專利名稱：：格爾德霉素的新衍生物Gdm-CT-1-1及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用基因工程技術(shù)改造制備抗生素的新衍生物，具體而言，涉及利用基因工程技術(shù)獲得格爾德霉素的新衍生物CT-1-1及其制備方法。技術(shù)背景吸水鏈霉菌17997(S加;towyc^/^gracopicws17997)是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所從我國(guó)土壤中分離到的，經(jīng)鑒定其可以產(chǎn)生格爾德霉素(geldanamycin,Gdm)。Gdm具有抗原蟲、抗腫瘤、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性[SasakiK""/.JAntibiot(Tokyo)1979,32(8):849-51];[陶佩珍等，中國(guó)抗生素雜志，1997,22:368-372]。根據(jù)最近報(bào)道，Gdm還具有調(diào)節(jié)上皮氮氧合酶活性以及抗炎等作用[Mu卬hyPWJournalofNeuroscienceResearch,2002,67(4):461-470]。經(jīng)研究證實(shí)，格爾德霉素的特異性作用靶點(diǎn)是熱休克蛋白卯(heatshockprotein90,Hsp卯)。Hsp卯是許多信號(hào)蛋白的伴侶分子，Gdm通過對(duì)Hsp90的抑制，可以間接影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白的功能，因此，有望成為一種頗具潛力的抗腫瘤和抗病毒藥物。但是Gdm還存在毒性大及水溶性差等缺點(diǎn)，水溶性差會(huì)影響其生物利用度，這些缺陷將限制其開發(fā)成為有效藥物。所以，尋找一種毒性低、水溶性好的衍生物，已成為其深入研究的主要目標(biāo)。目前，已有兩個(gè)在C17位進(jìn)行取代的Gdm衍生物17—AAG和17—DMAG,相繼在美國(guó)進(jìn)行II期和I期臨床試驗(yàn)[GoetzMPetalJClinOncol,2005，23(6):1078-1087];[GlazeER"a/.,CancerChemotherPharmacol.2005,56(6):637-647〗。Gdm的生物合成，是以3—氨基—5—羥基苯甲酸為起始物，2C單位為延伸單位，包括l個(gè)丙二酰，4個(gè)甲基丙二酰和2個(gè)甲氧基丙二酰，在荷載域和7個(gè)聚酮合酶(polyketidesynthase,PKS)模塊，順序進(jìn)行碳鏈的延伸反應(yīng)形成聚酮鏈骨架，再經(jīng)過酰胺合酶的環(huán)化，形成格爾德霉素前體原Gdm。然后通過后修飾過程，包括C17位的羥基化及氧甲基化、C21位的氧化、C7位的氨甲?；虲4，5位的氧化，最終形成Gdm。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)Gdm生物學(xué)方法的改造，本實(shí)驗(yàn)室從Streptomyceshygroscopicus17997基因文庫中克隆了與Gdm生物合成相關(guān)的基因簇[高群杰等，中國(guó)抗生素雜志，2002，27(1):13-27];[赫衛(wèi)清，王以光，中國(guó)生物工程學(xué)報(bào)，2006,22:卯2-906]。通過阻斷吸水鏈霉菌17997中的格爾德霉素生物合成基因一氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因(gc/mW)的方法，獲得一種新的格爾德霉素衍生物4,5-雙氫一7—氧一脫氨甲?；?—羥基一19一甘氨酰格爾德霉素(4，5-dihydro-7-0-descarbamoyl-7-hydroxy-19-glycylgeldanamycin)，命名為Gdm-CT-l-l。Gdm-CT-l-l水溶性比Gdm增加了500多倍。本發(fā)明所述通過基因工程技術(shù)在C19位進(jìn)行修飾獲得Gdm新衍生物Gdm-CT-l-l及其制備方法，為制備水溶性好的Gdm衍生物提供了新的途徑。利用生物學(xué)方法在GdmC19位進(jìn)行修飾獲得新衍生物的研究，迄今為止，尚未見有國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明提供了格爾德霉素的新衍生物Gdm-CT-1-1，其結(jié)構(gòu)如式(1)所示:本發(fā)明還提供了新衍生物Gdm-CT-l-l的制備方法，具體步驟包括1、Gdm生物合成阻斷變株的構(gòu)建采用具有氨芐青霉素抗性(AmpR)和硫鏈絲菌素抗性(TsrR)的大腸桿菌和鏈霉菌的穿梭載體pGH112構(gòu)建基因阻斷載體，以吸水鏈霉菌17997基因組為模板進(jìn)行PCR，分別獲得與^/miV基因同源的兩個(gè)片段，在其中間以相應(yīng)的酶切位點(diǎn)插入阿普拉霉素(apramydn，Am)抗性基因，并與pGH112載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得用于目的基因阻斷的重組載體；
