專利名稱：：一種重組抗癌肽及其制備方法和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組氨基酸及其制備方法和其應(yīng)用，具休地說是涉及一種重組多肽及其制備方法和其應(yīng)用。技術(shù)背景隨著腫瘤分子學(xué)及肽組合化學(xué)的迅速發(fā)展，肽及肽的衍生物在腫瘤治療中的作用成為人們研究的熱點(diǎn)。目前人們己從海洋生物中分離出許多具有抗癌活性的小分子肽或環(huán)肽。如美國亞利桑那州癌癥研究所Pettir等從Dolabellaauriculara海兔中分離出一系列具有抗癌活性的小分子肽(dolastatinsl-15)(詳見PettitGR，KamanoY,HeraldLL.etal.Theisolationandstructureofaremarkablemarineanimalantineoplasticconsrituent.JAmChemSoc.1987,109(22):6883-6885;文獻(xiàn)1-3);Rinerhart等從加勒比海的海鞘(Caribbeantunicates)中分離出五種具有抗癌活性的環(huán)肽didemninA、B、C、D、E(詳見RinehartKLJr，GloerJB,CookJC.etal.Structureofthedidemnins,antiviralandcytotoxicdepsipeptidesfromaCaribbeantunicate.JAmChemSoc，1981,103(7):1857-1859)。不過令人遺憾的是，目前所分離的肽類物質(zhì)其含量甚低，且合成困難，由此嚴(yán)重制約了其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種重組的抗癌肽。本發(fā)明的目的之—是提供一種該抗癌肽的制備方法。本發(fā)明的目的之三是提供一種含有該抗癌肽的表達(dá)載體。本發(fā)明的目的之四是提供該抗癌肽在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所提供的重組抗癌肽，簡稱重組十三肽，其氨基酸序列為Gly-Arg-Gly國Asp-Ser-Val-Val國Tyr-Gly陽Leu-Arg-Ser-Lys(SEQIDNO.l)。本發(fā)明所述的重組抗癌肽的制備方法包括以下步驟a、用質(zhì)粒pTWIN2載體，經(jīng)內(nèi)切酶BspQl處理后，插入粘性末端的含有OPN的RGD序列的十三肽，在設(shè)計(jì)引物時加上了半胱氨酸TGC，經(jīng)過引物變性、退火的方法使引物與酶切處理后的載體按l:10(摩爾比)16°〇連接過夜，得到重組質(zhì)粒pTWIN2-RGD。b、將重組質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌消化，轉(zhuǎn)入大腸菌或大腸埃希菌，誘導(dǎo)、收集、純化目的蛋白。在表達(dá)載體中插入本發(fā)明克隆的抗癌肽并且導(dǎo)入宿主細(xì)胞如大腸菌或大腸埃希菌表達(dá)重組十三肽。本發(fā)明抗癌肽是屬小分子環(huán)狀小肽，具有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，同時便于人工合成，易于產(chǎn)業(yè)化。因此本發(fā)明抗癌肽可在制備抗癌藥物中得到應(yīng)用。尤其適用于制備治療腸癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌或肺癌藥物。本發(fā)明抗癌肽或含有該抗癌肽的表達(dá)載體經(jīng)5.7mol/L鹽酸水解16小時，通過氨基酸自動分析儀及氨基酸序列儀即可測定出其序列。本發(fā)明抗癌肽在用于制備抗癌藥物時，可以抗癌肽為藥物活性成分，并與藥學(xué)上可以接受的載體如生理鹽水、注射液、乳劑(如甘油三酯乳劑、水包油/油包水乳劑)或藥用常規(guī)輔劑如賦形劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、抗氧化劑、包衣劑、著色劑、芳香劑、表面活性劑等混合，按照常規(guī)的制劑技術(shù)將其制成注射液、輸液劑、緩控釋劑、顆粒劑、膠囊劑、片劑等藥物劑型。本發(fā)明抗癌肽可采用口服給藥，也可采用注射等非口服途經(jīng)給藥。給藥劑量可以是lng-10g/kg，具體給藥劑量可依據(jù)不同的給藥方式適時調(diào)整。醫(yī)師也可依據(jù)病情，酌情確定。圖l是pTWIN2載體圖譜。具體實(shí)施方式下面的實(shí)施例、試驗(yàn)實(shí)施例和制劑實(shí)施例可更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例1本發(fā)明抗癌肽的重組、鑒定、純化與收集。利用NEB(NewEnglandBiolabs)公司的IMPACT-TWIN系統(tǒng)，通過幾丁質(zhì)珠親和層析及內(nèi)含肽(intein)自剪接功能實(shí)現(xiàn)重組環(huán)狀小肽的制備。