專利名稱：從核桃青皮中提取核桃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從核桃青皮中提取核桃酮的方法。
技術(shù)背景胡桃科核桃屬(Jwg/mw丄.)植物，全世界約18種，主要分布于北溫帶。我 國有5種，其枝、葉、外果皮、根皮、堅果內(nèi)核及果仁可入藥。核桃對泌尿系統(tǒng) 結(jié)石、慢性氣管炎、皮炎、濕疹及痢疾等疾病療效很高。唐代名醫(yī)孟詵闡述核桃 具有"通經(jīng)脈、潤血脈、常服骨肉細(xì)膩光潤"之功效；明代大醫(yī)學(xué)家李時珍對核桃 仁的醫(yī)藥價值的概括為"補(bǔ)氣養(yǎng)血，潤燥化痰，益命門，利三焦，溫肺潤腸"。核 桃及核桃楸的未成熟果實或外果皮(青龍衣)具有清熱、解毒、止痢、明目的功 效；核桃楸的根皮在韓國作為民間藥物治療癌癥；在印度和非洲，核桃各個部位 的提取物作為民間藥物使用了很多年。核桃屬植物的化學(xué)成分主要有萘醌、黃酮、 多酚、二芳基庚垸、萜類及以上各類的苷類化合物。該屬植物普遍具有抗菌、抗 腫瘤、鎮(zhèn)痛和清除自由基等藥理活性。國內(nèi)外研究表明截至目前從核桃屬植物中分離得到50多種化合物，其中萘醌 及其苷類、二芳基庚垸及其苷類化合物具有較強(qiáng)的抗癌及抗氧化活性。目前，國 內(nèi)夕卜已經(jīng)從青霉菌Pem'ci〃z'wm c/Zwraww var. aureum的代話j產(chǎn)物(Chem. Pharm. Bull.， 34: 4， 1986， 1497-1500)，核桃Ag/a附reg/a L的枝皮(Phytochemistry， 27: 12， 1988， 3929-3932)，稻瘟霉(尸j^a/ton'a or_yzae) (Khim. Prir. Soedin.， 4， 1991， 471-475)，黑麥草褐色條斑菌5to/ecW〃'c/u/m graOT,'m^ Fuckel (Biosci. Biotechnol. Biochem.， 58: 11， 1994, 1956-1959)， Z)—ge/asv'"o，ra gr匿w々' Cailleux (Chem. Pharm. Bull.， 46: 3， 1998， 423-429)，，由 (J, Nat. Prod.， 62: 1， 1999， 114-118)，灰色腐殖霉/fwmco/agn&a (Tetrahedron, 58: 45， 2002， 9163—9168)，核桃楸Jwg/ara ma"c^/mn'ca Maximowicz的根，果實 和樹皮(Chem. Pharm, Bull,， 51: 3， 2003， 262-264; Chem. Pharm. Bull.， 53: 8, 2005， 934-937)，黃杞五"ge/ZwWaTOx6wg/ 'a"aWall的根(PlantaMed.， 71: 2， 2005， 171-175)等多種微生物的代謝產(chǎn)物或植物體中提取分離得到核桃酮核桃產(chǎn)業(yè)的核桃青皮中提取分離核桃酮目前沒有文獻(xiàn)報道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種從核桃青皮中提取核桃酮(Regiokme)的方法。 本發(fā)明以核桃青皮為原料，通過原料釆集加工，溶劑提取，普通硅膠柱層析分離，結(jié)晶和重接晶等步驟得到核桃酮。一種從核桃青皮中提取核桃酮的方法，其特征在于該方法包括原料采集加工、浸膏提取、分離純化三個步驟A、 原料采集加工采集核桃青皮，干燥，粉碎；B、 浸膏提取步驟采用乙醇對原料冷浸或回流熱提得總浸膏；C、 分離純化總浸膏用水混懸，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇進(jìn)行液液分配萃取得到FA、 FB、 Fc三個組分；FB組分用石油醚/乙酸乙酯或丙酮以不同體積比例混和組成的溶劑，按極性從小到大，梯度洗脫，進(jìn)行普通硅膠柱色譜分離，收集極性范圍石油醚/乙酸乙酯或丙酮在6:1到2:1的組分？