卡諾拉分離蛋白的制備和在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的用途的制作方法

專利名稱：卡諾拉分離蛋白的制備和在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及卡諾拉(canola)分離蛋白的制備及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的用途。
背景技術(shù)：
卡諾拉分離蛋白可從卡諾拉油籽粕制得。在2002年5月3日提交的共同待審美國專利申請第10/137,391號和相應(yīng)的PCT出版物WO 02/089597中(所述專利申請轉(zhuǎn)讓至其受讓人，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)，描述了從卡諾拉油籽粕制備卡諾拉分離蛋白的方法，這種分離蛋白的蛋白質(zhì)含量為至少100wt％(Nx6.25)。所述方法涉及多步驟方法用鹽溶液浸提卡諾拉油籽粕；使所得蛋白質(zhì)水溶液與殘余油籽粕分離；使用選擇性膜技術(shù)，將所述水溶液的蛋白質(zhì)濃度提高至至少約200g/L，同時保持離子強度基本不變；將所得濃縮蛋白質(zhì)溶液稀釋至冷水中，以促使形成蛋白質(zhì)膠束；讓蛋白質(zhì)膠束沉析形成無定形、粘稠、凝膠狀的面筋樣蛋白質(zhì)膠束團(PMM)；和從上清液中回收蛋白質(zhì)膠束團，所述蛋白質(zhì)膠束團經(jīng)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量為至少約100wt％(Nx6.25)。本文所用的蛋白質(zhì)含量以干重計?？筛稍锘厥盏腜MM。在上述方法的一個實施方案中和在第10/137,391號申請的具體描述中，對PMM沉析步驟所得上清液進行加工，以從濕PMM和上清液中回收含干燥蛋白的分離蛋白。可首先用超濾膜濃縮上清液，然后將濕PMM與濃縮上清夜混合并將混合物干燥，來實現(xiàn)這個程序。所得卡諾拉分離蛋白具有高純度，蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(Nx6.25)，優(yōu)選至少約100wt％(Nx6.25)。在上述方法的另一個實施方案中和在第10/137,391號申請的具體描述中，對PMM沉析步驟所得上清液進行加工，以從上清液中回收蛋白質(zhì)?？墒紫扔贸瑸V膜濃縮上清液，然后將濃縮物干燥來實現(xiàn)這個程序。所得卡諾拉分離蛋白具有高純度，蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(Nx6.25)，優(yōu)選至少約100wt％(Nx6.25)。上述美國專利申請所述的程序基本上是分批程序。在2002年11月19日提交的共同待審美國專利申請第10/298,678號和相應(yīng)PCT出版物WO 03/043439中(所述專利申請轉(zhuǎn)讓至其受讓人，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)，描述了制備卡諾拉分離蛋白的連續(xù)方法。根據(jù)所述方法，將卡諾拉油籽粕與鹽溶液連續(xù)混合，通過管道輸送所得混合物，同時使蛋白質(zhì)從卡諾拉油籽粕中浸提出來，形成蛋白質(zhì)水溶液，使所述蛋白質(zhì)水溶液連續(xù)從殘余卡諾拉油籽粕中分離，將所述蛋白質(zhì)水溶液連續(xù)輸送通過選擇性膜操作，使所述蛋白質(zhì)水溶液的蛋白質(zhì)含量提高至至少約200g/L，同時保持離子強度基本不變，將所得濃縮蛋白質(zhì)溶液與冷水連續(xù)混合，以促使形成蛋白質(zhì)膠束，讓所述蛋白質(zhì)膠束連續(xù)沉析，同時連續(xù)溢出上清液，直到在沉析槽中積累了所需量的PMM。從沉析槽中回收PMM，且可加以干燥。經(jīng)凱氏定氮法測定，所述PMM的蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(Nx6.25)，優(yōu)選至少約100wt％(Nx6.25)?？扇缟鲜雒绹鴮＠暾埖?0/137,391號中所述，對溢出的上清液進行加工，以從中回收卡諾拉分離蛋白。已知卡諾拉種子含有約10至約30wt％的蛋白質(zhì)，且已鑒定出幾種不同的蛋白質(zhì)成分。這些蛋白質(zhì)通過不同的沉降系數(shù)(S)相區(qū)別。這些已知且已鑒定的蛋白質(zhì)包括12S球蛋白(稱為十字花科蛋白)和2S儲存蛋白質(zhì)(稱油菜籽蛋白)。如2003年4月15日提交的共同待審美國專利申請第10/413,371號和相應(yīng)的PCT出版物WO 03/088760中所述(所述專利申請轉(zhuǎn)讓至其受讓人，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)，PMM衍生的卡諾拉分離蛋白主要由7S蛋白質(zhì)和一些12S蛋白質(zhì)組成，而上清液衍生的卡諾拉分離蛋白主要由2S蛋白質(zhì)組成。在這種現(xiàn)有方法中，通過沉析PMM使卡諾拉分離蛋白單獨衍自濃縮卡諾拉蛋白質(zhì)溶液，并單獨加工上清液以獲得額外數(shù)量的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液?？ㄖZ拉也稱油菜(rapeseed或oil seed rape)。
