專利名稱：：抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義核酸的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一類針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)耐藥基因mecR1/mecA和blaR1/blaZ的反義核酸序列及其制備含有該反義核酸序列的藥物及其用途。
背景技術：
：目前細菌耐藥問題在全球范圍內己經愈演愈烈，許多曾經可以治愈的細菌感染性疾病正在成為難以治愈的疾病。MRSA是醫(yī)院內感染和社區(qū)感染的重要致病菌，自1961年首次發(fā)現MRSA以來，特別是80年代后，MRSA感染率在大部分地區(qū)均呈明顯上升趨勢，如在美國MRSA的感染率從1974年的2%增至2003年的接近60%，30年來幾乎增加了30倍；意大利從1981年的6%上升到1996的26%。隨著MRSA感染率的不斷提升，其致死率也迅速上升，英國統計資料顯示，1993年至2002年間MRSA致死率提高了15倍，一旦全身感染其致死率高達50%以上。MRSA具有多藥耐藥性，它不僅對幾乎所有P-內酰胺類抗生素耐藥，而且對頭孢菌素類、氨基糖甙類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類、氟喹喏酮類、磺胺類等多種抗生素耐藥，因此使很多臨床上有效的抗生素失效，大大限制了醫(yī)生們的用藥，除了糖肽類的萬古霉素和考拉替寧外幾乎無藥可用。但1996年日本報道了第一例對萬古霉素敏感性下降的MRSA(MIC=8ug/ml)，當時就有專家預言VRSA的出現只是一個時間上的問題，不出所料2002年6月美國公布了第一例VRSA(萬古霉素MIC=128pg/ml)。盡管現在VRSA的檢出率仍不高，但它的出現必將為MRSA的治療帶來更大的困難，應受到高度重視，以防有朝一日使MRSA的治療面臨無藥可用的境地。因此，尋找有效對抗MRSA耐藥性的藥物作用新耙點及藥物成為研究者們關注的焦點之一。金黃色葡萄球菌產生耐藥性的機制主要有以下兩種1.生成P-內酰胺酶，使卩-內酰胺環(huán)裂開導致p-內酰胺類抗生素水解失活，P-內酰胺酶由基因blaZ編碼；2.生成新的青霉素結合蛋白2a(PBP2a)，細菌的細胞壁上存在著粘肽合成酶即青霉素結合蛋白(PBPs)，PBPs是P-內酰胺類抗生素的作用靶點。MSSA有5禾中PBPs，分另ij為PBP1(87KDa)，PBP2(80Kda)，PBP3(75Kda)，PBP3'(70Kda)及PBP4(41Kda)，而MRSA比MSSA多產生了一禾中78KDa的PBP2a，PBP2a的功能相當于MSSA全部主要PBPs的功能，并且與P-內酰胺類抗生素親和力極低，在此類抗生素存在的情況下仍能完成細菌細胞壁的合成，而失去對P-內酰胺類抗生素的敏感性。表達PBP2a的結構基因是mecA。調控MRSA耐藥基因表達的信號通路已被揭示，其中兩類基因(BlaZ和mceA)及其表達產物參與了金黃色葡萄球菌耐藥性的產生。blaZ和mceA的表達受到感受器/傳感器蛋白BlaR1、MecR1及與其相耦聯的抑制蛋白Blal、Mecl的調控。BlaR1和MecR1具有同源性，均為跨膜蛋白，它們胞外部分為感受器結構域，含有青霉素結合模序。細胞內為傳感器結構域，該序列具有裂解Blal及Mecl的功能。當誘導劑P-內酰胺類抗生素結合到BlaR1的感受器結構域，BlaR1被激活，其轉換器結構域內的鋅金屬蛋白酶序列裂解Blal，使Blal從BlaZ的啟動子區(qū)域解離，去除對BlaZ的阻遏作用，導致了BlaZ開始表達。mceA基因的表達由相似的感受器/轉換器蛋白和阻遏系統調控。調控基因blaR1和mecR1在耐藥基因BlaZ和mceA的表達中發(fā)揮著至關重要的作用。以基因為耙點的藥物中，最有應用前景的可能是反義核酸藥物，因為與傳統藥物比較反義核酸藥物具有高特異性、高選擇性的特點。反義寡聚核苷酸可干擾遺傳過程的多個階段①抑制轉錄，反義寡聚核苷酸同靶雙鏈DNA依據堿基配對原則，形成T-A-T、C-G-C三聯體(Triplex)。反義寡聚核苷酸可能結合于控制基因轉錄的轉錄子、增強子和啟動子區(qū)，通過定點切割或位阻效應阻止基因的轉錄；②抑制轉錄后加工，反義寡聚核苷酸可通過空間阻遏作用影響mRNA前體在核內加工過程，包括加帽、切除內含子、剪接、加尾、堿基修飾等，也阻止了mRNA向胞漿的轉運；③抑制翻譯，與mRNA翻譯起始部位和核糖體結合位點發(fā)生特異結合，形成RNA/DNA雙鏈，由于空間位阻效應而阻止核糖體與起始因子結合或者激活核糖核酸酶RNaseH，RNaseH能特異性切割并水解RNA-DNA異源雙鏈分子中的mRNA而使其失活，mRNA被水解后，其翻譯不能起動。10-23型脫氧核酶除了與底物特異性結合而抑制底物外，還能直接剪切RNA。一個脫氧核酶分子可反復利用，即可剪切多個RNA分子。另外脫氧核酶合成容易，有更多可供選擇的剪切靶位，在體內更加穩(wěn)定。脫氧核酶不僅可以像核酶那樣直接殺傷靶RNA，而且還有可能像反義寡核苷酸那樣引發(fā)RNaseH對靶RNA的水解。第一個反義核酸藥物Fomivirsen上市后，人們對反義療法更為重視。反義核酸藥物在防治腫瘤、病毒性感染、心血管疾病和自身免疫性疾病等方面均有重要意義。如今，反義寡聚核苷酸和脫氧核酶作為新型的基因治療藥物己經被廣泛應用于病毒、腫瘤、遺傳性疾病中?，F在國外已經有多種反義藥物進入I、II期臨床試驗階段，可望在不久的將來正式用于臨床。并非mRNA上所有的位點都可以作為反義核酸的作用靶點，主要因為RNA在體內不是以單鏈形式存在，而是具有一定的二級結構，因此RNA的二級結構、RNA結合蛋白或雜交的RNA都會對反義核酸、核酶和脫氧核酶造成影響。為了避免二級結構對反義核酸的影響，本發(fā)明需要預測RNA的二級結構，避免內部穩(wěn)定的結構和空間位置相距較遠的堿基，挑選一些不穩(wěn)定的部位，如發(fā)夾、內部環(huán)、膨脹環(huán)、多分支環(huán)等。