一、構(gòu)建重組質(zhì)粒pTWIN2-RGDpTWIN2載體圖譜，如圖l所示。pTWIN2載體部分序列如下PblylinterRegion:pTWIN25'...ACTGGGACTCCATCGTTTCTATTACGG站ACTGGAGTCGAAGAGGTTTTT鄉(xiāng)DnaBlnteinFotwandPrimer—<~lnteinT...&pDnaBIntein…ValAlaAsnAsplielie/a1HistenGATTTGACTGTGCCAGGACCACATAACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACNrullutein~G1yArgAlaHetGlyG1yArgGluPheLeuGluGlySerSerTCysValSerGlyAspThrGGAAGAGCCATGGGCGGCCGCGAATTCCTCGAGGGCTCTTCCTGCGTATCCGGTGACACCATTSapINcoIWotIEcoRIXhoISapI...付!;hRIR1Intein...GTAATGACTAGTGGCGGTCCGCGCACTCTGGCTGAACTGGAGSGCAMCCGTTCACC...3'Spei—勵RIR1InteinReversePrimerpTWIN2載體含有兩個內(nèi)含肽，N端的inteinl和C端的intein2，而多克隆位點(diǎn)則位于兩個內(nèi)含肽中間，為了利于蛋白的環(huán)化，利用內(nèi)切酶SapI切割載體，因其有兩個位于多克隆位點(diǎn)兩端的酶切位點(diǎn)，且設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)正好是反向互補(bǔ)，所以目的片段只會定向插入而不會反向插入。內(nèi)切酶SapI的識別序列為5'…GCTCTTC(N)，…3'3'…CGAGAAG(N)JL…5'N表示識別位點(diǎn)后切割的堿基數(shù)，根據(jù)載體序列可知，pTWIN2載體經(jīng)內(nèi)切酶SapI切割后的粘末端為5'…ATTGTACAC3'3'…TAACATGTGTTG5'及5'TGCGTATCC…3'3'CATAGG…5'所以本發(fā)明人根據(jù)載體經(jīng)Sapl處理后暴露的粘性末端及實(shí)驗(yàn)需要，設(shè)計(jì)帶有相應(yīng)粘性末端的含有OPN的RGD序列的十三肽，不包含終止碼，其序列如下為了使目的蛋白利于環(huán)化，本發(fā)明人在設(shè)計(jì)引物時加上了半胱氨酸TGC，經(jīng)過引物變性、退火的方法使引物與酶切處理后的載體按1:10(摩爾比)16'C連接過夜，得到重組質(zhì)粒pTWIN2-RGD。由于SapI的切割及連接特點(diǎn)，片段與載體連上后導(dǎo)致SapI酶切位點(diǎn)的丟失，所以本發(fā)明人用PCR的方法鑒定連接產(chǎn)物。因SapI在運(yùn)輸過程中很不穩(wěn)定，故本發(fā)明人采用NEB公司生產(chǎn)的與SapI的識別位點(diǎn)及切割位點(diǎn)完全一致的同裂酶BspQI作為內(nèi)切酶來替代SapI。二、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及鑒定將重組表達(dá)質(zhì)粒(即連接產(chǎn)物)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，具體方法如下將10"l連接產(chǎn)物加入100ulDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，充分混勻后冰浴30分鐘，42°C熱激90秒，迅速冰浴2—3分鐘，涂菌(含氨芐的固體LB培養(yǎng)基)，將平皿倒置于37"C溫箱培養(yǎng)過夜。次日挑單克隆菌落，先用菌落PCR的方法初步鑒定后送測序進(jìn)一步鑒定。三、目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化運(yùn)用15ml的Chitin(幾可丁)親合柱進(jìn)行蛋白純化的方法(適用于1L的誘導(dǎo)培養(yǎng)菌)1.細(xì)菌培養(yǎng)將測序正確的重組提菌質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌ER2566(即pTWIN2載體自帶的表達(dá)菌)，轉(zhuǎn)化方法同上，只是lPl純質(zhì)粒轉(zhuǎn)入50y1ER2566感受態(tài)細(xì)胞中。次日晚挑單克隆菌落，37t:水浴搖床振蕩培養(yǎng)過夜。第二天按l:IOO的比例接種于10ml液體LB培養(yǎng)基(含氨芐100|ag/ml)，37'C振蕩培養(yǎng)3-4h，后接種于1L液體培養(yǎng)基(含氨芐100嗎/ml)，37。C培養(yǎng)至OD600達(dá)0.5-0.7。'2.誘導(dǎo)蛋白表達(dá)加入終濃度為O.lmM-l.OmM的IPTG，于12—37。C誘導(dǎo)蛋白表達(dá)2—20h，以確立最佳誘導(dǎo)條件并設(shè)立陰性對照(未誘導(dǎo))。