專利名稱：：具有舒血管和溶血栓活性的寡肽-銅配合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及具有舒血管和溶血栓活性的寡肽-銅配合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：血管栓塞性疾病是最容易導(dǎo)致死亡的心腦血管疾病，血管栓塞也是導(dǎo)致死亡的一個最重要因素。因此，治療血管栓塞的藥物對于維系心腦血管病患者的健康有重要意義。目前，用于治療血管栓塞的藥物一般都有不同程度的副作用，例如，臨床使用的治療急性血栓栓塞性疾病的鏈激酶、尿激酶和重組組織型纖溶酶原激活劑等藥物普遍存在全身出血傾向和免疫原性反應(yīng)，因此尋求安全有效的溶血栓藥物是新藥研究的熱點之一。血管栓塞以后的血流再灌既取決于血栓溶解，也取決于血管舒張。因此，使已形成的血栓溶解和血管舒張是治療血管栓塞的兩個重要途徑。銅作為人體必需的微量元素或者參與多種酶的合成和激活，或者以輔酶的身份廣泛參與機體的生命過程，例如在生物體內(nèi)以銅蛋白和銅酶的形式采用氧氣運送、02+歧化、F^+氧化、細胞色素C的有機底物氧化、單氧合作用及電子傳遞等。銅缺乏會導(dǎo)致Cu/Zn比值降低，使動脈壁彈力纖維和膠原纖維降解，破壞血管壁內(nèi)膜的完整性。而Cu/Zn比值升高則可以抑制動脈壁彈力纖維降解而獲得血管舒張作用。纖維蛋白P鏈的降解產(chǎn)物—血管活性肽P6A(氨基酸序列為ARPAK)及其類似物(氨基酸序列為GRPAK、QRPAK、RPAK和PAK的肽)作為小分子內(nèi)源性寡肽不僅有良好的溶血栓活性，而且沒有全身出血傾向和免疫原性反應(yīng)等副作用，是理想的溶血栓先導(dǎo)藥物結(jié)構(gòu)。配合物因具有特殊的藥代動力學(xué)性質(zhì)而有利于吸收和轉(zhuǎn)運。例如通過與氨基酸形成銅-氨基酸配合物銅變得容易穿過腸道粘膜而在腸道被吸收。又例如肝臟內(nèi)的膽酸鹽是通過與銅離子形成可溶性配合物而在在膽汁中轉(zhuǎn)運。因此，希望能夠?qū)⒒钚噪呐c銅結(jié)合起來使其具有溶血栓活性從而能夠治療血管栓塞。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供具有舒血管和溶血栓活性的寡肽-銅配合物，其能夠用于治療血管栓塞性疾病。本發(fā)明的另一目的在于提供上述配合物的制備方法。本發(fā)明的另一目的還在于提供上述配合物的用途。下面對本發(fā)明進行詳細說明。本發(fā)明提供了具有舒血管和溶血栓活性的下式I的寡肽-銅配合物，Cu(oV2(式I)其中，Q)為活性肽，優(yōu)選例如選自PAK、RPAK、ARPAK、GRPAK和QRPAK之一的活性肽；v為一般的配位陰離子，例如cr、Br—、r、r等，優(yōu)選為cr。上述字母A、P、K、R、G和Q是氨基酸的縮寫。其中，A是指丙氨酸；P是指脯氨酸；K是指賴氨酸；R是指精氨酸；G是指甘氨酸；Q是指谷氨酰胺。在本文的上下文中，上述字母的意思如上所述。本發(fā)明式I的寡肽-銅配合物的特別實例包括Cu(PAK)Cl2、Cu(RPAK)Cl2、Cu(ARPAK)Cl2、Cu(GRPAK)Cl2或Cu(QRPAK)Cl2。本發(fā)明提出具有舒血管和溶血栓活性的上述式I寡肽-銅配合物的理論依據(jù)在于1)血流再灌既取決于血栓溶解也取決于血管舒張；2)Cu/Zn比值升高可以抑制動脈壁彈力纖維降解而獲得血管舒張作用；3)ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK和PAK都是有效的溶栓寡肽；和4)ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK和PAK與銅形成的配合物可能會有利于吸收和轉(zhuǎn)運。發(fā)明人經(jīng)過大量試驗后合成的本發(fā)明的式I寡肽-銅配合物，并通過試驗(具體參見試驗例)證明其具有良好的舒血管和溶血栓活性，因此可以用于治療血管栓塞性疾病。本發(fā)明還提供了上述式I寡肽-銅配合物的制備方法，該方法包括在水中將活性肽O)與銅化合物，例如CUV2銅鹽或銅鹽的水合物等溶解，將所得溶液用堿性試劑調(diào)節(jié)pH，過濾，將濾液濃縮，得到產(chǎn)物。當然，本發(fā)明制備述式I寡肽-銅配合物的方法還可以包括將所得產(chǎn)物進行純化的過程，例如，將產(chǎn)物脫鹽、干燥。在本發(fā)明式I寡肽-銅配合物的制備方法中調(diào)節(jié)溶液pH的堿性試劑優(yōu)選使用Na2C03溶液；溶液的pH優(yōu)選調(diào)節(jié)至約7-8，此時易于形成穩(wěn)定的寡肽-銅配合物；濾液濃縮優(yōu)選通過減壓濃縮進行；產(chǎn)物脫鹽時優(yōu)選使用SephadexG-10進行脫鹽；干燥優(yōu)選通過冷凍干燥進行。在本發(fā)明式I寡肽-銅配合物的制備方法的一個優(yōu)選實施方案中，該方法包括在水中將ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK或PAK與CuCl22H20溶解，得到的溶液用約1NNa2C03調(diào)pH值至7-8，使溶液由淺藍色變?yōu)樯钏{色，然后將溶液過濾，濾液減壓濃縮，SephadexG-10脫鹽，冷凍千燥。