活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。⑨H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備將上述的Fmoc-八肽樹脂按10mL20。/。哌啶/DMF溶液與lg樹脂的比例相混合。搖動(dòng)5min后抽干上清液，再加入同樣比例的哌啶DMF溶液，再搖動(dòng)20min，抽干上清液，肽樹脂依次進(jìn)行與③中方式相同的洗滌。H-Pyr-OH的活化反應(yīng)與③的方式相同。3h縮合反應(yīng)后小樣的茚三酮反應(yīng)同樣為陰性，表明反應(yīng)完全。脫除Trt使用5。/。TES(三乙基硅)/5。/。TFA/DCM，其它操作與②的方式相同。洗濾后加入6%TEA/DMF溶液反應(yīng)20min完成中和，再進(jìn)行與上述縮合洗濾相同的順序?qū)ξ咫臉渲M(jìn)行洗濾、抽干。⑩氨解解切除樹脂，[C-NH2]亮丙瑞林(7)的制備將飽和NH3的MeOH溶液與等體積的THF混合。然后取2g肽樹脂與20mL氨解溶液相混，封嚴(yán)反應(yīng)管后室溫反應(yīng)24小時(shí)，收集上清液，再用95y。EtOH洗濾殘余樹脂，并與上清液合并，濾液在455(TC下減壓濃縮，蒸干溶劑，得到的半固體剩余物再與適量無(wú)水EtOH混合，再蒸干。如此重復(fù)兩次后用無(wú)水乙醚適量與殘余物充分研磨，得到產(chǎn)物7約重979mg(理論值1180mg),粗品總收率82.9%,FAB-MS分析1181.5(M+H)。權(quán)利要求1.WANG策略合成法，其特征是(a)以Merrifield(即氯甲基)樹脂為唯一的固相載體；(b)將經(jīng)典的Boc-氨基酸與強(qiáng)酸解樹脂匹配的方式和經(jīng)典的Fmoc-氨基酸與弱酸解樹脂匹配的方式交叉混用于同一合成中；(c)合成中涉及的Boc-氨基酸應(yīng)該不具有側(cè)保護(hù)基，如Boc-Ala，Boc-Arg，Boc-Leu，Boc-Phe，Boc-Pro，Boc-Ser，Boc-Thr，Boc-Tyr，Boc-Trp，Boc-Val，Boc-Asn，Boc-Gln，Boc-βAla，Boc-Abu及Boc-Aca(ω-氨基己酸)。其余帶有側(cè)保護(hù)基的Boc-氨基酸均不使用，以避免強(qiáng)酸(HF，TFMSA，HBr/HOAc)脫除側(cè)保護(hù)基的操作；(d)本發(fā)明使用的Fmoc-氨基酸的側(cè)保護(hù)基為tBut，Pbf，Mtr，Boc，Trt；(e)從C端開始的合成一旦遇到以需要側(cè)保護(hù)的氨基酸參與的縮合時(shí)，應(yīng)該以Fmoc-氨基酸為原料進(jìn)行合成；(f)全部縮合完成后，用80％TFA/DCM脫除全部側(cè)保護(hù)基(詳見d)。生成的赤裸肽依然與樹脂相連；(g)氨解及酯交換反應(yīng)是本發(fā)明裂解樹脂的實(shí)施方式，免除了強(qiáng)酸裂解樹脂的操作。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成法，產(chǎn)物的C末端均為酰胺結(jié)構(gòu)-CONH2,-CONHR，-CONR2及畫CONHRiR2(其中R,R1，R^C1國(guó)10烷基，Gly-ol,BnNH2，異丙胺)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的技術(shù)用于催產(chǎn)素(Oxytocin)、多肽T(PeptideT)、降^素(Calcitonin)、伐普肽(Vapreotide)、[C-NH2]-亮丙瑞林(C-NH2-Leuprolide)、亮丙瑞林(Leuprolide)、[C-NHEt]-胸腺五肽(C-NHEt-TP5)、RGD衍生肽(RGDderivative)、新皮啡肽(Deltorphin)、A|3蛋白片段、生長(zhǎng)抑素十四肽衍生物(Somatostatin-14-derivative)及Goralatide衍生物等活性肽的合成。全文摘要本發(fā)明涉及WANG策略固相合成肽技術(shù)，具體涉及以六個(gè)活性寡肽為目標(biāo)結(jié)構(gòu)，采用了將Boc-氨基酸/強(qiáng)酸裂解樹脂方式與Fmoc-氨基酸/弱酸解樹脂方式交叉配合、簡(jiǎn)稱為WANG(withoutacid-cleavageandnicegain)策略合成方式，最終得到收率滿意、成本更為低廉的產(chǎn)物。文檔編號(hào)C07K1/00GK101463070SQ20071030379公開日2009年6月24日申請(qǐng)日期2007年12月21日優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日發(fā)明者馮鶴鶴,楊瀟驍,浩林,王德心,香韓,喜龔申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所