專利名稱：一種高生物活性卵黃抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種高生物活性卵黃抗體的制備方法，屬于生物制品和工業(yè)化分離技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞卵黃中富含卵黃抗體、高磷蛋白等生物活性蛋白，并被認(rèn)為是活性抗體含量與活性最高，也是最廉價(jià)的資源。但迄今為止，還沒有如人們所期望的那樣得到工業(yè)化利用。其主要原因是因?yàn)槁腰S中含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、膽固醇、卵磷脂等多種物質(zhì)，對(duì)卵黃抗體的工業(yè)化分離造成了嚴(yán)重的困難。目前分離卵黃抗體的方法主要有以下幾種(1)采用乙醇、聚乙二醇、丙酮等有機(jī)試劑分離的方法，雖然分離效果較好，但因?yàn)槁腰S抗體主要是用于功能食品添加劑、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域，因此如采用上述辦法則有以下幾個(gè)方面的問題。一是成本較高(試劑耗量大，如目前普遍采用的PEG-6000的用量最高達(dá)到12％的高濃度)；二是工藝復(fù)雜，操作條件難以掌握，且易造成卵黃抗體活性損失；三是產(chǎn)品最終有化學(xué)有害物質(zhì)殘留，產(chǎn)品的安全性達(dá)不到要求。(2)采用離子交換、金屬螯合色譜、親和色譜分離的方法，雖然純度較高，但生產(chǎn)規(guī)模只以克計(jì)，而成本更可高達(dá)每克上百元。(3)采用CMC、海藻酸鈉和殼聚糖等大分子膠的水相抽提法，由于直接將大分子膠加入蛋黃體系，因此抽提效率較低，并在蛋黃中仍然含有較多的雜質(zhì)及CMC、海藻酸鈉等殘留膠體大分子，直接影響了下一步超濾分離濃縮工藝。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高生物活性卵黃抗體的制備方法，采用食品級(jí)天然高分子膠高效澄清技術(shù)，結(jié)合低溫超濾濃縮分離新工藝，徹底解決了在分離過程中蛋黃液中殘留高分子膠體的缺點(diǎn)，有利于卵黃抗體的分離提取，同時(shí)又使得蛋黃液可以得到進(jìn)一步的應(yīng)用。采用本發(fā)明能夠以年產(chǎn)10噸以上的規(guī)模生產(chǎn)高生物活性卵黃抗體產(chǎn)品。同時(shí)剩余蛋清和蛋黃粉經(jīng)加工后，還可得到蛋白粉、剩余蛋黃粉或蛋黃油與蛋黃卵磷脂等副產(chǎn)品，使得蛋黃的加工深度得到了極大的提高，產(chǎn)品附加值也大增加，而成本則遠(yuǎn)低于以前的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)有如下幾點(diǎn)(1)以蛋雞為生物轉(zhuǎn)化器，采用疫苗對(duì)蛋雞進(jìn)行免疫接種，以提高卵黃抗體的生物效價(jià)，一般可提高16倍至64倍。其疫苗為人體口腔、胃腸道常見致病菌、病毒等，如致病性大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、變異鏈球菌或胃幽門螺桿菌。上述菌種與免疫佐劑制成疫苗后，對(duì)20～25周齡的蛋雞進(jìn)行免疫注射，共4～6次，其雞蛋中的抗體高活性可維持1年左右。如只需生產(chǎn)普通的、無特異性的蛋黃抗體也可以省掉此免疫步驟，而生產(chǎn)工藝則完全相同。(2)采用食品級(jí)天然高分子膠高效澄清技術(shù)，結(jié)合工業(yè)化超濾濃縮分離技術(shù)，從蛋黃中分離提取活性卵黃抗體，使活性卵黃抗體的低成本、工業(yè)化分離得以實(shí)現(xiàn)，可達(dá)到年產(chǎn)10噸以上卵黃抗體產(chǎn)品的生產(chǎn)規(guī)模。卵黃抗體的產(chǎn)品純度可達(dá)到30％-50％。(3)采用有機(jī)膜或陶瓷膜微濾對(duì)濃縮液進(jìn)行冷除菌，其產(chǎn)品的總菌數(shù)可小于500CFU/g，大大好于類似產(chǎn)品一初乳粉或初乳清粉中的微生物指標(biāo)。(4)整個(gè)工藝流程都在低溫下(0～12℃)進(jìn)行，確保了產(chǎn)品的高生物活性。