當然，本發(fā)明式I寡肽-銅配合物的制備方法中使用了活性肽co，例如ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK或PAK等，這些活性肽可以從動物體和/或其代謝產(chǎn)物中分離得到，也可以預(yù)先進行合成。本發(fā)明還提供了活性肽co的合成方法，例如，通過逐步接肽的方式以及液相合成來合成活性肽to方法，具體可以參見實施例。因此，本發(fā)明式I寡肽-銅配合物的制備方法還可以包括上述活性肽(0的合成方法。本發(fā)明提供的式I寡肽-銅配合物具有優(yōu)良的舒血管和溶血栓活性，而且其舒血管和溶血栓活性的增強同樣不是來自GRPAK與CuCb活性的簡單疊加，而是來自配合物本身，其可以用于治療血管栓塞以及血管栓塞性疾病。具體實施例方式以下結(jié)合本發(fā)明的實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的特點和優(yōu)點會隨著描述而更清楚。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應(yīng)當理解為對本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不違背本發(fā)明精神和保護范圍的情況下，任何對本發(fā)明進行的細節(jié)修改都落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1PAK的制備1)制備Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl將473mg(2.5mmol)Boc-Ala-OH溶于10ml無水四氫呋喃(THF)，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmol)N-羥基苯并三唑(HOBt)和619mg(3mmo1)二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)的無水THF溶液。反應(yīng)混合物冰浴攪拌20分鐘，得對應(yīng)的活潑酯溶液。將936mg(2.3mmol)HCl丄ys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基嗎啉先與6ml無水THF混合，然后與上面的活潑酯溶液混合。反應(yīng)混合物室溫攪拌24h，TLC(CHC13:MeOH=30:1)顯示HCl'Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)混合物減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，濾除不溶物。濾液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和氯化鈉水溶液洗。分出的乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥、過濾、濾液37"C減壓濃縮，得1.204g(97%)標題化合物，為無色固體。Mp889(TC，[a^=-6.6。(C=0.2，CHC13)，ESI-MS(m/e)565[M+Na]+。2)制備HCl'Ala-Lys(Z)-OBzl將1.354g(2.5mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl與15ml氯化氫-乙酸乙酯液(4N)混合、室溫攪拌3h、TLC(CHC13:MeOH二20:1)顯示Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)液減壓濃縮至干，殘留物與無水乙醚混合再壓濃縮至干。該操作重復(fù)5次。最后的殘留物用無水乙醚研磨，得到的標題化合物用于下步反應(yīng)。3)制備Boc-Pro-Ala國Lys(Z)-OBzl將538mg(2.5mmol)Boc-Pro-OH溶于10ml無水THF，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmol)HOBt和619mgGmmol)DCC的無水THF溶液。反應(yīng)混合物冰浴攪拌20分鐘，得對應(yīng)的活潑酯溶液。將1.099g(2.3mmol)HCl.Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基嗎啉先與6ml無水THF混合，然后與上面的活潑酯溶液混合。反應(yīng)混合物室溫攪拌24h，TLC(CHC13:MeOH=20:1)顯示HCl'Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)混合物減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，濾除不溶物。濾液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和氯化鈉水溶液洗。分出的乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥、過濾、濾液37"C減壓濃縮，得2.847g(98^)標題化合物。