專利名稱：一種急性胰腺炎模型動物胰腺組織rna的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及胰腺的基因克隆、基因功能及轉基因等分子生物學領域，更具體涉及一種急性胰腺炎模型動物胰腺組織RNA的提取方法，該方法亦適用于其它急性胰腺炎模型動物胰腺組織總RNA的提取。
背景技術：
急性胰腺炎是一種并發(fā)癥多、治療棘手的臨床常見重癥，目前對其發(fā)病機制的探討已深入到基因轉錄的水平。急性胰腺炎模型動物胰腺組織總RNA的提取，是進行cDNA文庫構建、Northern雜交、RNA差異顯示等實驗的基本技術。相對于正常動物胰腺組織而言，急性胰腺炎模型動物胰腺組織的總RNA提取難度比較大，主要原因是急性胰腺炎發(fā)病時，體內胰酶被異常激活，引起胰腺組織自身消化，導致大量腺泡細胞壞死，RNA迅速降解，因而提取的總RNA不完整，不利于后續(xù)實驗的順利進行。
RNA在核漿部位轉錄產(chǎn)生，約20％進入胞漿，留在核內將近80％的RNA在1小時內被RNA酶降解。急性胰腺炎發(fā)病時，胰酶激活消化胰腺組織，導致腺泡細胞壞死，細胞核崩解，RNA酶大量釋放，使RNA迅速降解。缺血、器械分離和修剪等因素均能增加腺泡細胞壞死的數(shù)量，加速RNA的降解過程。減少胰腺組織RNA降解的方法在于抑制胰酶的活性，最大限度的保持腺泡細胞存活數(shù)量。目前國內對于急性胰腺炎模型動物胰腺組織總RNA的提取技術未見報道，以急性胰腺炎胰腺組織總RNA為基礎的分子生物學研究亦較難開展，造成該領域研究的局限。
在已報道的動物組織RNA提取方法中，基本上是把組織從動物體內直接取出，然后放入提取液中提取總RNA，或置于液氮中保存，留待后期提取。上述方法適用于正常動物胰腺組織RNA的提取，但對于急性胰腺炎模型動物胰腺組織RNA的提取效果較差。急性胰腺炎模型動物胰腺組織RNA的提取，需要專用方法。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種從急性胰腺炎模型動物胰腺組織中提取總RNA的方法，該方法實驗過程簡便，操作方便、安全，實驗結果準確、有效，對于急性胰腺炎模型動物的胰腺組織進行RNA層面的研究(如基因克隆、cDNA文庫構建、蛋白質體外翻譯等)，將會起到明顯的促進作用。
實現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術方案是一種急性胰腺炎動物模型的胰腺組織總RNA提取方法，其特征在于，具體步驟如下1)制備灌洗液，成份如下HEPES 25mM，膠原酶IV 40U/ml，大豆胰蛋白酶抑制劑0.1mg/ml，NaCL 100mM，KCL 5mM，MgCL21mM，CaCL21mM，D-右旋糖14mM，谷氨酰胺2mM，2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)，用滅菌生理鹽水配制，將所述的灌洗液濾膜除菌后于95％O2、5％CO2、37℃孵育2小時以上備用；2)麻醉急性胰腺炎模型動物，從十二指腸乳頭處插管至主胰管，緩慢注入適量的灌洗液；3)切下模型動物胰腺組織，在4℃預冷的大豆胰蛋白酶抑制劑(0.2mg/ml)中修剪、涮洗，置于4℃的TRIzol裂解液中勻漿；4)按TRIzol裂解液試劑盒說明書的步驟，提取胰腺組織中的總RNA；并以分光光度法測定總RNA的濃度和OD260/OD280比值，估算其純度，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。
本方面的方法能夠抑制胰酶的活性，最大限度的保持腺泡細胞存活數(shù)量。所配制的灌洗液，其離子濃度、營養(yǎng)成分、PH值等均適宜腺泡細胞的生存。切下的胰腺組織在高濃度的大豆胰蛋白酶抑制劑中修剪、涮洗，可進一步抑制胰酶的活性。使用上述方法對急性胰腺炎模型動物胰腺組織進行前處理，可以使提取出的總RNA純度和完整性達到實驗要求。
圖1、2、3分別為新鮮組織法、液氮冷凍法和本方法提取的急性胰腺炎大鼠胰腺組織總RNA的1％瓊脂糖凝膠電泳圖。每張圖中，自左向右的泳道分別為急性壞死型胰腺炎、急性水腫型胰腺炎和正常組大鼠胰腺組織的總RNA。
下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，該實施例用于進一步解釋本發(fā)明，本發(fā)明不限于該實施例。
具體實施例方式
1.實驗藥品的配制和實驗用品的處理1)實驗藥品的配制灌洗液HEPES 25mM，膠原酶IV 40U/ml，大豆胰蛋白酶抑制劑0.1mg/ml，NaCL 100mM，KCL 5mM，MgCL21mM，CaCL21mM，D-右旋糖14mM，谷氨酰胺2mM，2％(w/v)BSA，用滅菌生理鹽水配制，濾膜除菌后于95％O2、5％CO2、37℃孵育2小時備用。
大豆胰蛋白酶抑制劑(0.2mg/ml)用滅菌生理鹽水配制，4℃保存。
75％乙醇用DEPC處理過的不含RNA酶的去離子水配制，4℃保存。
TE溶液用DEPC處理過的不含RNA酶的去離子水，稀釋滅菌包裝的TE濃縮液。