目前反義核酸的設計仍沒有國際統一的標準，通常人們利用一些計算機軟件分析靶基因結構進行輔助設計。RNAstructure軟件就是其中應用較多的一種，它可按照自由能最低原理，理論上預測目的基因RNA的二級結構，計算反義寡核苷酸與各耙點結合時的能量變化。反義藥物的設計是否合理，不僅取決于序列自身的自由能，而且取決于靶位的自由能，兩者之間的自由能。通常他們的負值越低，越穩(wěn)定，不是良好的耙位點。因而根據反義核酸與靶序列結合的凈能量(OverallAG)、反義核酸與直鏈靶序列結合所需要的能量(DuplexAG或BindingAG)、反義核酸-靶序列結合后堿基從耙序列斷裂需要的能量(BreaktargAG)、反義核酸內結合所需要的能量(oligo-selfAG)、反義核酸間結合所需要的能量(oligo-oligoAG)和核酸-靶序列解鏈的溫度(Tm)等項參數，把反義靶點選在二級結構的不穩(wěn)定區(qū)域，從而使反義核酸與靶位點牢固結合。根據MatveevaOV.(MatveevaOV.等人.NucleicAcidsRes.31，4989-4994，2003)禾口CairnsM丄(CafrnsM丄等人.NatBiotechnol.17,480-486,1999)等文獻,以上參數最佳范圍為OverallAG<-10kcal/mol，DuplexAG<-25kcal/mol，oligo國selfAG》-1.1kcal/mol，oligo-oligoAG》-8kcal/mol，Tm^5(TC。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義核酸，該序列為一段人工合成的核苷酸序列，它與MRSA耐藥基因mecR1/mecA或blaR1/blaZ的特定位點序列是互補的。因此，將一定劑量本發(fā)明所述的反義硫代寡聚脫氧核苷酸或硫代脫氧核酶轉遞至MRSA菌體內，該類反義核酸能夠與靶基因的特定位點結合，從而抑制耐藥基因的表達，使MRSA恢復對內酰胺類抗生素的敏感性，從而達到有效對抗MRSA耐藥性的目的。'本發(fā)明的目的是這樣實現的，設計一種抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義核酸，它包括反義硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs)和硫代脫氧核酶(PS-DRz)，其特征在于可特異性與MRSA耐藥基因mecR1/mecA、blaR1/blaZ的不同區(qū)域結合，阻斷這些耐藥基因的表達，其反義核酸的堿基序列如下反義核酸篩選出的作用耙位點最佳核酸序列(5'—3')PS-ODNs01基因mecR1的35~124位ATCACTCTTACGAGATATPS-ODNs02基因mecR1的137-155位GAGCAGAGGTGCAATTAAPS-ODNs03基因mecR1的216~299位ACATAGACTGTGCTGAAGPS-ODNs04基因mecR1的379~605位CGTCAAGATGTTTTTCGTPS-ODNs05基因mecR1的717-755位CTACCTGTTACTGACACTPS-ODNs06基因mecR1的834~915位GTATTTATTACACCGTCGPS-ODNs07基因mecR1的985~1136位TTACTTGCCCTCGTTCGAPS-ODNs08基因mecR1的1207~1301位TGTTGTTACCCTATTTGTPS-ODNs09基因mecR1的1326-1434位ATTCTGTTCTACTCCAATPS-ODNs10基因mecR1的1550~1701位ACCTTGTCCTTAGCACTTPS-ODNs11基因blaR1的13~141位TCCTGCAAGAAGAGTTPS-ODNs12基因blaR1的185~297位GTGGGCGCTTGATTATPS-ODNs13基因blaR1的357417位AGTGACTGIIICTTTAPS-ODNs14基因blaR1的557~632位GTCIIIIGTCAATTACPS-ODNs15基因blaR1的958~1051位CGTTGTGTAAGGGCTTPS-ODNs16基因blaR1的1122~1304位TCTTGTTCCTTATTCC6PS-ODNs17基因blaR1的1349~1377位TGAGTTGAGTCGCAGTPS-ODNs18基因blaR1的1471~1491位ATGGTTATTTTGTTCCPS-ODNs19基因blaR1的1562~1627位TGTACCTGTTTTCCCAPS-ODNs20基因blaR1的1679~1732位ATTCAGCATTTTTCCCPS-DRz21基因mecR1的1683~1702位CATTCGCAGGCTAGCTACMCGATGTCTTCGCCTPS-DRz22基因mecR1的217~236位CTAACCGAAGAAGGGCTAGCTACAACGACGTGTCPS-DRz23基因mecR1的1681~1698位CGCATTGGGCTAGCTACAACGAC丌CGCCTTTPS-DRz24基因mecR1的1683~1700位TTCGCA丌GGGCTAGCTACAACGAC丌CGCCTPS-DRz25基因mecR1的1681~1700位丌CGCA丌GGGCTAGCTACAACGACTTCGCCTTTPS-DRz26基因mecR1的1683~1703位CCATTCGCAGGCTAGCTACAACGATGTC丌CGCCTPS-DRz27基因mecR1的1683~1704位GCCA丌CGCAGGCTAGCTACAACGATGTCTTCGCCTPS-DRz28基因mecR1的1685~1705位CGCCATTCGCAGGCTAGCTACAACGATGTC丌CGCPS-DRz29基因mecR1的1687~1706位TCGCCATTCGGGCTAGCTACAACGAA丌GTCTTCPS-DRz30基因mecR1的1685