為無色固體。Mp8283.4°C，[《=-8.6。(C=0.2，CHC13)，ESI-MS(m/e)662[M+Na]+。4)制備HCl.Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將1.596g(2.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl與15ml氯化氫-乙酸乙酯液(4N)的混合、室溫攪拌3h、TLC(CHC13:MeOH=20:1)顯示Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)液減壓濃縮至干，殘留物與無水乙醚混合再壓濃縮至干。該操作重復(fù)5次。最后的殘留物用無水乙醚研磨，得到的標題化合物用于下步反應(yīng)。5)制備PAK將1.437g(2.5mmol)HCl'Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于10ml水和乙醇的混合液后加入300mgPd/C(5%)，反應(yīng)瓶減壓排氣并通入氫氣。該操作重復(fù)5次。反應(yīng)混合物通氫氣并室溫攪拌24h，TLC(正丁醇冰醋酸水=2:1:1)顯示HCl'Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。停止反應(yīng)，濾除Pd/C，濾液減壓濃縮除去溶劑。殘余物用C18柱純化，得0.589g(75%)標題化合物，為無色固體。Mp15()152。C，[《=-35.6。(C=2.02，H20)，ESI-MS(m/z)315[M+H]+。實施例2RPAK的制備1)制備Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將798mg(2.5mmol)Boc-Arg(N02)-OH溶于10ml無水THF，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmol)HOBt禾卩619mg(3mmo1)DCC的無水THF溶液。反應(yīng)混合物冰浴攪拌20分鐘，得對應(yīng)的活潑酯溶液。將1.322g(2.3mmol)HClPro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmol)N-甲基嗎啉先與6ml無水THF混合，再與上面的活潑酯溶液混合。反應(yīng)混合物室溫攪拌24h，TLC(CHC13:MeOH=20:1)顯示HCl'Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)混合物減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，濾除不溶物。濾液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和氯化鈉水溶液洗。分出的乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥、過濾、濾液37"C減壓濃縮，得1.642g(85%)標題化合物。為無色固體。Mp8385°C，[a]^=-7.5。(C=0.2,CHC13)，ESI-MS(m/e)864[M+Na]+。2)制備HC1.Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將2.099g(2.5mmol)Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl與15ml氯化氫-乙酸乙酯液(4N)的混合、室溫攪拌3h、TLC(CHC13:MeOH=20:1)顯示Boc-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)液減壓濃縮至干，殘留物與無水乙醚混合再壓濃縮至干。該操作重復(fù)5次。最后的殘留物用無水乙醚研磨，得到的標題化合物用于下步反應(yīng)。3)制備RPAK將L941g(2.5mmol)HC1'Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于10ml水和乙醇的混合液后加入300mgPd/C(5%)，反應(yīng)瓶減壓排氣并通入氫氣。該操作重復(fù)5次。反應(yīng)混合物通氫氣并室溫攪拌24h，TLC(正丁醇冰醋酸水=:2:1:1)顯示HC1'Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。停止反應(yīng)，濾除Pd/C，濾液減壓濃縮除去溶劑。殘余物用C18柱純化，得0.847g(72%)標題化合物，為無色固體。Mp158160°C，[化°=-47.5。(C=1.95，H20)，ESI-MS(m/z)471[M+H]+。實施例3ARPAK的制備1)制備Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將473mg(2.5mmo1)Boc-Ala-OH溶于10ml無水THF，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmo1)HOBt禾B619mg(3mmo1)DCC的無水THF溶液。