2)實驗用品的處理去離子水加入0.1％濃度的DEPC，37℃溫浴12小時，經(jīng)125℃高溫處理2次，每次30分鐘，以去除DEPC活性。玻璃勻漿器、金屬手術器械于180℃連續(xù)烘烤4小時；塑料離心管、槍頭(不含RNA酶和DNA酶)；電泳槽和加樣梳用3％雙氧水浸泡過夜。
2.急性胰腺炎動物模型的制作采用5％?；悄懰徕c逆行胰膽管注射的方法，建立大鼠急性壞死型胰腺炎模型；采用腹腔注射雨蛙素的方法，建立大鼠急性水腫型胰腺炎模型。
3.取材麻醉急性胰腺炎模型大鼠，從十二指腸乳頭處插管至主胰管，緩慢注入3～5ml的灌洗液；切下模型動物胰腺組織，在4℃預冷的大豆胰蛋白酶抑制劑(0.2mg/ml)中修剪、涮洗，置于4℃的TRIzol裂解液中。
4.抽提、沉淀、離心得到總RNA1)取組織塊50～100mg，加入TRIZOL裂解液1ml，玻璃勻漿器研磨5～15分鐘，室溫裂解5分鐘。
2)4℃，12000rpm離心10分鐘，取上清，按200μl/ml TRIzol加入氯仿，手動劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
3)4℃，12000rpm離心15分鐘。取上清至1.5ml離心管，按500μl/mlTRIzol加入異丙醇，室溫放置10分鐘。
4)4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，加入75％乙醇1ml，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。
5)4℃，7500rpm離心5分鐘，棄上清，風干，加入20μl TE溶解沉淀，60℃孵育10分鐘，-70℃保存。
5.RNA樣品濃度、純度和完整性鑒定1)快速電泳檢測使用含有EB的1％瓊脂糖凝膠，負極加樣，上樣量為4μl，在120V電壓下電泳20分鐘。電泳后凝膠成像儀檢測，結果顯示泳道中有5S、18S、28S三條RNA條帶。5S的亮度較淺，28S∶18S的亮度和寬度比較接近2∶1(見附圖1～3，表1)，而且DNA污染不明顯，說明本發(fā)明方法所提取的RNA達到完整性要求。以常規(guī)的新鮮組織法和液氮冷凍法為對照，對照樣品RNA有明顯降解現(xiàn)象。
2)分光光度法檢測以DEPC處理的去離子水調零，每個樣本取2μl，用紫外分光光度計測定各組樣本的濃度(ng/μl)、純度(OD260/OD280比值)。檢測結果見表2和表3表1不同提取方法所得大鼠胰腺組織RNA的完整性(單位％)
表2不同提取方法所得大鼠胰腺組織RNA純度(單位％)
表3不同提取方法所得大鼠胰腺組織RNA濃度(單位ng/μl)
注△，與其他兩組比較，P＜0.05本發(fā)明方法所提取的RNA，其OD260/OD280比值接近于2.0，純度符合要求；至于新鮮組織法和液氮冷凍法提取的RNA樣本，其OD260/OD280比值過高可能與28s和18s大量降解有關。另外，本發(fā)明方法提取的RNA得率也明顯高于兩個對照組(P＜0.05)。
本發(fā)明克服了傳統(tǒng)提取方法所致的降解快、含量低等缺點，亦適用于其它急性胰腺炎模型動物胰腺組織總RNA的提取。此項發(fā)明技術對于急性胰腺炎模型動物的胰腺組織進行RNA層面的研究(如基因克隆、cDNA文庫構建、蛋白質體外翻譯等)，將會起到明顯的促進作用。
權利要求
1.一種從急性胰腺炎動物模型的胰腺組織中提取RNA的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一，制備灌洗液，該灌洗液的配制如下HEPES25mM，膠原酶IV40U/ml，大豆胰蛋白酶抑制劑0.1mg/ml，氯化鈉100mM，氯化鉀5mM，氯化鎂1mM，氯化鈣1mM，D-右旋糖14mM，谷氨酰胺2mM，2％(w/v)的牛血清白蛋白，用滅菌生理鹽水配制；將所述的灌洗液濾膜除菌后于95％O2、5％CO2、37℃孵育2小時備用；步驟二，麻醉急性胰腺炎模型動物，從十二指腸開口處插管至主胰管，緩慢注入適量的灌洗液；步驟三，切下胰腺，在4℃預冷的大豆胰蛋白酶抑制劑中修剪、涮洗，置于4℃的TRIzol裂解液中勻漿；步驟四，按TRIzol裂解液試劑盒說明書的步驟，提取胰腺組織中的RNA，并以分光光度法測定總RNA的濃度和OD260/OD280比值，估算總RNA的純度，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的大豆胰蛋白酶抑制劑濃度為0.1-0.5mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種急性胰腺炎動物模型的胰腺組織總RNA提取方法，首先制備灌洗液，將其濾膜除菌后于95％O
文檔編號C07H21/02GK101058590SQ20071001797
公開日2007年10月24日 申請日期2007年6月4日 優(yōu)先權日2007年6月4日
發(fā)明者李宗芳, 夏先明, 張澍, 楊軍, 黃辰, 王波, 張愛軍 申請人:西安交通大學