83^3以石油醚/乙酸乙酯或丙酮按 體積比4:1組成的混和溶劑重新進(jìn)行柱色譜分離，收集在紫外燈254 nm下顯黃色 熒光部分得核桃酮粗品，以石油醚和乙酸乙酯按體積比2:1組成的混和溶劑重結(jié) 晶得到核桃酮。對于分離純化步驟，我們也可以采取如下措施來實現(xiàn) 總浸膏直接用硅膠拌樣，用石油醚/乙酸乙酯或丙酮以不同體積比例混和組 成的溶劑，按極性從小到大，梯度洗脫，進(jìn)行普通硅膠柱色譜分離，收集極性范 圍石油醚/乙酸乙酯或丙酮在6:l到2:l的組分FB3; FB3以石油醚/乙酸乙酯或丙酮按 體積比4:1組成的混和溶劑重新進(jìn)行柱色譜分離，收集在紫外燈254 nm下顯黃色 熒光部分得核桃酮粗品，以石油醚和乙酸乙酯按體積比2:1組成的混和溶劑重結(jié) 晶得到核桃酮。按本發(fā)明提供制備方法分離所得核桃酮(Regiolone)在制備具有抗腫瘤及 癌化學(xué)預(yù)防作用藥物中的應(yīng)用，其特征在于該化合物具有抗癌活性。 本發(fā)明的優(yōu)點在于1、利用核桃青皮為原料提取核桃酮，資源豐富，可以廢物利用。 L首次從核桃青皮中提取分離到具有抗癌活性的化合物核桃酮(Regiolone);3、按本發(fā)明提供的制備方法，提取分離制備核桃酮工藝簡單，方法可靠， 產(chǎn)率高，化合物純度好。本發(fā)明涉及化合物核桃酮(Regiolone)屬于-萘醌類化合物，具有<:1()111003 的分子式和式I所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)過1^^111、 ^CNMR數(shù)據(jù)與參 考文獻(xiàn)(Phytochemistry， 27: 12， 1988， 3929-3932)的對比及單晶X衍射實驗 確定并具有以下理化常數(shù)，譜學(xué)數(shù)據(jù)以及晶體參數(shù)無色結(jié)晶(乙酸乙酯)，熔點73-74 。C，[]效士0。(c1.3， CH2C12); 'H-NMR (400 MHz， CDC13， ppm):12.4 (1H, s， OH陽8)' 7.46 (1H， t, /=8,4， 7.6 Hz， H-6)， 6.99 (1H, d' J=7.6Hz， H-5), 6.89 (1H， d， J=8.4Hz， H-7)， 4.88 (1H， dd， J=7.2Hz， 4.0)， 2.97 (1H， ddd， /=18.0， 8.4， 4.8 Hz， H-2a)， 2.62 (1H， ddd， J-18.0Hz， 8.4， 4.8' H-2b)， 2.31 (1H， m， H-3a)， 2.16 (1H, m， H-3b); '3C菌R (lOOMHz， ppm): 204.4 (C-l)， 162.4(C-8)， 145.8 (C-9), 136.9(C-6)， 117.5 (C-5)， 117.4(C-7)， 115.1 (C-IO)，67.5 (C-4)， 34.5 (C-2)， 31.1 (C-3)。核桃酮的晶體數(shù)據(jù)分子式<21(^1()03，分 子量Mr= 178.18，晶系Monoclinic，空間群P2(l)/c，晶胞參數(shù)a= 12.4859 (3)A，6= 16.6010 (5) A，c = 8.7947 (2) A, = 109.4270(10)。， r= 1719.16 (8) A3, 晶胞內(nèi)分子數(shù)Z=8，晶體密度Dx=1377Mgm—3，衍射光源MoKaradiation, 入射角 - 0.71073A,衍射點Cell parameters from 1898 reflections,掃描角 度 =2.45-21.92°， 〃 = 0.102 mm_1，溫度r= 294 K，晶體形態(tài)柱狀無色 結(jié)晶，晶胞體積0.25 x 0.20 x 0.19 mm。
圖1為式I化合物核桃酮的^NMR圖。 圖2為式I化合物核桃酮的13CNMR圖。 圖3為式I化合物核桃酮的DEPT圖。 圖4為式I化合物核桃酮的X-Ray晶體結(jié)構(gòu)。 圖5為式I化合物核桃酮的晶胞堆積圖。