反應(yīng)混合物冰浴攪拌20分鐘，得對應(yīng)的活潑酯溶液。將1.785g(2.3mmol)HCl'Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmo1)N-甲基嗎啉先與6ml無水THF混合，然后與上面的活潑酯溶液混合。反應(yīng)混合物室溫反應(yīng)24h，TLC(CHC13:MeOH=20:1)顯示HC1'Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)混合物減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，濾除不溶物。濾液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和氯化鈉水溶液洗。分出的乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥、過濾、濾液37"C減壓濃縮，得1.802g(86%)標題化合物。為無色固體。Mp8789。C，ESI-MS(mZe)934[M+Na]+。2)制備HC1'Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將2.277g(2.5mmol)Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(:Z)-OBzl與15ml氯化氫-乙酸乙酯液(4N)的混合、室溫攪拌3h、TLC(CHC13:MeOH=20:1)顯示Boc-Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)液減壓濃縮至干，殘留物與無水乙醚混合再壓濃縮至干。該操作重復(fù)5次。最后的殘留物用無水乙醚研磨，得到的標題化合物用于下步反應(yīng)。3)制備ARPAK將2.118g(2.5mmo1)HC1'Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于10ml水和乙醇的混合液后加入300mgPd/C(5%)，反應(yīng)瓶減壓排氣并通入氫氣。該操作重復(fù)5次。反應(yīng)混合物通氫氣并室溫攪拌24h，TLC(正丁醇冰醋酸水=2:1:1)顯示HC1'Ala-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。停止反應(yīng)，濾除Pd/C，濾液減壓濃縮除去溶劑。殘余物用C18柱純化，得0.988g(73%)標題化合物，為無色固體。Mpl62164。C，ESI-MS(m/z)542[M+H〗+。實施例4GRPAK的制備1)制備Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將438mg(2.5mmo1)Boc-Gly-OH溶于10ml無水THF，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmo1)HOBt禾B619mg(3mmo1)DCC的無水THF溶液。反應(yīng)混合物冰浴攪拌20分鐘，得對應(yīng)的活潑酯溶液。將1.785g(2.3mmol)HC1.Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmo1)N-甲基嗎啉先與6ml無水THF混合，再與上面的活潑酯溶液混合。反應(yīng)混合物室溫攪拌24h，TLC(CHC13:MeOH=20:l)顯示HC1'Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)混合物減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，濾除不溶物。濾液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和氯化鈉水溶液洗。分出的乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥、過濾、濾液37"C減壓濃縮，得1.857g(90%)標題化合物。為無色固體。Mp8587°C，ESI-MS(m/e)920[M+Na]+。2)制備HC1.Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將2.242g(2.5mmol)Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl與15ml氯化氫-乙酸乙酯液(4N)的混合、室溫攪拌3h、TLC(CHC13:MeOH=20:1)顯示Boc-Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)液減壓濃縮至干，殘留物與無水乙醚混合再壓濃縮至干。該操作重復(fù)5次。最后的殘留物用無水乙醚研磨，得到的標題化合物用于下步反應(yīng)。3)制備GRPAK將2.084g(2.5mmo1)HC1'Gly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于10ml水和乙醇的混合液后加入300mgPd/C(5%)，反應(yīng)瓶減壓排氣并通入氫氣。