取樣10-20^1進(jìn)行SDS-PAGE電泳，取樣1-2|il進(jìn)行Westernblot鑒定。3.細(xì)胞收集5000xg，4t:離心10分鐘，棄上清。將細(xì)胞凍融以利于破碎。注以下步驟4-9除有特殊注明以外，均在4。C操作。4.破碎細(xì)胞:用50ml適當(dāng)?shù)牧呀饩彌_液(20mMTris-HCl，pH8.5,0.5MNaClorBufferBl)將菌體重懸，冰浴，超聲破碎細(xì)胞，使蛋白釋放。19000><g離心30分鐘，上清即為澄清的細(xì)胞粗提物。取樣2-5^進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定(Westernblot鑒定1:10稀釋，上樣2-5pl)。5.Chitin柱的平衡將24mlchitinbeads(15ml柱床體積)倒入2.5x10cm柱中，10個柱床體積的相應(yīng)緩沖液(同步驟4用液)4'C進(jìn)行柱平衡。注Chitin(幾可丁)的用量由融合蛋白的總量來決定，每毫升柱床體積大約能夠結(jié)合3mg蛋白，因此一升培養(yǎng)菌所獲得的約45mg融合蛋白大約需要15ml柱床體積的樹脂。6.Chitin柱將澄清的細(xì)胞粗提物緩慢加入Chitin柱，流速約為0.5-1.0ml/min。取少量流過液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并與細(xì)胞粗提物的電泳進(jìn)行比較，觀察親和柱的蛋白結(jié)合效率。上柱前可將細(xì)胞粗提物與ColumnBuffer按比例1:2-1:5混合稀釋，以提高蛋白結(jié)合效率。7.洗柱用800mL(至少20倍柱床體積)的緩沖液徹底洗柱，由于CBD(幾丁質(zhì)結(jié)合域)和Chitinbeads(幾可丁珠)的結(jié)合力很強(qiáng)，洗柱時可以用較高的流速(如2-3ml/min)和更苛刻的洗柱條件(如高鹽1MNaCl和/或非離子性去污劑)。8.誘導(dǎo)Intein的自我裂解活性:Intein位于目的蛋白的C端，用3倍柱床體積的Buffer(緩沖液)B3(含30-50mMDTT)洗柱，用柱帽堵上，4。C放置過夜。用于IPL(內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白連接反應(yīng))連接反應(yīng)的目標(biāo)蛋白(C末端帶有硫酯鍵)則需用BufferB4(含MESNA巰乙磺酸鈉)誘導(dǎo)intein的裂解。Intein位于目的蛋白N端，用3倍柱床體積BufferB2洗柱，溫室放置過夜。9.目標(biāo)蛋白的洗脫次日，用3倍柱床體積的BufferBl或相應(yīng)的誘裂解Buffer3(-DTT)，將目的蛋白洗脫收集。大約收集8-10管，每管5-7.5ml(1/2柱床體積)。目標(biāo)蛋白大多在一個柱床體積里被洗脫(約20ml)，可以很方便的通過280nmUV吸光值或Bradford蛋白檢測法進(jìn)行檢測。10.SDS-PAGE電泳分析Chitin柱上結(jié)合的intein-CBD及未洗脫的目的蛋白可通過1%SDS洗脫分離觀察intein的裂解效率。(此外，還有一種更簡便的方法取40plchitinbeads,加入203xSDSSampleBuffer混勻，吸取5上樣，SDS-PAGE電泳分析。11.Chitin樹脂的再生Chitin樹脂可通過以下步驟重復(fù)再生使用4-5次。用3倍柱床體積的0.3MNaOH(即蛋白剝脫液StrippingSolution)漂洗Chitin柱，使樹脂在該液中浸泡30分鐘后，再用7倍柱床體積的0.3MNaOH進(jìn)一步洗脫，最后用20倍柱床體積的水和5倍柱床體積的ColumnBuffer漂洗。Chitin樹脂可貯存于4"。如長時間貯存，則需在ColumnBuffer(洗脫緩沖液)中添加0.02%的疊氮鈉。四、目的蛋白純化采用IMPACT系統(tǒng)進(jìn)行目的蛋白純化。IMPACT系統(tǒng)是NEB公司開發(fā)研制的一種蛋白融合表達(dá)及純化系統(tǒng)。IMPACTTM表達(dá)的目的蛋白與蛋白自剪接元件(稱為"內(nèi)含肽"，intein)及幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白形成融合蛋白，通過幾丁質(zhì)柱親和純化融合蛋白。然后誘導(dǎo)內(nèi)含肽的肽鍵裂解活性，在幾丁質(zhì)介質(zhì)上將目標(biāo)蛋白釋放出來，而內(nèi)含肽與幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白仍結(jié)合在幾丁質(zhì)介質(zhì)上，達(dá)到單柱分離純化蛋白的目的。五、目的蛋白的鑒定方法融合蛋白用12。/。的SDS-PAGE(變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)，已純化的目的蛋白小肽用Tricine凝膠電泳鑒定，若需進(jìn)一步區(qū)分多聚體形式、環(huán)化形式及線性形式的蛋白則需要激光飛行質(zhì)譜法檢測。