具體實施方式
為了更清楚的理解本發(fā)明，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本 發(fā)明不限于以下實施例。實施例l:核桃青皮中核桃酮的提取分離A、 原料采集加工步驟采集核桃青皮適量，陰干，適當(dāng)粉碎。B、 浸膏提取步驟取核桃青皮5Kg，加入8倍量95%乙醇，冷浸(7dx3)， 過濾，減壓回收溶劑得總浸膏200g。C、 分離步驟將200 g浸膏混懸于1000 mL水中，用300 mL石油醚(60-9(TC) 萃取3次，回收溶劑得浸膏FA20g，剩余物用300mL乙酸乙酯萃取3次，回收 溶劑得浸膏FB 30 g，剩余物用300 mL正丁醇萃取3次得浸膏Fc 40 g。將乙酸 乙酷部分浸膏Fb用35g硅膠(100-200目)拌樣，600 g硅膠(200-300目)上 普通玻璃層析柱，石油醚(60-9(TC)/乙酸乙酯(10:1 -2:1)進(jìn)行梯度洗脫，500mL 為一流份，回收溶劑，用薄層色譜在紫外燈(UV)下鑒別，合并相同組分，得 FB1(3.5g， 10:1)、 FB2(4g， 8:1)、 FB3 (10 g， 6:1-2:1)三個組分。組分FB3用12g 硅膠(100-200目)拌樣，120 g硅膠(200-300目)上普通玻璃層析柱，石油 醚(60-卯。C) /乙酸乙酯(4:1)洗脫，用薄層色譜在紫外燈(UV)下鑒別，合 并相同組分得核桃酮200 mg粗品，以石油醚(60-9(TC) /乙酸乙酯(4:1)混和 溶劑重結(jié)晶得核桃酮。實施例2:核桃青皮中核桃酮的提取分離A、 原料采集加工步驟采集核桃青皮適量，陰干，適當(dāng)粉碎。B、 浸膏提取步驟取核桃青皮5Kg，加入10倍量95%乙醇，回流熱提(2 hx3)，過濾，減壓回收溶劑得總浸膏250g。C、 分離步驟將250 g浸膏混懸于1000 mL水中，用300 mL石油醚(60-90。C ) 萃取3次，回收溶劑得浸膏FA25g，剩余物用300mL乙酸乙酯萃取3次，回收 溶劑得浸膏FB35 g，剩余物用300 mL正丁醇萃取3次得浸膏Fc50 g。將乙酸乙 酷部分浸膏Fb用35g硅膠(100-200目)拌樣，600 g硅膠(200-300目)上普 通玻璃層析柱，石油醚(60-90°C) /丙酮(10:卜2:1)進(jìn)行梯度洗脫，500mL為 一流份，回收溶劑，用薄層色譜在紫外燈(UV)下鑒別，合并相同組分，得Fb, (3.5 g， 10:1)、 FB2(4g， 8:1)、 FB3(10g， 6:1-2:1)三個組分。組分FB3用12g硅膠(100-200目)拌樣，120 g硅膠(200-300目)上普通玻璃層析柱，石油醚 (60-90°C) /丙酮(4:1)洗脫，用薄層色譜在紫外燈(UV)下鑒別，合并相同組分得核桃酮200 mg粗品，以石油醚(60-90°C) /丙酮(4:1)混和溶劑重結(jié)晶得核桃酮。實施例3:核桃青皮中核桃酮的提取分離A、 原料采集加工步驟采集核桃枝葉適量，陰干，適當(dāng)粉碎。B、 浸膏提取步驟取核桃葉5 Kg，加入8倍量水，回流提取(2h")，過 濾，減壓回收溶劑100g。C、 分離步驟將100 g浸膏用150 g硅膠拌樣上普通玻璃層析柱，石油醚 (60-90。C) /丙酮(10:1-2:1)進(jìn)行梯度洗脫，500mL為一流份，回收溶劑，用薄層色譜在紫外燈(UV)下鑒識，合并相同組分，得FA(10g， 10:1)、 FB1(10g, 9:1)， FB2(14g， 8:1)、 FB3(18g， 6:1-2:1)， Fc (20 g， 1: 1)四個組分。組分FB3 用20 g硅膠(100-200目)拌樣，200 g硅膠(200-300目)上普通玻璃層析柱， 石油醚(60-90°C) /乙酸乙酯(4:1)洗脫，用薄層色譜在紫外燈(UV)下鑒別， 合并相同組分得核桃酮200 mg粗品，以石油醚(60-90°C) /乙酸乙酯(4:1)混 和溶劑重結(jié)晶得核桃酮。實施例4:核桃酮對肝癌細(xì)胞HepG2的體外細(xì)胞毒作用A、 制備人肝癌細(xì)胞株HepG2懸液0.25。