該操作重復(fù)5次。反應(yīng)混合物通氫氣并室溫攪拌24h，TLC(正丁醇冰醋酸水=2:1:1)顯示HCrGly-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。停止反應(yīng)，濾除Pd/C，濾液減壓濃縮除去溶劑。殘余物用C18柱純化，得0.976g(74%)標題化合物，為無色固體。Mpl60162。C，ESI-MS(m/z)528[M+H]+。實施例5QRPAK的制備1)制備Gln-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將615mg(2.5mmol)Boc-Gln-OH溶于10ml無水THF，冰浴下往里加10ml338mg(2.5mmol)HOBt禾卩619mg(3mmo1)DCC的無水THF溶液。反應(yīng)混合物冰浴攪拌20分鐘，得對應(yīng)的活潑酯溶液。將1.785g(2.3mmol)HCl'Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl和232mg(2.3mmo1)N-甲基嗎啉先與6ml無水THF混合，再與上面的活潑酯溶液混合。反應(yīng)混合物室溫攪拌24h，TLC(CHC13:MeOH=10:1)顯示HCl.Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)混合物減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，濾除不溶物。濾液依次用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和氯化鈉水溶液洗。分出的乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥、過濾、濾液37"C減壓濃縮，得1.113g(50%)標題化合物。為無色固體。Mp9192°C，ESI-MS(m/e)969[M+H]+。2)制備HCl.Gln-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl將2.420g(2.5mmol)Boc-Gln-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl與15ml氯化氫-乙酸乙酯液(4N)的混合、室溫攪拌3h、TLC(CHC13:MeOH=20:1)顯示Boc-Gln-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。反應(yīng)液減壓濃縮至干，殘留物與無水乙醚混合再壓濃縮至干。該操作重復(fù)5次。最后的殘留物用無水乙醚研磨，得到的標題化合物用于下步反應(yīng)。3)制備QRPAK將2.261g(2.5mmol)HCl'Gln-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于10ml水和乙醇的混合液后加入300mgPd/C(5%)，反應(yīng)瓶減壓排氣并通入氫氣。該操作重復(fù)5次。反應(yīng)混合物通氫氣并室溫攪拌24h，TLC(正丁醇冰醋酸水=2:1:1)顯示HCl'Gln-Arg(N02)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl消失。停止反應(yīng)，濾除Pd/C，濾液減壓濃縮除去溶劑。殘余物用C18柱純化，得1.062g(71%)標題化合物，為無色固體。Mpl66168。C，ESI-MS(m/z)599[M+H]+。實施例6Cu(PAK)Cl2的制備0.072g(0.23mmol)PAK溶于2ml三蒸水，得到的溶液中加入0.5g(2.9mmol)CuClf2H20與0.5ml三蒸水的溶液、用INNa2C03調(diào)pH值至7-8，使反應(yīng)液由淺藍色變?yōu)樯钏{色。40'C攪拌6h、濾去不溶物、得到的藍色溶液減壓濃縮、用SephadexG-10脫鹽、餾份冷凍干燥，得0.021g(20%)標題化合物。ESI-MS(m/e)400[M+Na]+。實施例7Cu(RPAK)Cl2的制備0.108g(0.23mmol)RPAK溶于2ml三蒸水，得到的溶液中加入0.5g(2.9mmol)CuCl2'2H20與0.5ml三蒸水的溶液、用INNa2C03調(diào)pH值至7-8，使反應(yīng)液由淺藍色變?yōu)樯钏{色。40C攪拌6h、濾去不溶物、得到的藍色溶液減壓濃縮、用S印hadexG-10脫鹽、餾份冷凍干燥，得0.021g(15%)標題化合物。ESI-MS(m/e)533[M+H]+。實施例8Cu(ARPAK)Cl2的制備0.125g(0.23mmol)ARPAK溶于2ml三蒸水，得到的溶液中加入0.5g(2.9mmol)CuClf2H20與0.5ml三蒸水的溶液、用INNa2C03調(diào)pH值至7-8，使反應(yīng)液由淺藍色變?yōu)樯钏{色。40。C攪拌6h、濾去不溶物、得到的藍色溶液減壓濃縮、用SephadexG-10脫鹽、餾份冷凍干燥，得0.029g(腦)標題化合物。