所測氨基酸序列為Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Val-Val-Tyr-Gly-Leu陽Arg隱Ser-Lys。SEQIDNO.l如下SEQUENCELISTING<110>河北醫(yī)科大學(xué)<120>—種重組抗癌肽及其制備方法和其應(yīng)用<130>0701<160>1<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>13<212〉PRT<213>人源骨橋蛋白(Humanosteopontin)<400>1GlyArgGlyAspSerValValTyrGlyLeuArgSerLys1510實(shí)施例2本發(fā)明抗癌肽(以下簡稱重組13肽)對腫瘤細(xì)胞遷移的抑制作用。將細(xì)胞接種于玻片上，細(xì)胞生長至IOO%融合后，取出玻片，用無菌吸頭在玻片上劃痕.PBS洗凈被刮下的細(xì)胞后，將玻片置于含13肽(10、20pg/ml)的培養(yǎng)液中，繼續(xù)孵育24h后取出，進(jìn)行固定和HE染色.于低倍鏡下觀察細(xì)胞傷口愈合情況.任意取3個視野，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞的數(shù)量，以此表示細(xì)胞的遷移活性.以空白培養(yǎng)基為陰性對照。詳細(xì)結(jié)果見表l。表1:重組13肽對細(xì)胞遷移能力的抑制作用(以20pg/ml為例)細(xì)胞類型陰性對照組13肽處理組血管平滑肌細(xì)胞320±2576±15*MCF-7573±49173±22*OVCAR431±62113±28*HT29332±3989±28**P<0.05結(jié)果表明，重組13肽能夠有效降低細(xì)胞的遷移、運(yùn)動能力，通過局部給藥，可適用于防治以細(xì)胞遷移為機(jī)制的疾病，如血管內(nèi)膜增生和腫瘤的周邊浸潤。實(shí)施例3重組13肽對腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制作用將細(xì)胞接種于直徑5微米的微孔濾膜上，將濾膜至于一Boyden小室上、下層之間(接種細(xì)胞面向上)，將含13肽(10、20ng/ml)的培養(yǎng)液加入上室(陰性對照同上)，下室均加入含10°/。小牛血清的培養(yǎng)基，于37"C孵育6小時，取出后用棉簽刮除接種面的細(xì)胞，然后將膜固定，于顯微鏡下取3個視野，計(jì)數(shù)穿至膜背面的細(xì)胞數(shù)，以此表示細(xì)胞的侵襲能力。詳細(xì)結(jié)果見表2。表2:13肽處理組6±1.5*17±2.2*23±2.8*29±8*細(xì)胞類型陰性對照組血管平滑肌細(xì)胞20±5MCF-773±9OVCAR131±32HT29153±39*P<0.05結(jié)果表明，重組13肽具有抑制細(xì)胞侵襲的能力，局部給藥可用于減少腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。實(shí)施例4重組13肽對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用脾內(nèi)種植瘤肝轉(zhuǎn)移膜型手術(shù)暴露腹腔，取2><106細(xì)胞，用含13肽(10、20|ig/ml)的培養(yǎng)基預(yù)處理l小時后，將細(xì)胞注射至BALB/c-nu/nu脾包膜內(nèi)，于術(shù)后15天取脾和肝臟，測量瘤體積和肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。陰性對照同上。詳細(xì)結(jié)果見表3。表3:重組13肽對腫瘤肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率的影響(％，n=20)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果表明，重組13肽能夠降低腫瘤肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。實(shí)施例4按照本領(lǐng)域已知的方法制備片劑，每片含有下述成分:重組十三肽50mg乳糖70mg硬脂酸鎂3mg聚乙烯比咯烷酮130mg實(shí)施例5取以一下各成分，按照本領(lǐng)域己知的方法制備成凍干注射劑:重組十三肽150mg水解明膠5mg甘露醇10mg半胱氨酸1.0mg注射液用水lml本發(fā)明中所用溶劑、試劑、洗脫液等化學(xué)制劑均可從專業(yè)銷售商或商店購得。