~1706位TCGCCATTCGCAGGCTAGCTACAACGATGTC丌CGCPS-DRz31基因blaR1的1359~1378位GCTTGAGTTGAGGGCTAGCTACAACGACGCAGTAPS-DRz32基因blaR1的201--219位CTTACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS-DRz33基因blaR1的201--220位AC丌ACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS-DRz34基因blaR1的201--221位GACTTACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS陽DRz35基因blaR1的201--222位TGAC丌ACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS-DRz36基因blaR1的732~750位AAGGACAAAGGCTAGCTACAACGACTATCGGCTPS陽DRz37基因blaR1的732~751位TAAGGACAAAGGCTAGCTACAACGACTATCGGCTPS-DRz38基因blaR1的1361-1378位GCTTGAGGGCTAGCTACAACGATGAGTCGCAGPS-DRz39基因blaR1的1360~1378位GC丌GAGTTGAGGGCTAGCTACAACGACGCAGTPS-DRz40基因blaR1的1358~1378位GCTTGAGTTGAGGGCTAGCTACAACGACGCAGTAT所述的硫代寡聚脫氧核苷酸為16~20個堿基，經全硫代修飾；硫代脫氧核酶除催化中心(保守序列的15個堿基)序列外，其兩端的堿基臂(如權利要求1表中的劃線部分)為17~21個堿基，均進行全硫代修飾。所述的PS-ODNs01~PS-ODNs10禾口PS-DRz21~PS-DRz30是革巴向mecR1基因的反義核酸，PS-ODNs1卜PS-ODNs20禾口PS-DRz31~PS-DRz40是耙向blaR1基因的反義核酸。所述的反義核酸用于抑制MRSA的耐藥基因表達、使MRSA恢復對p-內酰胺類抗生素的敏感性，用于抗MRSA感染的治療。所述的抑制mecR1和blaR1基因功能的反義核酸或抑制mecA和blaZ基因功能的反義核酸聯合應用，可以產生協同抑制MRSA耐藥性的作用。所述的反義核酸序列用于制備抗MRSA耐藥性藥物的用途。本發(fā)明的特點是以MRSA耐藥基因mecR1/mecA或blaR1/blaZ的全序列為耙點，該一系列的反義核酸序列，包括反義硫代寡聚脫氧核苷酸和硫代脫氧核酶，可特異性的與基因mecR1/mecA或blaR1/blaZ上的互補區(qū)域結合。硫代寡聚脫氧核苷酸為16~20個堿基，經全硫代修飾；硫代脫氧核酶除催化中心(為保守序列，15個堿基)序列外，其兩端的堿基臂為17~21個堿基，均進行全硫代修飾。通過藥效學實驗證明，本發(fā)明所述的互補于基因mecR1/mecA或blaR1/blaZ序列的反義核酸均具有抑制MRSA耐藥性的特性，在抗MRSA耐藥性治療方面顯示出廣闊的應用前景。圖1是菌落計數后的成像圖2是平板克隆形成實驗結果的統計圖3是15|jg/mlPS-ODNs11對不同循環(huán)數的blaR1mRNA表達的影響圖示；圖4是不同劑量的PS-ODNs11對blaR1mRNA表達變化的影響圖示；圖5是15|jg/mlPS-ODNs11對不同循環(huán)數的blaZmRNA表達的影響圖示；圖6是不同劑量的PS-ODNs11對blaZmRNA表達變化的影響圖示；圖7是菌落計數后的成像圖8是平板克隆形成實驗結果的統計圖。具體實施例方式細菌耐藥性的產生使得臨床上許多曾經有效的抗生素失效，因此本發(fā)明的研究目的是尋找新的逆轉MRSA耐藥性的藥物。為此，本發(fā)明根據MRSA的分子生物學信息，以MRSA的耐藥基因表達信號通路中的調控基因mecR1及blaR1為靶基因，利用電穿孔的方法將反義核酸藥物導入耐藥菌體內，用功能學實驗來評估反義藥物能否抑制或阻斷mecR1及blaR1的表達，從而逆轉MRSA的耐藥性；反義藥物(包括反義硫代寡聚脫氧核苷酸和硫代脫氧核酶)能否作為逆轉MRSA耐藥性的新藥物。本發(fā)明的研究結果提示，以MRSA耐藥基因mecR1及blaR1為靶點設計的反義核酸可以有效的抑制靶基因的轉錄、表達，部分的逆轉MRSA的耐藥性，恢復其對苯唑西林的敏感性。分別以mecR1和blaR1為耙點的反義核酸聯合應用，具有協同對抗MRSA耐藥性的作用。上述的反義核酸具有開發(fā)為抗MRSA耐藥性藥物的前景以下將以實施例具體描述本發(fā)明。實施例1抗mecR1或blaR1mRNA的反義硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs)及硫代脫氧核酶(PS-DRz)的設計在GENBANK中檢索到MRSA的耐藥基因mecR1/mecA的序列(基因編號gi:2791983)，該序列全長9047bP，編碼8個開放讀框，包括3個mec區(qū)和5個ORF區(qū)。該序列的化15bp至3372bp間的是mecR1基因序列，3472bp至5478bp之間的是mecA基因序歹U。mecR1全長1758bp，是mecA的上游基因，可編碼MecR1蛋白，調控mecA的表達；mecA全長2007bp，編碼青霉素結合蛋白PBP2a。利用同樣的方法檢索到blaR1/blaZ的基因組序列(基因編號gi:33390917)，該序列全長3080bp，編碼3個開放讀框，艮卩blaZ、blaR1和blal3個區(qū)。該序列的953bp至2710bp之間的是blaR1基因序列，1bp至846bp之間的是blaZ基因序列。blaR1全長為1758bp,編碼BlaR1蛋白，調控基因blaZ的表達；blaZ全長為846bp，編碼P-內酰胺酶。