發(fā)明內(nèi)容:將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，獲得轉(zhuǎn)化子，將其與吸水鏈霉菌17997的新鮮孢子共培養(yǎng)，通過接合轉(zhuǎn)移，將重組載體導(dǎo)入吸水鏈霉菌中。接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行傳代培養(yǎng)，篩選出An^和Ts一的突變株CT-1。利用PCR方法鑒定確認(rèn)，gcfmiV基因阻斷變株是通過同源雙交換在其中插入Am抗性基因的結(jié)果。2、格爾德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1的獲得將CT-1變株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，用等量乙酸已酯萃取發(fā)酵液上清，乙酸已酯萃取液經(jīng)薄膜濃縮獲得粗品，在硅膠柱用二氯甲垸洗脫，分部收集，以TLC或HPLC進(jìn)行檢測(cè)，再經(jīng)制備型HPLC獲得格爾德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1純品。3、格爾德霉素新衍生物Gdm-CT-1-1的結(jié)構(gòu)鑒定及水溶性測(cè)定經(jīng)高分辨質(zhì)譜確定Gdm-CT-l-l的分子量和分子式，經(jīng)"H和UCNMR分析，并通過化學(xué)結(jié)構(gòu)解析，確定Gdm-CT-1-1的結(jié)構(gòu)為4,5-雙氫-7-氧-脫氨甲?；?7-羥基-19-氧-甘氨酰格爾德霉素。測(cè)試結(jié)果表明，Gdm-CT-1-1的水溶性比Gdm提高500倍。發(fā)明效果本發(fā)明通過同源基因雙交換阻斷技術(shù)，破壞吸水鏈霉菌17997中的格爾德霉素生物合成基因gafe/^，在其變株發(fā)酵液中直接獲得Gdm在C19位進(jìn)行修飾的新衍生物Gdm-CT-l-l，且其水溶性比格爾德霉素高出500倍，為提供臨床療效更好的藥物奠定了基礎(chǔ)。-圖l:^加/V基因阻斷載體的構(gòu)建其中All^—阿普拉霉素抗性基因；tsr—硫鏈絲菌素抗性基因；Amp—氨芐青霉素抗性基因；B—;Bg—彭II;E—fco/I;Pi"I;S—SacIsX—版I。圖2:PCR產(chǎn)物電泳其中M—入HindIII;1—17997原株；2—CT-1。圖3:g血;V變株發(fā)酵產(chǎn)生的Gdra-CT-1-1HPLC檢測(cè)圖其中A—吸水鏈霉菌17997;保留時(shí)間為24.863分鐘，B—Gdm-CT-1-1，保留時(shí)間為12.925分鐘。圖4:Gdm-CT-1-1高分辨質(zhì)譜圖譜圖5:Gdm-CT-1-11H氫譜圖6:Gdm-CT-1-113C碳i普實(shí)施方案以下所列實(shí)施例是為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。<實(shí)施例1>gc/wiV基因阻斷重組載體的構(gòu)建根據(jù)gdwiV基因序列(GenbankDQ914285)設(shè)計(jì)引物(N1-N4)，提取吸水鏈霉菌17997(中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)藥學(xué)微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)CPHCC200178)基因組DNA，以此作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR。在本實(shí)驗(yàn)中采用以下引物及設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，但不限于所說的引物序列和酶切位點(diǎn)。