以下內(nèi)容是本發(fā)明中所用溶劑、試劑、洗脫液等化學(xué)制劑的英文名稱及組成CellLysisandColumnBuffer(BufferBl)(—種細(xì)胞裂解液和洗脫緩沖液)20mMNa-HEPES(orTris-HClorNa-Phosphate)(pH8.5orifneeded,pH6.0-9.0)500mMNaCl(or50-1000mMNaCl)1mMEDTA(optional)(—種絡(luò)合劑)BufferB2(—種細(xì)胞裂解液和洗脫緩沖液)20mMNa國HEPES(alternatively,Tris-HClorNa-Phosphate)(pH7.0)500mMNaCl(or50-1000mMNaCl)1mMEDTA(optional)BufferB3(CleavageBufferforthiolinducedcleavage)(—種裂解緩沖液)20mMNa-HEPES(orTris-HClorNa誦Phosphate)pH8.5(orpH8.0—9.0)500mMNaCl(or50-1000mMNaCl)1mMEDTA(optional)40mMDTTor卩-mercaptoethanolorcysteine*(30—50mM)*2-mercaptoethanesulfonicacid(用于內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白連接反應(yīng))(Intein-meditatedProteinLigation(IPL))(內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白連接)反應(yīng)BufferB斗用于內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白連接反應(yīng)Intein-meditatedProteinLigation(IPL)20mMNa曙HEPES(orTris-HClorNa-Phosphate)pH8.5(orpH8.0—9.0)500mMNaCl(or50-1000mMNaCl)50mM2-mercaptoethanesulfonicacid(or30一50mM)StrippingSolutionI(—種蛋白剝脫液)用于洗脫Chitin柱上結(jié)合的intein-CBD及未洗脫的目的蛋白；Chitin柱的再生。1%SDS:20mMNa畫HEPES(orTris-HClorNa-Phosphate)pH8,5(orpH8.0-9.0)500mMNaCl(or50-1000mMNaCl)StoreatroomtemperatureStrippingSolutionII(用于Chitin柱的再生):0.3MNaOH。權(quán)利要求1、一種重組抗癌肽，其氨基酸序列為SEQIDNO.1。2、一種權(quán)利要求1所述的抗癌肽的制備方法包括以下步驟a、用質(zhì)粒pTWIN2載體，經(jīng)內(nèi)切酶BspQI處理后，插入粘性末端的含有OPN的RGD序列的十三肽，在設(shè)計(jì)引物時加上了半胱氨酸TGC，經(jīng)過引物變性、退火的方法使引物與酶切處理后的載體按l:10(摩爾比)16"C連接過夜，得到重組質(zhì)粒pTWIN2-RGD;b、將重組質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌消化，轉(zhuǎn)入大腸菌或大腸埃希菌，誘導(dǎo)收集純化目的蛋白。3、包括有SEQIDNO.l的表達(dá)載體。4、權(quán)利要求1所述的抗癌肽在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。5、權(quán)利要求1所述的抗癌肽在制備治療腸癌藥物中的應(yīng)用。6、權(quán)利要求1所述的抗癌肽在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。7、權(quán)利要求1所述的抗癌肽在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用。8、權(quán)利要求1所述的抗癌肽在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求1所述的抗癌肽在制備治療肺癌藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開一種氨基酸序列為SEQIDNO.1的抗癌肽，其表達(dá)體和其制備方法及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。該方法包括a.用質(zhì)粒pTWIN2載體，經(jīng)內(nèi)切酶BspQI處理后，插入粘性末端的含有OPN的RGD序列的十三肽，在設(shè)計(jì)引物時加上了半胱氨酸TGC，經(jīng)過引物變性、退火的方法使引物與酶切處理后的載體按1∶10(摩爾比)16℃連接過夜，得到重組質(zhì)粒pTWIN2-RGD；b.將重組質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌消化，轉(zhuǎn)入大腸菌或大腸埃希菌，誘導(dǎo)收集純化目的蛋白。本發(fā)明抗癌肽具有良好的抗癌活性，且易于合成。文檔編號C07K7/08GK101153056SQ200710062538公開日2008年4月2日申請日期2007年8月10日優(yōu)先權(quán)日2007年8月10日發(fā)明者溫進(jìn)坤,梅韓申請人:河北醫(yī)科大學(xué)