根據堿基互補原則，從DNA序列得到mecR1/mecA、blaR1/blaZ的mRNA，應用RNAstructure4.3計算機軟件進行輔助設計，篩選出一系列反義核酸作用耙位點，根據這些靶位點設計出相應的反義核酸，再根據自由能最低原理、反義寡聚核苷酸與靶序列結合的凈能量、反義寡聚核苷酸與直鏈靶序列結合所需要的能量、反義寡聚核苷酸-靶序列結合后堿基從靶序列斷裂需要的能量、反義寡聚核苷酸分子內結合所需要的能量、反義寡聚核苷酸分子間結合所需要的能量、核酸-靶序列解鏈的溫度等參數，挑選出一些條件較優(yōu)的反義核酸，同時設計了隨機對照的反義核酸(PS-ODNs41、PS-ODNs42、PS陽DRz51、PS-DRz61)。經BLAST軟件驗證實驗所用的反義核酸均具有高度特異性，并為增加其穩(wěn)定性進行了硫代修飾，由上海生物工程技術服務有限公司合成，這種合成技術及設備是本行業(yè)公知的。所述的硫代寡聚脫氧核苷酸為16~20個堿基，經全硫代修飾；硫代脫氧核酶除催化中心(保守序列的15個堿基)序列外，其兩端的堿基臂(如下表中的劃線部分)為17~21個堿基，均進行全硫代修飾。所述的PS-ODNs01~PS-ODNs10禾QPS-DRz21~PS-DRz30是耙向mecR1基因的反義核酸，PS-ODNs11~PS-ODNs20禾口PS-DRz31~PS-DRz40是靶向blaR1基因的反義核酸。所述的反義核酸用于抑制MRSA的耐藥基因表達、使MRSA恢復對p-內酰胺類抗生素的敏感性，用于抗MRSA感染的治療。所述的抑制mecR1和blaR1基因功能的反義核酸或抑制mecA和blaZ基因功能的反義核酸聯合應用，可以產生協同抑制MRSA耐藥性的作用。所述的反義核酸序列用于制備抗MRSA耐藥性藥物的用途。序列見表1。表1設計的反義硫代寡聚脫氧核苷酸和硫代脫氧核酶<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PS-ODNs10基因mecR1的1550~1701位ACCTTGTCCTTAGCACTTPS-ODNs"基因blaR1的13~141位TCCTGCAAGAAGAGTTPS-ODNs12基因blaR1的185~297位GTGGGCGCTTGATTATPS-ODNs13基因blaR1的357~417位AGTGACTGTTTCTTTAPS-ODNs14基因blaR1的557~632位GTCTTTTGTCAATTACPS-ODNs15基因blaR1的958~1051位CGTTGTGTAAGGGCTTPS-ODNs16基因blaR1的1122-1304位TCTTGTTCCTTATTCCPS-ODNs17基因blaR1的1349~1377位TGAGTTGAGTCGCAGTPS-ODNs18基因blaR1的1471~1491位ATGGTTAIIIIGTTCCPS-ODNs19基因blaR1的1562~1627位TGTACCTGIMICCCAPS陽ODNs20基因blaR1的1679~1732位ATTCAGCATTTTTCCCPS-DRz21基因mecR1的1683-1702位CATTCGCAGGCTAGCTACAACGATGTCTTCGCCTPS-DRz22基因mecR1的217~236位CTAACCGAAGAAGGGCTAGCTACAACGACGTGTCPS-DRz23基因mecR1的168卜1698位CGCA丌GGGCTAGCTACMCGACTTCGCCTTTPS-DRz24基因mecR1的1683~1700位丌CGCATTGGGCTAGCTACAACGAC丌CGCCTPS-DRz25基因mecR1的1681~1700位丌CGCATTGGGCTAGCTACAACGACTTCGCCTTTPS-DRz26基因mecR1的1683-1703位CCA丌CGCAGGCTAGCTACAACGATGTCTTCGCCTPS-DRz27基因mecR1的1683~1704位GCCA丌CGCAGGCTAGCTACAACGATGTCTTCGCCTPS-DRz28基因mecR1的1685~1705位CGCCATTCGCAGGCTAGCTACAACGATGTC丌CGCPS-DRz29基因mecR1的1687~1706位TCGCCATTCGGGCTAGCTACAACGAATTGTC丌CPS-DRz30基因mecR1的1685~1706位TCGCCATTCGCAGGCTAGCTACAACGATGTCTTCGCPS-DRz31基因blaR1的1359~1378位GC丌GAG丌GAGGGCTAGCTACAACGACGCAGTAPS-DRz32基因WaR1的201~219位C丌ACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS-DRz33基因blaR1的201~220位AC丌ACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS-DRz34基因blaR1的201~221位GACTTACTTTCMGGCTAGCTACMCGATGTGGGCPS-DRz35基因blaR1的201222位TGACTTACTTTCAAGGCTAGCTACAACGATGTGGGCPS-DRz36基因blaR1的732~750位AAGGACAAAGGCTAGCTACAACGACTATCGGCTPS-DRz37基因blaR1的732~751位TAAGGACAAAGGCTAGCTACAACGACTATCGGCTPS國DRz38基因blaR1的1361-1378位GC丌GAGGGCTAGCTACAACGATGAGTCGCAGPS-DRz39基因blaR1的1360-1378位GCTTGAGTTGAGGGCTAGCTACAACGACGCAGTPS-DRz40基因blaR1的1358-1378位GC丌GAGTTGAGGGCTAGCTACAACGACGCAGTAT實施例2PCR引物的設計與合成:依據GeneBank中報道的MRSA的mecR1、mecA、blaR1、blaZ及16srRNA的基因序列，用軟件PrimerPremier5.0設計了mecR1、mecA、blaR1、blaZ及16srRNA的五對特異性擴增引物。