上游引物(N1):5，-CCGGAATTCACGGCCTTGGCCAGATCC-3'帶有五coRI酶切位點(diǎn)；下游弓I物(N2):5，-CGCGGATCCATCCACCCCGCCTCGCAC國(guó)3，帶有5謡HI酶切位點(diǎn)；擴(kuò)增949bp片段l。上游引物(N3):5，-AAAACTGCAGGCCGTTGAGGCTGGAGTT陽3，帶有戶M酶切位點(diǎn)；下游引物(N4):5，-CTAGTCTAGACCGACTGGTTTGGGTGAT-3，帶有酶切位點(diǎn)；擴(kuò)增963bp片段2?；厥誔CR產(chǎn)物片段1和2，在其中間以5amHI-PWl酶切位點(diǎn)插入Am抗性基因，[來源于質(zhì)粒載體pKC1139(KieserT.etal.practicalStreptomycesgenetics.Norwich:JohnInnesFoundation.2000)]，并以五coRI-力al酶切位點(diǎn)與攜帶硫鏈絲菌素抗性的pGH112載體(莫宏波等生物工程學(xué)報(bào)，2004;20:662-666)相應(yīng)酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ot，提取轉(zhuǎn)化子DNA，經(jīng)酶切證明，獲得基因阻斷重組載體pGHEX-gdmN(圖1)。<實(shí)施例2>gdmiV變株的基因鑒定gdmiV變株的篩選按照文獻(xiàn)[赫衛(wèi)清等中國(guó)抗生素雜志，2006，31(3):168一171]進(jìn)行。將構(gòu)建的基因阻斷重組載體pGHEX-gdmN通過能與吸水鏈霉菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的大腸桿菌，如大腸桿菌ET12567/pUZ8002[KieserT.etal.practicalStreptomycesgenetics.Norwich:JohnInnesFoundation.2000〗導(dǎo)入到吸水鏈霉菌17997中，并在MY培養(yǎng)基[赫衛(wèi)清等中國(guó)抗生素雜志，2006，31(3):168—171]中傳34代后，再進(jìn)行單克隆分離，篩選獲得AmK、TsrsgdmiV變株。對(duì)gc/miV變株(CT-1)在基因整合水平進(jìn)行PCR驗(yàn)證。以原株和CT-1變株的基因組為模板，選取g"mW基因兩翼外測(cè)序列設(shè)計(jì)引物Prl和Pr2(圖l)進(jìn)行PCR。結(jié)果表明，使用引物Prl和Pr2原株基因組PCR產(chǎn)物大小約3.1kb左右，而在CT-1變株中擴(kuò)增出將近4.5kb特異性條帶(圖2)。Prl上游引物5'CCCAAGCTTCTCGTGGACGGGTTGCT3'(iZ/wcflll)Pr2下游弓l物5'CTAGTCTAGATCGAACGCCTCCACCTC3，CY&fll)PCR結(jié)果揭示，在同源基因片段之間，插入了1.5kb左右的Am抗性基因，符合預(yù)期結(jié)果。g^mJV變株在不加藥連續(xù)傳代中，Am抗性表型很穩(wěn)定，說明該變株中確實(shí)發(fā)生了DNA同源重組雙交換所造成的Am抗性基因插入，并使g^niV基因由于阻斷而受到破壞。<實(shí)施例3>Gdm-CT-1-1的制備gc/miV變株在MY固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，接種種子培養(yǎng)基50ml于250ml三角瓶，28。C搖床200rpm振蕩培養(yǎng)2天，以5—10%接種量轉(zhuǎn)種發(fā)酵培養(yǎng)基50ml(500ml三角瓶)或1000ml(5000ml)28。C搖床200rpm振蕩培養(yǎng)3天[赫衛(wèi)清等中國(guó)抗生素雜志，2006，31(3):168—171]。發(fā)酵液過濾后，用濾液二分之一體積的乙酸乙酯提取，薄膜濃縮后上硅膠柱，以二氯甲垸甲醇19一1進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫液，用島津LC-10Avp高壓液相色譜儀，SPD-M10AvP二極管陣列檢測(cè)器，CLASS-VP工作站，以254nm進(jìn)行HPLC檢測(cè)(圖3)，匯總含Gdm-CT-l-l化合物部分洗脫液，濃縮后用制備型HPLC，ODS-C18柱(柱體積150x20毫米)，甲醇水14:ll(v/v)，流量每分鐘5毫升，獲得Gdm-CT-l-l純品。