ESI-MS(m/e)604[M+H]+。實施例9Cu(GRPAK)Cl2的制備0.121g(0.23mmol)GRPAK溶于2ml三蒸水，得到的溶液中加入0.5g(2.9mmol)CuCl2'2H20與0.5ml三蒸水的溶液、用INNa2C03調(diào)pH值至7-8，使反應(yīng)液由淺藍色變?yōu)樯钏{色。40C攪拌6h、濾去不溶物、得到的藍色溶液減壓濃縮、用SephadexG-10脫鹽、餾份冷凍干燥，得0.032g(21X)標題化合物。ESI-MS(m/e)590[M+H]+。實施例10Cu(QRPAK)Cl2的制備0.138g(0.23mmol)QRPAK溶于2ml三蒸水，得到的溶液中加入0.5g(2.9mmo1)CuClf2H20與0.5ml三蒸水的溶液、用INNa2C03調(diào)pH值至7-8，使反應(yīng)液由淺藍色變?yōu)樯钏{色。40'C攪拌6h、濾去不溶物、得到的藍色溶液減壓濃縮、用SephadexG-10脫鹽、餾份冷凍干燥，得0.034g(20°%)標題化合物。ESI-MS(m/e):661[M+H]+。試驗例試驗例1舒張血管活性測定1)實驗動物SD雄性大鼠，體重200-260g(購自北京醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，許可證號為醫(yī)動字第01-3056)。2)實驗儀器恒溫槽CS501(中國重慶銀河試驗儀器有限公司生產(chǎn))、肌肉張力換能器(杭JZ101型，碑店市新杭機電設(shè)備有限公司生產(chǎn))、LMS-2B型二道生理記錄儀(成都儀器廠生產(chǎn))。3)測定方法與結(jié)果體重250-300g雄性SD大鼠，術(shù)前禁食12小時，自由飲水，頸椎脫位致死，開胸迅速摘取胸主動脈，剝離附著的結(jié)締組織，將血管剪成3-5mm長的動脈環(huán)，置于15ml灌流浴槽內(nèi)，浴槽盛有通以95%02-5%<:02氣體的37'C恒溫Krebs-Henseleit(KH)液15ml，固定動脈環(huán)的掛鉤連接張力換能器，在二道記錄儀上描記血管舒縮曲線，紙速為lmm/min。調(diào)整靜止張力為l.Og，平衡30min后給予終濃度為6.26Xl(T8mol/L去甲腎上腺素(NE)使動脈收縮以起預(yù)激作用，洗去NE，平衡30min后給予終濃度為6.26Xl(T8mol/LNE，待收縮張力持續(xù)穩(wěn)定于平臺水平后，加入15jxl不同濃度(終濃度分別為5X1(T5，5X1(T6，5X10〃mol/L)的本發(fā)明的化合物溶于K-H緩沖液的溶液，舒張能力以終濃度為6.26X10'8mol/LNE產(chǎn)生的最大收縮張力降低的百分比表示，結(jié)果如下表1所示。表1經(jīng)本發(fā)明的化合物處理的大鼠的動脈環(huán)對NE產(chǎn)生的收縮的抑制作用組別動脈環(huán)在以下終濃度的舒張百分率(X±S%)5X10-5mol/L5X10-6mol/L5X10-7mol/LPAK20.5±2.5aO.O土O.OO.O土O.OCu(PAK)Cl2100.0±0.4a75.6±7.1a11.7±1.7aRPAK48.0±4.8a0.0%±0.00.0%±0.0Cu(RPAK)Cl267.6±5.4a22.5±3.5aO.O土O.OARPAK6.7±1.0ao.o土o.oo.o土o.oCu(ARPAK)Cl2100.0±0.7a79.7±3.0a9.5±2.4aGRPAK7.9±1.9aO.O士O.OO.O士O.OCu(GRPAK)Cl2100.0±0.5a43.5±8.3aO.O土O.OQRPAK16.0±2.3aO.O士O.OO.O土O.OCu(QRPAK)Cl2100.0±0.8a36.2±2.6ao.o士o.oCuCl210.7±2.80.3±0.40.2±0.4n=6;a.與CuCl2組比，PO.001從表l的數(shù)據(jù)可以看到，在5X10-5mol/l、5XlO-6mol/l和5X1(T7mol/l三種濃度下，只有5Xl(T5mol/l的RPAK禾nQRPAK的舒張血管活性明顯強于CuCl2。5X10-5mol/1的CuCl2具有微弱的血管舒張活性。ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物在5Xl(T5mol/1濃度下都具有強血管舒張活性。在5Xl(T6mol/1濃度下ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物都具有中等以上強度的血管舒張活性。在5X1(T7mol/1濃度下三種，PAK-Cu和ARPAK-Cu配合物仍然具有微弱的血管舒張活性。ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物的血管舒張活性顯著強于ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK、PAK和CuCl2，說明ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物，艮卩Cu(ARPAK)Cl2、Cu(GRPAK)Cl2、Cu(QRPAK)、Cu(RPAK)Cl2、和Cl2Cu(PAK)Cl2和的血管舒張活性不是來自ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK、PAK與CuCl2的簡單疊加作用，而是ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物本身的作用。