引物均經BLAST軟件驗證具有高度特異性，并由上海生物工程技術服務有限公司合成，序列見表2。表2設計合成的擴增引物引物引物序列產物長度mecR1弓l物5'-TGGTATTTGGTTTAGTGAA-3'5'-GATTAGGIIlAGGCATTGA隱3'414bpmecR1弓l物5'-ACACGACTTCTTCGGTTAG-3'5'-GTACAAIIIGGGATTTCACT-3'336bpmecA引物5'-CCACATTGTTTCGGTCTA-3'5'陽AGTTGTAGTTGTCGGGTT-3'446bpmecA引物5'-GCAATCGCTAAAGAACTAAG-3'5'-AATGGGACCAACATAACCTA-3'225bpblaR1引物5'-ACAATGAAGTAGAAGCCGATAGAT-3'5'-GTCGGTCAAGTCCAAACA-3'489bpblaZ引物5'陽AGAGATTTGCCTATGCTTCA-3'5'-AGTATCTCCGCTTTTATTATTT-3'464bp16srRNA引物5'-GTTATTAGGGAAGAACATATGTG-3'5'-CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC-3'750bp實施例3電感受態(tài)冊0-2的制備:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株冊0-2由中國細菌耐藥性監(jiān)測中心提供。lml新鮮過夜培養(yǎng)的冊0-2轉種于100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37°C、210rpm培養(yǎng)至對數生長中期，測其0D6。。=0.550.6。菌液冰浴20min后分裝(40ml/離心管)，6000rpm離心10min，棄去上清，細菌沉淀用40ml冰浴過的去離子水混勻重懸，6000rpm離心10min，棄去上清，重復2次。之后細菌沉淀用20ml冰浴過的10%的甘油混勻重懸，6000rpm離心10min,棄去上清。細菌沉淀用1ml冰浴過的10%的甘油混勻重懸，6000rpm離心10min，棄去上清，重復2次。1ml10%的甘油懸浮細菌沉淀，50lU分裝，-80。C凍存。以下實施例中是申請人選取實驗結果最好的硫代寡聚脫氧核苷酸和硫代脫氧核酶為例，其他的硫代寡聚脫氧核苷酸或硫代脫氧核酶同樣按照以下方法進行實驗。實施例4電穿孔法導入PS-ODNs或PS-DRz:50ii1融化的電感受態(tài)WH0-2與PS-ODNs或PS-DRz(無菌三蒸水溶解)混勻，注入預冷的0.1誦電轉杯中。調節(jié)電穿孔儀，使電脈沖為25pf，電壓900V，電阻200Q進行電擊。電擊后迅速加入37。C預熱的S0C培養(yǎng)基1ml，37°C、150rmp復蘇1h。PS-0DNs各分三個劑量組，分別為5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml，同時設空白對照組(加相同體積的去離子水)、隨機對照組濃度為15ixg/ml。PS-DRz各分三個劑量組，分別為5yg/ml、10ug/ml、15ug/ml，同時設空白對照組(加相同體積的去離子水)、隨機對照組的濃度為15ug/ml。.實施例5平板克隆形成實驗將復蘇的菌液稀釋106倍，吸取50ta稀釋菌液均勻涂布于含苯唑西林(6ug/ml)的M-H瓊脂培養(yǎng)基表面，35。C恒溫孵育48h，肉眼計數M-H瓊脂培養(yǎng)基平板上冊0-2的菌落數(CFU)。結果顯示實驗組(PS-ODNsll)的CFU均明顯低于空白對照組，具有統計學差異，PS-ODNsll的5、10、15ug/ml三個劑量組的抑制率分別是17%(代O.05)、24%(代0.05)、34%(代0.05)，并均隨著濃度的增加而抑制效應增強。而隨機對照組的CFU與空白對照組相比無顯著性減少。由此可見，PS-ODNs能減少WH0-2的菌落數。(見圖1、圖2)圖1、圖2是不同濃度的PS-ODNsll對WH0-2在含苯唑西林(6wg/ml)的M-H瓊脂培養(yǎng)基表面生長(CFU)的影響圖示。圖1是菌落計數后的成像圖，圖中a是空白對照組，b是PS-0DNs42組(15Ug/ml)，c是5ug/ralPS-0DNsl1組，d是10ug/mlPS-0DNsl1組，e是15ug/mlPS-ODNsll組。圖2是平板克隆形成實驗結果的統計圖，圖中C是空白對照組，M是隨機鏈PS-0DNs42對照組(15ug/ml)，5、10、15分別是5、10、15yg/ml的PS-0DNsl1組。*》0.05kscontrol;林代O.05kscontrol(5±s，n=ll)。圖1、圖2顯示了PS-ODNsll能顯著性減少冊0-2的菌落數。實驗組(PS-DRz21、PS-DRz31)的CFU均明顯低于空白對照組，具有統計學差異，PS-DRz21的5、10、15yg/ml三個劑量組的抑制率分別是13.2%(代O.Ol)、30.5%(代O.Ol)、50.3%(代O.01);PS-DRz31的5、10、15ug/ml三個劑量組的抑制率分別是21.8%(代O.01)、43.3%(代O.Ol)、62.2%(代O.01)，并均隨著濃度的增加而抑制效應增強。而隨機對照組的CFU與空白對照組相比無顯著性減少。由此可見，PS-DRz能減少WH0-2的菌落數。(見圖7、圖8)圖7、圖8是不同濃度的PS-DRz21和PS-DRz31對冊0-2在含苯唑西林(6ug/ml)的M-H瓊脂培養(yǎng)基表面生長(CFU)的影響圖示。圖7是菌落計數后的成像圖，圖8是平板克隆形成實驗結果的統計圖。圖中A是空白對照組，B是10pg/mlDRz51+10叫/mlDRz61組；C是10叫/mlDRz21組；D是10pg/mlDRz21+10叫/mlDRz61組；E是10嗎/mlDRz31組；F是10嗎/mlDRz31+10嗎/mlDRz51組；G是5嗎/mlDRz21+5pg/mlDRz31組。