<實(shí)施例4>Gdm-CT-l-l結(jié)構(gòu)的確定Gdm-CT-l-l純品經(jīng)高分辨質(zhì)譜分析，結(jié)果見圖4，確定其分子量為615.2896(含鈉)，實(shí)際分子量為592，分子式為C3QH44N2014。^和13CNMR數(shù)據(jù)見表1，圖譜見圖5，圖6。表lGdm-CT-1-1化合物的111和13CNMR數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>化學(xué)解析結(jié)果表明，Gdm-CT-l-l的結(jié)構(gòu)如式(1)所示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula><實(shí)施例5>Gdm-CT-l-l的水溶性測(cè)定分別將Gdm-CT-l-l和Gdm在50mM，pH7.0的磷酸鈉緩沖液中溶解，在室溫閉光的情況下攪拌12小時(shí)，測(cè)定它們的溶解度。結(jié)果表明,Gdm的溶解度為每毫升0.007毫克,而Gdm-CT-l-l的溶解度為每毫升4.02毫克，化合物Gdm-CT-l-l比Gdm的水溶性高500多倍。權(quán)利要求1、一種格爾德霉素的新衍生物Gdm-CT-1-1，其結(jié)構(gòu)如式(1)所示。2、制備權(quán)利要求1所述新衍生物Gdm-CT-l-l的方法，具體包括以下步驟A.Gdm生物合成阻斷變株的構(gòu)建；B.Gcto生物合成阻斷變株的發(fā)酵及Gdm-CT-1-1的提取和純化。3、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所說阻斷變株的構(gòu)建，是根據(jù)g^2iV基因序列(GenbankDQ914285)設(shè)計(jì)引物，以吸水鏈霉菌17997基因組為模板，進(jìn)行PCR，分別獲得與gc/miV基因同源的兩個(gè)片段，在其中間以相應(yīng)的酶切位點(diǎn)插入選擇性標(biāo)記基因，并與可轉(zhuǎn)入吸水鏈霉菌17997的質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得用于目的基因阻斷的重組載體；將重組載體導(dǎo)入吸水鏈霉菌中；根據(jù)選擇性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子；利用PCR方法鑒定確認(rèn)gctoV基因序列插入了選擇性標(biāo)記基因，使g血iV基因遭到破壞，從而獲得Gdm生物合成阻斷變株CT-1-1。4、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，新衍生物Gdm-CT-1-1的制備是將CT-1變株直接進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，用等量乙酸已酯萃取發(fā)酵液上清，乙酸已酯萃取液經(jīng)薄膜濃縮獲得粗品，在硅膠柱上用二氯甲烷洗脫，分部收集，以TLC或HPLC進(jìn)行檢測(cè)，再經(jīng)制備型HPLC得到格爾德霉素新衍生物Gdm-CT-l-l純品。5、格爾德霉素新衍生物Gdm-CT-l-l作為先導(dǎo)化合物在開發(fā)制備有效藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及利用基因工程技術(shù)改造制備抗生素的新衍生物，具體而言，涉及利用基因工程技術(shù)獲得格爾德霉素C19位進(jìn)行修飾的新衍生物4，5-雙氫-7-氧-脫氨甲酰基-7-羥基-19-氧-甘氨酰格爾德霉素(Gdm-CT-1-1)及其制備方法，通過同源基因雙交換阻斷技術(shù)，破壞吸水鏈霉菌17997中的格爾德霉素生物合成基因gdmN，在其變株發(fā)酵液中直接獲得Gdm新衍生物，其水溶性比格爾德霉素高500倍，為研制臨床療效更好的藥物奠定了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C07D225/06GK101239948SQ20071016634公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2007年11月7日優(yōu)先權(quán)日2007年11月7日發(fā)明者李永海,王以光,赫衛(wèi)清,邵榮光申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所