試驗例2溶血栓活性測定本發(fā)明的化合物在大鼠溶血栓模型上的溶血栓活性1)大鼠手術(shù)與器械SD大鼠(雄性,220230g)按1200mg*kgi劑量腹腔注射烏拉坦溶液進行麻醉。麻醉大鼠仰臥位固定，分離右頸總動脈，于近心端夾動脈夾，近心端和遠心端分別穿入手術(shù)線，將遠心端的手術(shù)線于皮毛用止血鉗夾緊，在遠心端插管，松開動脈夾，放出約lml動脈血，裝在lml子彈頭中。往垂直固定的玻璃管(長15mm，內(nèi)徑2.5mm,外徑5.0mm,管底用膠塞密封)中注入O.1ml大鼠動脈血液，往管內(nèi)迅速插入一支不銹鋼質(zhì)料的血栓固定螺栓。該血栓固定螺旋用直徑為O.2mm的不銹鋼絲繞成，螺旋部分長12mm,含15個螺圈，螺圈的直徑為1.0mm,托柄與螺旋相連，長7.Omm，呈問號型。血液凝固15min后,打開玻璃管底部的膠塞，用鑷子固定血栓固定螺旋的托柄,從玻璃管中小心地取出被血栓包裹的血栓固定螺旋。精確稱重。2)大鼠頸動靜脈旁路插管旁路插管由3段構(gòu)成,中段為聚乙烯膠管,長60.0mm,內(nèi)徑3.5mm;兩端為相同的聚乙烯管,管長IOO.0mm,內(nèi)徑l.0mm,外徑2.0mm該管的一端拉成尖管(用于插入大鼠頸動脈或靜脈)，外徑為l.0mm,另一端的外部套一段長7.0mm，外徑為3.5mm的聚乙烯管(加粗,用于插入中段的聚乙烯膠管內(nèi))3段管的內(nèi)壁均硅烷化。將血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯膠管內(nèi)，膠管的兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50[U*kg—"，備用。繼續(xù)分離麻醉大鼠的氣管，并做氣管插管。分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠心端分別穿入手術(shù)線，在暴露的左頸外靜脈上小心地剪一斜口，將上面制備好的旁路管道的尖管由斜口插入左頸外靜脈開口的近心端，同時遠離旁路管中段(含精確稱重的血栓固定螺旋)內(nèi)血栓固定螺旋的托柄。用注射器通過另一端的尖管推入準確量的肝素生理鹽水(50IU.kg"),此時注射器不要撤離聚乙烯管，用止血鉗夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動脈的近心端用動脈夾止血,在離動脈夾不遠處將右頸總動脈小心地剪一斜口。從聚乙烯管的尖部拔出注射器,將聚乙烯管的尖部插入動脈斜口的近心端。旁路管道的兩端都用4號手術(shù)縫線與動靜脈固定。3)給藥用頭皮針將生理鹽水(劑量為3mlkg—1)、尿激酶的生理鹽水溶液(劑量為20000IUkg-!)或ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK、PAK、CuCl2、Cu(ARPAK)Cl2、Cu(GRPAK)Cl2、Cu(QRPAK)Cl2、Cu(RPAK)Cl2和Cu(PAK)Cl2的線性肽生理鹽水溶液(劑量為lOymol.kg-通過旁路管的中段(含精確稱重的血栓固定螺旋)刺入遠離血栓固定螺旋的近靜脈處，打開動脈夾，使血流通過旁路管道從動脈流向靜脈，此即大鼠動靜脈旁路溶栓模型，緩慢將注射器中的液體注入到血液中，使生理鹽水(空白對照)，尿激酶(陽性對照)或線性肽(治療劑)通過血液循環(huán)，按靜脈一心臟一動脈的順序作用到血栓上。從開始注射時計時,lh后從旁路管道中取出血栓固定螺旋,精確稱重。求每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋給藥前后的質(zhì)量差,統(tǒng)計各組的血栓質(zhì)量差值(i士SD),并做Z檢驗。4)結(jié)果血栓質(zhì)量差值列入下表2。表2經(jīng)藥物治療引起的血栓減重<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>N=12;NS劑量為3ml/kg,UK劑量為20000IU/kg,ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK、PAK、CuCl2、ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物的劑量為10umol/kg;a)與NS及CuCl2組比P<0.001，b)與PAK組比P<0.01，c)與RPAK組比PO.001,d)與ARPAK組比P〈0.001,e)與QRPAK組比P<0.01。從表2的數(shù)據(jù)可以看到，在10wmol/kg劑量下CuCl2無溶血栓活性，而GRPAK、ARPAK-Cu、GRPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK陽Cu和PAK-Cu配合物顯示與20000IU/kg劑量UK相同的溶血栓活性。