*P>0.05，***P〈0.01vscontrol;##P<0.05vsC;and※※P<0.05vsE;(i±s，n=8)。實施例6RT-PCR法檢測耐藥基因邁ecA7及其下游基因iT/ed的mRNA的表達變化1、提取細菌總RNA:(1)冰浴5min后的菌液5000rpm離心10min，棄去上清，收集細菌沉淀；(2)細菌沉淀中加入100y1裂解液，37。C孵育30min，每隔10min振蕩1次，以充分裂解細菌；(3)加入1mlTrizolreagent,室溫放置5min后加氯仿0.2ml/mlTrizolreagent,蓋緊離心管，用手輕柔混勻離心管；(4)吸取水相上清轉移至一新的離心管中，加入異丙醇0.5ml/mlTrizolreagent,蓋緊離心管，用手輕柔混勻，室溫放置20min，13000rpm、4。C離心20min;(5)棄去上清，加入75%乙醇1ml/mlTrizolreagent,用手劇烈搖蕩使RNA充分溶解，8000rpm、4。C離心10min;(6)棄去上清，然后置于清潔環(huán)境揮干乙醇10min，但不要干燥過分，以免降低RNA的溶解度。將RNA溶于DEPC處理過的水中作為RT模板(必要時可在5560。C孵育助溶)，或于-2(TC凍存。2、RT:用DU800核酸蛋白分析儀測總RNA的濃度及純度。反應體系50ul:5XRTbuffer10u1(含Mg2+)，2.5,1/1.28mldNTP5n1，隨機引物1yl，模板RNA1wg，RNaseinhibitor1y1，10U/ul反轉錄酶AMV1y1，用DEPC處理過的水補足50ixl。反應條件30°C8min，42°C1h，99°C5min，冰浴后進行PCR或-20。C保存cDNA。3、PCR:反應體系50ul:lOXPCRbuffer51(不含Mg20，2.5mraol/LMgCl25iU，2.5咖ol/1.28mldNTP4n1，0.1umol/L引物各0.75u1，模板cDNA3ul，5U/y1TaqDNA聚合酶1W1，用DEPC處理過的水補足50u1。反應條件95°C變性lmin，51'C退火1min，72。C延伸1min，循環(huán)數取1430循環(huán)不等，最后一個循環(huán)的延伸條件為72°C8min。4、PCR產物分析取5PiPCR反應產物與2ul的loadingbuffer上樣液充分混勻，加入含0.5Pg/ml溴化乙啶的l.(m的瓊脂糖凝膠的點樣孔中，5V/cm進行電泳。電泳結束后用凝膠成像儀進行觀察照相并進行光密度掃描，測條帶密度值(Integraldensityvalue,IDV)。因為16srRNA在細菌中穩(wěn)定表達，所以本發(fā)明以16srRNA作為內參照，計算相關基因的相對表達強度，公式如下被測基因相對表達強度IDV。/F被測基因IDV值/16srRNAIDV值X1000/。。冊0-2的mecRl、mecA、blaRl、blaZ和16s/V朋的RT-PCR的擴增產物的電泳結果顯示，各組分別在414bp、446bp、489bp、464bp及750bp處出現特異性擴增條帶。條帶密度值(Integraldensityvalue,IDV)比值分析結果表明，大劑量(15ug/ml)PS-ODNsll組在不同循環(huán)時blaRl及其下游基因blaZmRNA的表達與空白對照組及隨機對照PS-0DNs42U5ug/ml)組相比明顯下降，且隨著PS-ODNsll濃度的增加，blaRl和blaZ的mRNA表達量越低，(見圖3、圖4、圖5、圖6)圖3、圖4是PS-ODNsll導入WHO-2后blaRlmRNA表達的半定量分析結果。圖3是15ug/mlPS-ODNsll對不同循環(huán)數的blaRlmRNA表達的影響。14、16、18、20和22表示PCR檢測時blaRl所取的循環(huán)數，16S表示取28cycles的16srRNA。PS-ODNsll和PS-0DNs42的濃度均是15Pg/ml。圖4是不同劑量的PS-ODNsll對blaRlmRNA表達變化的影響。C是空白對照組(control),M是PS-0DNs42組(15yg/ml)，5、10、15分別表示5、10、15ug/ml的PS-ODNsll組。IDV%=blaRlIDV值/16srRNAIDV值X100。/。。*，05kscontrol;傘氺iKO.05kscontrol;氺*氺/^0.01kscontrol(i±s，n=4)。圖3、圖4顯示了PS-ODNsll能顯著性的抑制blaRlmRNA的表達。圖5、圖6是PS-ODNsll導入WHO-2后blaZmRNA表達的半定量分析結果。圖5是15ug/mlPS-ODNsll對不同循環(huán)數的blaZmRNA表達的影響。14、16、18、20和22表示PCR檢測時blaZ所取的循環(huán)數，16S表示取28cycles的16srRNA。PS-ODNsll和PS-ODNs42的濃度均是15yg/ml。圖6是不同劑量的PS-ODNsll對blaZmRNA表達變化的影響。C是空白對照組(control),M是PS-0DNs42組(15Pg/ml)，5、10、15分別表示5、10、15ug/ml的PS-ODNsll組。IDV%=blaZIDV值/16srRNAIDV值X100%。*，.05control;水氺/<0.05control(3f士s，n二4)。圖5、圖6顯示了PS-ODNsll能顯著性的抑制blaRl的下游基因balZmRNA的表達。實施例7Real-timeRT-PCR法檢測目的基因鵬cW、/zec/I、Wa/7、Z;7aZ的mRNA與內標基因755r必M的mRNA的相對表達變化1、提取細菌總RNA(方法如上)2、RT:用DU800核酸蛋白分析儀測總RNA的濃度及純度。隨機引物1iU，模板RNA1ug，2.5咖o1/1dNTP4u1，用DEPC處理過的水補足14u1，65°C5min，置于冰上lmin。