本發(fā)明的工藝為(1)將蛋雞免疫后所產(chǎn)之新鮮雞蛋或普通新鮮雞蛋作為原料，經(jīng)檢查消毒后，采用手工或機(jī)械方式分離蛋清和蛋黃。蛋清可直接經(jīng)噴霧干燥制得副產(chǎn)品蛋白粉，或經(jīng)發(fā)酵后噴霧干燥制得脫糖蛋白粉。將蛋黃經(jīng)純水稀釋、攪拌、離心或沉淀分離后，得卵黃抗體粗提液，技術(shù)條件為蛋黃∶純水＝1∶6～20(w/w)，直接攪拌5～25分鐘，用蝶式離心機(jī)3000～8000r/min分離或在0～12℃下自然沉降4～16小時(shí)后分離。上清液為卵黃抗體粗提液。沉淀物(剩余蛋黃)經(jīng)噴霧干燥后制得副產(chǎn)品蛋黃粉或采用超臨界提取方法分離得到蛋黃卵磷脂、蛋黃油和剩余蛋黃粉等副產(chǎn)品。
(2)將卵黃抗體粗提液，按順序加入食品級(jí)天然高分子膠和食品級(jí)無機(jī)或有機(jī)鈣鹽，分別經(jīng)攪拌、離心分離或板框過濾后得到澄清液，技術(shù)條件為食品級(jí)天然高分子膠為阿拉伯膠、卡拉膠、海藻酸鈉、黃原膠等，無機(jī)或有機(jī)鈣鹽為食品級(jí)醋酸鈣、氯化鈣、乳酸鈣等，其組成比例視料液情況而稍有不同，食品級(jí)天然高分子膠的用量為卵黃抗體粗提液質(zhì)量的0.01％～2.8％，攪拌5～30min，然后靜置10min～40min后，經(jīng)蝶式離心或板框過濾后去除沉淀物，蝶式離心機(jī)2000～5000r/min分離或加入卵黃抗體粗提液質(zhì)量的0.1％～1.5％的硅藻土進(jìn)行板框過濾，沉淀物等雜質(zhì)棄去，取澄清液。
(3)澄清液進(jìn)行低溫連續(xù)超濾膜分離，得到濃縮截留液。超濾溫度為4～12℃，超濾膜的截留相對(duì)分子質(zhì)量為50,000～150,000，采用聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)、改性聚砜膜(PS膜)或聚醚砜膜(POS)。膜總面積可達(dá)300M2以上。
(4)超濾透過液主要是一些低分子物質(zhì)，可棄去。最后將濃縮截留液在4～12℃微濾除菌，微濾膜材料為改性聚砜膜(PS膜)或陶瓷膜等，孔徑為0.1-0.5μm。
(5)微濾透過液在-40～-30℃冷凍120分鐘，再逐步升溫至30℃，干燥22小時(shí)，得到主產(chǎn)品生物活性卵黃抗體。
本發(fā)明的有益效果(1)通過雞的疫苗免疫可得到高含量，高效價(jià)的活性卵黃抗體，極大地提高了對(duì)人體常見致病菌的抑菌能力，一般效價(jià)可提高16～64倍。
(2)該工藝采用食品級(jí)天然高分子膠提取技術(shù)，大大降低了后道工序中超濾膜的污染，使得工業(yè)化超濾生產(chǎn)得以實(shí)現(xiàn)。
(3)超濾工藝具有無相態(tài)變化，不存在高溫或化學(xué)因素破壞的優(yōu)點(diǎn)，從根本上攻克了卵黃抗體在加工過程中容易失活的難關(guān)，可最大程度地保留產(chǎn)品的活性。
(4)微濾除菌既能夠去除包括活菌體和死菌體在內(nèi)的絕大多數(shù)的細(xì)菌體，又保留了產(chǎn)品的生物活性，而其他方法(如巴氏熱殺菌或輻照低溫殺菌)都會(huì)使蛋黃抗體的效價(jià)大大降低，從而大大降低產(chǎn)品的生物活性。
(5)由于該工藝在水相提取卵黃抗體時(shí)，只使用了純水，不必調(diào)節(jié)pH，從而使得對(duì)副產(chǎn)品蛋黃粉或全蛋粉的影響比其他工藝要小得多。而且采用了膜分離等高新技術(shù)后，可保證卵黃抗體產(chǎn)品中不含任何有害物質(zhì)，不含激素，高效安全。
(6)提高了資源利用度，在生產(chǎn)過程中避免使用有機(jī)溶劑等有害物質(zhì)，減少污染，保護(hù)了環(huán)境。