/。胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)液配成8xl04 個細(xì)胞/mL細(xì)胞懸液；接種細(xì)胞每孔10p L接種于96孔板中；B、 預(yù)培養(yǎng)37°C， 5。/。C02及飽和濕度下培養(yǎng)24h;C、 將藥物核桃酮和陽性對照順鉑按0.2、 0.4、 0.6、 1.2、 1.6、 2,0 mol/mL 濃度加藥，每孔IOO L,每個濃度設(shè)三個復(fù)孔。37°C， 5。/。C02及飽和濕度下繼 續(xù)培養(yǎng)24h;D、 24h后，取出培養(yǎng)板，每孔加入50% (質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA) 50 L 固定細(xì)胞，TCA的終濃度為10%，加在每孔液面上，在4'C冰箱中放置lh;培 養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5次，去除TCA，在空氣中干燥后，每孔加0.4%的 SRB100 L，室溫下放置10 30min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5次， 去除未結(jié)合的用空白對照調(diào)零，將所獲腫瘤細(xì)胞生長抑制率定義為藥物對腫瘤細(xì)胞的體外抑制 率，測定將藥物核桃酮的IC5o為1.16 mol/mL(順鉑0.67 mol/mL)。
權(quán)利要求
1、一種從核桃青皮中提取核桃酮的方法，其特征在于該方法包括原料采集加工、浸膏提取、分離純化三個步驟A、原料采集加工采集核桃青皮，干燥，粉碎；B、浸膏提取步驟采用乙醇對原料冷浸或回流熱提得總浸膏；C、分離純化總浸膏用水混懸，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇進(jìn)行液液分配萃取得到FA、FB、FC三個組分；FB組分用石油醚/乙酸乙酯或丙酮以不同體積比例混和組成的溶劑，按極性從小到大，梯度洗脫，進(jìn)行普通硅膠柱色譜分離，收集極性范圍石油醚/乙酸乙酯或丙酮在6∶1到2∶1的組分FB3.FB3以石油醚/乙酸乙酯或丙酮按體積比4∶1組成的混和溶劑重新進(jìn)行柱色譜分離，收集在紫外燈254nm下顯黃色熒光部分得核桃酮粗品，以石油醚和乙酸乙酯按體積比2∶1組成的混和溶劑重結(jié)晶得到核桃酮。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是分離純化步驟為 總浸膏直接用硅膠拌樣，用石油醚/乙酸乙酯或丙酮以不同體積比例混和組成的溶劑，按極性從小到大，梯度洗脫，進(jìn)行普通硅膠柱色譜分離，收集極性范 圍石油醚/乙酸乙酯或丙酮在6:l到2:l的組分FB3; FB3以石油醚/乙酸乙酯或丙酮按 體積比4:1組成的混和溶劑重新進(jìn)行柱色譜分離，收集在紫外燈254 nm下顯黃色 熒光部分得核桃酮粗品，以石油醚和乙酸乙酯按體積比2:1組成的混和溶劑重結(jié) 晶得到核桃酮。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從核桃青皮中提取核桃酮的方法。本發(fā)明以核桃青皮為原料，通過原料采集加工，溶劑提取，普通硅膠柱層析分離，結(jié)晶和重接晶等步驟得到核桃酮。通過藥理實驗表明核桃酮具有一定的抗癌活性，可作為腫瘤、癌癥的預(yù)防和治療藥物。本發(fā)明采用核桃青皮提取分離制備核桃酮工藝簡單，方法可靠，產(chǎn)率高，成本低；核桃青皮資源豐富，可以廢物利用。
文檔編號C07C45/00GK101328114SQ20071001823
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月23日
發(fā)明者柳軍璽, 邸多隆 申請人:中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所