然后加入5XRTbuffer4u1，0.1mo1/1DTT1w1，RNaseinhibitor0.5P1，SuperScriptIIIreversetranscriptase0.5pl，反應體系共20u1，25°C5min，50°C45min，70°C15min，冰浴后進行PCR或-2(TC保存cDNA。3、分別構建鵬c/厶W^/、WaZ及/必ry廁的標準曲線取對照組RNA反轉錄后的cDNA，10倍梯度稀釋(見表3)。4、分別應用，c^、歷ec力、/Wa)W、WaZ及7必W朋的特異性引物進行實時定量PCR反應。反應體系SYBRPremixExTaq12.5w1，R0XReferenceDye(50X)0.5iU，PCRPrimermixture(10uM)0.75yl，模板1或3y1，加滅菌雙蒸水補足至25Pl。反應條件首先95。C5rain;然后50個循環(huán)，95。C10s，退火溫度20s,(見表4),72。C20s,readplate;最后繪制融鏈曲線(60。C90。C)。表3鵬cA7、鵬cAWW7、力7aZ及7必r必W的標準品配制<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>Standard31003Standard41001Standard510003Standard610001Standard7100003Standard8_10000_|_表4基因的退火溫度_基因_退火溫度(°C)/77eo/厶,c力5856力7處7盼細55樣品的實時熒光定量反應各樣品組RNA100倍稀釋后反轉錄，取相同體積生成的cDNA分別應用blaRl、blaZ及16SrRNA的特異性引物進行實時定量PCR反應。結果見下表表5wec/7相對于76SWA^的mRNA表達水平groupCt.mecRiCt.驗RNA△Ct△ACtA31.60士0.0622.13±0.069.47±0.080±0.081.00(0.97-1.04)B32.93±0.0523.48±0.079.45±0.09-0.02±0.091.01(0.95-1.08)C28.61±0.0418.57±0.0910.04±0.100.57±0.100.67(0.63-0.72)D36.32±0.0326.33±0.029.99±0.040.52±0.040.70(0.68-0.72)E30.27±0.0420.83±0.069.44±0.07-0.03±0.071.02(0.97-1.07)F32.59±0.0723.11±0.049.48±0.080.01±0.080.99(0.94-1.05)G35.05±0.0324.66±0.0710.39±0.080,92±0.080.53(0.50-0.56)ct:臨界循環(huán)數，每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數?！鳌鰿t氣Ct.mecRi-Cw6s)trea加ent陽(Ct,ecR廣Ct.i6s)咖加iA:空白對照組；B:10Hg/mlDRz51+10pg/mlDRz61;C:10嗎/mlDRz21;D:10嗎/mlDRz21+10)ag/mlDRz61;E:10(ag/mlDRz31;F:10ng/mlDRz31+10ng/mlDRz51;G:5pg/mlDRz21+5嗎/mlDRz31。(3f土s，n=3)。表6med相對于/6&iA^的mRNA表達水平_groupCt△CtAACt2復tA29.31±0.0422.13±0.067.18±0.070±0.071.00(0.95-1.05)B30.70±0.1023.48±0.077.22±0.120.04±0.120.97(0.卯隱l.06)C26.29±0.0618.57±0.097.72±0.110.54±0.110.69(0.64-0.74)D34.02±0.1426.33±0.027.69±0.140.5U0.140.70(0.64-0.77)E30.27±0.0420.83±0.069.44±0.07-0.03±0.071.02(0.97-1.07)F30.23±0.0223.11±0.047.12±0.04-0.06±0.041.04(1.01-1.07)G32.70±0.1824.66±0.078.04±0.140.86±0.140.55(0.50-0.61)Ct:臨界循環(huán)數，每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數。△△Ct=(Ct.mecA-Ct.16s)treatment-(Ct.mecA-Ct.i6S)c。ntr。iA:空白對照組；B:10ng/mlDRz51+10Hg/mlDRz61;C:10嗎/mlDRz21;D:10|ig/mlDRz21+10jag/mlDRz61;E:10ng/mlDRz31;F:10|ig/mlDRz31+10|ag/mlDRz51;G:5jxg/mlDRz21+5pg/mlDRz31。(3f土51，n=3)。表7Wai7相對于/6&7A^的mRNA表達水平<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>ct:臨界循環(huán)數，每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數?！鳌鰿產(Ct.WaR廣Ct.^)t腦tment-(Ct.b隨-Cw6s)co咖,A:空白對照組；B:10嗎/mlDRz51+10pg/mlDRz61;C:10jag/mlDRz21;D:10嗎/mlDRz21+10嗎/mlDRz61;E:10pg/mlDRz31;F:10嗎/mlDRz31+10ng/mlDRz51;G:5嗎/mlDRz21+5嗎/mlDRz31。(i土s，n=3)。表8WaZ相對于/65WA^的mRNA表達水平<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>Ct:臨界循環(huán)數，每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數。