(7)自動(dòng)化程度較高，操作條件容易掌握，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)成本可大幅降低。
圖1高生物活性卵黃抗體制備工藝流程框圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將10噸新鮮雞蛋經(jīng)消毒、打蛋、分蛋，所得蛋清經(jīng)噴霧干燥或微生物發(fā)酵后制得副產(chǎn)品蛋白粉或脫糖蛋白粉約600公斤左右，所得蛋黃約2.3噸加入25～45噸純水，攪拌15分鐘，沉淀4～16小時(shí)，離心分離。沉淀物為剩余蛋黃，經(jīng)噴霧干燥制得副產(chǎn)品蛋黃粉，約1200公斤左右。上清液為卵黃抗體粗提液，按配比加入食品級(jí)添加劑黃原膠和乳酸鈣，攪拌15分鐘，經(jīng)板框過濾后將沉淀物棄去。澄清液經(jīng)POS膜超濾，4～12℃，膜面積100m2。濃縮截留液經(jīng)0.22μmPS膜或陶瓷微濾膜除菌后，再急凍至-40～-30℃，保持120min左右，然后在不大于10Pa真空度，不超過30℃條件下干燥22小時(shí)，得到主產(chǎn)品生物活性卵黃抗體，約為23～30公斤。
實(shí)施例2蛋雞的免疫方法免疫的疫苗為人體口腔、胃腸道常見致病菌或病毒致病性大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、變異鏈球菌或胃幽門螺桿菌，上述菌種與免疫佐劑制成疫苗后，對(duì)20～25周齡的蛋雞進(jìn)行免疫注射，共4～6次。
取10噸蛋雞經(jīng)上述方法免疫后所產(chǎn)之新鮮雞蛋為原料，所得卵黃抗體粗提液，按配比加入食品添加劑卡拉膠和氯化鈣，其余操作同實(shí)施例1，所得主產(chǎn)品為高生物活性卵黃抗體，比實(shí)施例1從普通雞蛋中所得的生物活性卵黃抗體的生物效價(jià)高16～64倍。
應(yīng)用例本產(chǎn)品可用于含生物活性卵黃抗體的嬰兒、老年人及免疫功能低下人群的功能食品中，如嬰兒仿母乳產(chǎn)品，其主要成分有活性抗體(即活性免疫球蛋白)、乳鐵蛋白、DHA(及EPA)、溶菌酶、低分子量蛋白質(zhì)和碳水化合物，其配比近似于母乳組成，由低含量的乳糖、礦物質(zhì)、50％以上的蛋白質(zhì)和不少于5％的免疫球蛋白和1％的乳鐵蛋白組成，稀釋成濃度3.0-5.0g/L的溶液，其免疫活力與初乳相近。這類嬰兒食品在脂肪酸和活性抗體的組成含量上與母乳相近，有利于嬰兒吸收并提高對(duì)疾病的免疫能力，對(duì)嬰兒的生長發(fā)育也有明顯的促進(jìn)作用。另外，也可直接添加于新一代仿母乳嬰兒配方奶粉中，生產(chǎn)功能性更接近于母乳的新一代嬰兒配方奶粉，其產(chǎn)品含有0.2％～2.0％以上的生物活性卵黃抗體。
權(quán)利要求
1.一種高生物活性卵黃抗體的制備方法，其特征是采用食品級(jí)天然高分子膠提取技術(shù)，結(jié)合超濾技術(shù)，從蛋黃中分離生物活性卵黃抗體，其工藝為(1)以蛋雞免疫后所產(chǎn)之新鮮雞蛋或普通新鮮雞蛋為原料，經(jīng)消毒、分離蛋清后，將所得蛋黃液經(jīng)純水稀釋、攪拌、離心或沉淀分離處理蛋黃∶純水質(zhì)量比為1∶6～20，攪拌5～25分鐘，用蝶式離心機(jī)3000～8000r/min分離或在0～12℃下自然沉降4～16小時(shí)，上清液為卵黃抗體粗提液；(2)卵黃抗體粗提液中依次加入食品級(jí)天然高分子膠和食品級(jí)無機(jī)或有機(jī)鈣鹽，經(jīng)攪拌、離心分離或板框過濾處理食品級(jí)天然高分子膠的用量為卵黃抗體粗提液質(zhì)量的0.01％～2.8％，食品級(jí)無機(jī)或有機(jī)鈣鹽的用量為卵黃抗體粗提液質(zhì)量的0.01％～3.50％，攪拌5～30分鐘，靜置10～40分鐘，蝶式離心機(jī)2000～5000r/min分離，或加入卵黃抗體粗提液質(zhì)量的0.1％～1.5％的硅藻土進(jìn)