在10umol/kg劑量下ARPAK、QRPAK、RPAK和PAK的溶血栓活性都明顯低于ARPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu禾BPAK-Cu的溶血栓活性。從這些比較可以看出，ARPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK陽Cu和PAK-Cu配合物的溶血栓活性增強不是來自ARPAK、QRPAK、RPAK、PAK與CuCl2的簡單疊加作用，而是來自ARPAK-Cu、QRPAK-Cu、RPAK-Cu和PAK-Cu配合物本身。試驗例2Cu(GRPAK)Cl2的溶血栓量效關(guān)系按照試驗例2的方法，將GRPAK和Cu(GRPAK)Cl2以10umol/kg、1umol/kg和0.1umol/kg三種劑量分別給藥。血栓質(zhì)量差值列入下表3。表3不同劑量GRPAK及Cu(GRPAK)Cl2引起的血栓減重<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>N=12;a)與GRPAK(1umol/kg)組及Cu(GRPAK)Cl2(lpmol/kg)組比，P〈0.i〕01;b)與GRPAK(0.1umol/kg)組及Cu(GRPAK)Cl2(0.1umol/kg)組比，P<0.01;c)與GRPAK(1umol/kg)組及Cu(GRPAK)Cl2(0.1umol/kg)組比，P<0.001;d)與NS組比，P<0.001及與CuCl2(10umol/kg)組比，P<0.01.從表3的數(shù)據(jù)不僅可以看到GRPAK和Cu(GRPAK)Cl2的溶血栓活性具有劑量依賴性，而且可以看到雖然在10umol/kg劑量下GRPAK和GRPAK-Cu的溶血栓活性沒有差異，但是在lumol/kg劑量下GRPAK的溶血栓活性顯著低于GRPAK-Cu的溶血栓活性。在0.1umol/kg劑量下雖然GRPAK己經(jīng)沒有溶血栓作用，但是GRPAK-Cu的溶血栓活性仍然確切。GRPAK-Cu的溶血栓活性增強同樣不是來自GRPAK與CuCl2的簡單疊加作用，而是來自GRPAK-Cu配合物本身。權(quán)利要求1、具有舒血管和溶血栓活性的下式I的寡肽-銅配合物，Cuωψ2(式I)其中，ω為活性肽；ψ為一般的配位陰離子。2、根據(jù)權(quán)利要求1的寡肽-銅配合物，其中co為選自PAK、RPAK、ARPAK、GRPAK和QRPAK之一的活性肽。3、根據(jù)權(quán)利要求1的寡肽-銅配合物，其中v為Cr、Br'、r或F，更優(yōu)選tir為cr。4、根據(jù)權(quán)利要求1的寡肽-銅配合物，其特征在于，所述配合物為Cu(PAK)Cl2、Cu(RPAK)Cl2、Cu(ARPAK)Cl2、Cu(GRPAK)Cl2或Cu(QRPAK)Cl2。5、制備權(quán)利要求l一4任一項所述式I寡肽-銅配合物的方法，該方法包括在水中將活性肽CO與銅化合物，例如CUV2銅鹽或銅鹽的水合物等溶解，將所得溶液用堿性試劑調(diào)節(jié)pH，過濾，將濾液濃縮，得到產(chǎn)物；或者，該方法還包括將所得產(chǎn)物進行純化的過程。6、根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于調(diào)節(jié)溶液pH的堿性試劑使用Na^03溶液；和/或溶液的pH調(diào)節(jié)至約7-8;和/或濾液濃縮通過減壓濃縮進行；和/或產(chǎn)物脫鹽使用SephadexG-10進行；和/或干燥通過冷凍干燥進行。7、根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，該方法包括在水中將ARPAK、GRPAK、QRPAK、RPAK或PAK與CuCl2'2H20溶解，得到的溶液用約INNa2C03調(diào)pH值至7-8，使溶液由淺藍色變?yōu)樯钏{色，然后將溶液過濾，濾液減壓濃縮，SephadexG-10脫鹽，冷凍干燥。8、權(quán)利要求l一4任一項所述式I寡肽-銅配合物在制備用來舒血管藥物中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求l一4任一項所述式I寡肽-銅配合物在制備用來溶血栓藥物中的應(yīng)用。10、權(quán)利要求l一4任一項所述式I寡肽-銅配合物在制備用于治療血管栓塞性疾病的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了具有舒血管和溶血栓活性的下式I的寡肽-銅配合物及其制備方法，Cuωψ<sub>2</sub>(式I)其中，ω為活性肽；ψ為一般的配位陰離子。式I寡肽-銅配合物具有優(yōu)良的舒血管和溶血栓活性，而且其舒血管和溶血栓活性的增強同樣不是來自GRPAK與CuCl<sub>2</sub>活性的簡單疊加，而是來自配合物本身，其可以用于治療血管栓塞以及血管栓塞性疾病。文檔編號C07K5/08GK101190939SQ20061014423公開日2008年6月4日申請日期2006年11月30日優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日發(fā)明者彭師奇,梅楊,超王,明趙申請人:首都醫(yī)科大學(xué)