,WaZ國Ct.l6s)trea加ent-(Ct.blaZ-Ct.16s)c。ntrolA:空白對照組；B:10pg/mlDRz51+10Hg/mlDRz61;C:10嗎/mlDRz21;D:10|tig/mlDRz21+10pg/mlDRz61;E:10jag/mlDRz31;F:10|ag/mlDRz31+10|ag/mlDRz51;G:5ng/mlDRz21+5pg/mlDRz31。(i士s，n=3)。WH0隱2的mecR1、mecA、blaR1、blaZ和16srRAM的Real-timeRT國PCR的擴增產物的電泳結果顯示，各組分別在336bp;225bp、489bp、461bp及750bp處均出現特異性擴增條帶。分析結果表明，合用阻斷mecR1/mecA和blaR1/blaZ雙通路的反義分子，阻斷MRSA的雙耐藥基因表達信號通路能顯著減少MRSA的菌落數，抑制MRSA的生長，與阻斷單條耐藥基因表達信號通路相比對MRSA的抑制作用更加明顯，見表5—表8。本實驗的研究結果表明，以基因mecR1和blaR1為特異性靶點的反以核酸能夠選擇性的抑制MRSA菌株WHO-2菌體內mecR1和blaR1基因的表達，繼而抑制受其調控的下游基因mecA和blaZ的表達，從而部分恢復了WHO-2對苯哇西林的敏感性，降低了其耐藥性。說明上述的以mecR1和blaR1為靶點的反義核酸具有抗MRSA耐藥性的作用，通過核酸序列長度、修飾等優(yōu)化和篩選具有開發(fā)為抗MRSA耐藥性藥物的前景，與抗生素聯合應用用于MRSA感染性疾病的治療。權利要求1、抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義核酸，包括反義硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs)和硫代脫氧核酶(PS-DRz)，其特征在于可特異性與MRSA耐藥基因mecR1/mecA、blaR1/blaZ的不同區(qū)域結合，阻斷這些耐藥基因的表達，其反義核酸的堿基序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001">id="icf0001"file="A2007100178260002C1.gif"wi="163"he="198"top="56"left="22"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/></tables><tablesid="tabl0002"num="0002">id="icf0002"file="A2007100178260003C1.gif"wi="163"he="101"top="28"left="24"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/></tables>2、根據權利要求1所述的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義核酸，其特征在于硫代寡聚脫氧核苷酸為16~20個堿基，經全硫代修飾；硫代脫氧核酶除催化中心(保守序列的15個堿基)序列外，其兩端的堿基臂(如權利要求1表中的劃線部分)為17~21個堿基，均進行全硫代修飾。3、根據權利要求1所述的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義核酸，其特征在于PS-ODNs0卜PS-ODNs10禾口PS-DRz21~PS-DRz30是耙向mecR1基因的反義核酸，PS-ODNs11~PS-ODNs20和PS-DRz3卜PS-DRz40是靶向blaR1基因的反義核酸。4、根據權利要求書1所述的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義t亥酸，其特征在于所述的反義核酸用于抑制MRSA的耐藥基因表達、使MRSA恢復對p-內酰胺類抗生素的敏感性，用于抗MRSA感染的治療。5、根據權利要求書3所述的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義核酸，其特征在于抑制mecR1和blaR1基因功能的反義核酸或抑制mecA和blaZ基因功能的反義核酸聯合應用，可以產生協同抑制MRSA耐藥性的作用。6、根據權利要求書1所述的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因的反義核酸，其特征在于所述的反義核酸序列用于制備抗MRSA耐藥性藥物的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一類針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)耐藥基因mecR1/mecA和blaR1/blaZ的反義核酸序列及其制備含有該反義核酸序列的藥物及其用途，它包括反義硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODNs)和硫代脫氧核酶(PS-DRz)，其特征在于可特異性與MRSA耐藥基因mecR1/mecA、blaR1/blaZ的不同區(qū)域結合，阻斷這些耐藥基因的表達，其反義核酸的堿基序列為PS-ODNs01-40，該類反義核酸能夠與靶基因的特定位點結合，從而抑制耐藥基因的表達，使MRSA恢復對內酰胺類抗生素的敏感性，從而達到有效對抗MRSA耐藥性的目的。文檔編號C07H21/04GK101200483SQ20071001782公開日2008年6月18日申請日期2007年5月11日優(yōu)先權日2007年5月11日發(fā)明者征侯,孟靜茹,扈本荃,慧王,羅曉星,敏賈申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學