行板框過濾，取澄清液；(3)將澄清液進(jìn)行連續(xù)超濾膜分離，得到濃縮截留液，超濾溫度4～12℃，超濾膜的截留相對(duì)分子質(zhì)量為50,000～150,000，膜材料為聚偏氟乙烯膜、改性聚砜膜或聚醚砜膜；(4)將濃縮截留液在4～12℃微濾除菌，微濾膜孔徑為0.1-0.5μm，膜材料為陶瓷膜或改性聚砜膜；(5)將微濾透過液經(jīng)-40～-30℃冷凍120分鐘，再逐步升溫至30℃，干燥22小時(shí)，得到主產(chǎn)品生物活性卵黃抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是蛋雞的免疫免疫的疫苗為人體口腔、胃腸道常見致病菌或病毒致病性大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、變異鏈球菌或胃幽門螺桿菌，上述菌種與免疫佐劑制成疫苗后，對(duì)20～25周齡的蛋雞進(jìn)行免疫注射，共4～6次，蛋雞經(jīng)免疫后所產(chǎn)之新鮮雞蛋比普通雞蛋所含有卵黃抗體的生物效價(jià)高16～64倍，其雞蛋中的抗體高活性可維持1年。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用食品級(jí)天然高分子膠為阿拉伯膠、卡拉膠、海藻酸鈉或黃原膠，所用食品級(jí)無機(jī)或有機(jī)鈣鹽為醋酸鈣、氯化鈣或乳酸鈣。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是采用微濾技術(shù)對(duì)超濾濃縮截留液進(jìn)行冷除菌，主產(chǎn)品生物活性卵黃抗體的微生物指標(biāo)總菌數(shù)小于500CFU/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是主產(chǎn)品生物活性卵黃抗體中卵黃抗體的含量達(dá)到30％-50％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是實(shí)現(xiàn)了年產(chǎn)10噸以上的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)生物活性卵黃抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是原料雞蛋分離所得之蛋清，直接經(jīng)噴霧干燥制得副產(chǎn)品蛋白粉，或者經(jīng)發(fā)酵后噴霧干燥制得副產(chǎn)品脫糖蛋白粉；蛋黃經(jīng)抽提后的剩余蛋黃沉淀物經(jīng)噴霧干燥制得副產(chǎn)品蛋黃粉，或進(jìn)一步加工得到蛋黃油與蛋黃卵磷脂。
全文摘要
一種高生物活性卵黃抗體的制備方法，屬于生物制品和工業(yè)化分離技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用食品級(jí)天然高分子膠高效提取技術(shù)，結(jié)合超濾技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化規(guī)模從蛋黃中分離提取高生物活性卵黃抗體，年產(chǎn)10噸以上。產(chǎn)品中卵黃抗體含量可達(dá)30％－50％，同時(shí)蛋清和剩余蛋黃經(jīng)加工后，還可得到蛋白粉、蛋黃粉或蛋黃油與蛋黃卵磷脂等副產(chǎn)品。本發(fā)明采用了生物免疫、膜分離等高新技術(shù)，具有技術(shù)含量高，資源利用度高，自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，是清潔工藝生產(chǎn)綠色生物活性食品的典型代表。
文檔編號(hào)C07K16/02GK1844144SQ20061004041
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月8日
發(fā)明者楊嚴(yán)俊, 徐榕榕 申請(qǐng)人:江南大學(xué)