發(fā)明概述在本發(fā)明中，蛋白質(zhì)濃縮步驟所得濃縮蛋白質(zhì)溶液直接進行干燥，而不是經(jīng)加工產(chǎn)生PMM并單獨加工上清液。本方法簡化卡諾拉分離蛋白的生產(chǎn)，所述卡諾拉分離蛋白具有廣譜的12S、7S和2S蛋白質(zhì)。由于方法步驟較少，分離蛋白以更經(jīng)濟的方式制得。因此，本發(fā)明的一個方面提供制備卡諾拉分離蛋白的方法，所述方法包括(a)浸提卡諾拉油籽粕，以導(dǎo)致所述卡諾拉油籽粕中的蛋白質(zhì)溶解，形成蛋白質(zhì)含量為約5至約40g/L和pH約5至約6.8的蛋白質(zhì)水溶液；(b)使蛋白質(zhì)水溶液與殘余卡諾拉油籽粕分離；(c)使用選擇性膜技術(shù)，將所述蛋白質(zhì)水溶液的蛋白質(zhì)濃度提高至至少約50g/L，同時保持離子強度基本不變，以提供濃縮蛋白質(zhì)溶液；和(d)干燥濃縮蛋白質(zhì)溶液，以提供以干重計蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(Nx6.25)的卡諾拉分離蛋白。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的卡諾拉分離蛋白的卡諾拉蛋白質(zhì)分布為約25至約55wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)、約45至約75wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)和約0至約15wt％的12S卡諾拉蛋白質(zhì)，優(yōu)選約40至約50wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)、約50至約60wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)和約1至約5wt％的12S卡諾拉蛋白質(zhì)。根據(jù)本文方法生產(chǎn)的卡諾拉分離蛋白可用于分離蛋白的常規(guī)應(yīng)用中，例如加工食品的蛋白質(zhì)強化、油類的乳化、培烤食品的成型劑和氣體包載制品中的發(fā)泡劑。另外，卡諾拉分離蛋白可制成蛋白質(zhì)纖維用于人造肉，可在以蛋清作為粘合劑的食物中用作蛋清代用品或補充劑?？ㄖZ拉分離蛋白可用作營養(yǎng)補充劑。卡諾拉分離蛋白的其它用途是在寵物食品、動物飼料、水產(chǎn)養(yǎng)殖中和在工業(yè)和美容業(yè)的應(yīng)用及個人護理產(chǎn)品。由于通過本發(fā)明方法制得的分離蛋白與通過上述美國專利申請所述程序獲得的分離蛋白相比純度通常較低，特別是鹽含量較高，優(yōu)選它們用于非人類應(yīng)用中。如下文所更詳細地描述，分離蛋白的一個具體用途是在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用作飼料。然而，可通過任何合適程序，例如通過透析或滲濾加工分離蛋白，以減少殘余鹽含量。本發(fā)明的另一個方面提供水產(chǎn)養(yǎng)殖用飼料組合物，所述飼料組合物包含按本文所提供方法生產(chǎn)的卡諾拉分離蛋白。可特別配制飼料組合物，用于飼養(yǎng)鮭科魚類(salmonid)，包括大麻哈魚(salmon)和鱒魚(trout)。
附圖簡述

圖1A-1C是用以生產(chǎn)卡諾拉分離蛋白的臺式(bench)浸提程序所得樣品的HPLC色譜圖；圖2A-2B是在中試工廠規(guī)模浸提程序產(chǎn)生的卡諾拉分離蛋白的HPLC色譜圖。
發(fā)明詳述如上述美國專利申請所詳述，卡諾拉分離蛋白可通過分批方法或連續(xù)方法或半連續(xù)方法從卡諾拉油籽粕分離制得。提供卡諾拉分離蛋白的方法的起始步驟涉及使卡諾拉油籽粕中的蛋白質(zhì)類物質(zhì)溶解出來。從卡諾拉籽粕回收得到的蛋白質(zhì)類物質(zhì)可能是卡諾拉籽或其它油籽中天然存在的蛋白質(zhì)，或者所述蛋白質(zhì)類物質(zhì)可能是經(jīng)遺傳操作改良但仍具有天然蛋白質(zhì)的特有疏水性質(zhì)和極性性質(zhì)的蛋白質(zhì)?？ㄖZ拉粕可以是卡諾拉油籽除去卡諾拉油后得到的任何卡諾拉粕，由于例如使用熱己烷浸出方法或者冷油擠出方法，其中含有的非變性蛋白質(zhì)水平有所變動。從卡諾拉油籽除去卡諾拉油通常是通過與本文描述的分離蛋白回收程序分開的操作過程來實現(xiàn)的。蛋白質(zhì)溶解通過使用食品級鹽溶液來實現(xiàn)最為有效，因為鹽的存在增強了可溶性蛋白質(zhì)從油籽粕中除去。在預(yù)期卡諾拉分離蛋白作非食品用途的情況下，例如在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，可使用非食品級化學(xué)品。鹽通常是氯化鈉，但也可使用其他鹽，如氯化鉀。鹽溶液的離子強度為至少約0.05，優(yōu)選至少約0.10，以使相當數(shù)量的蛋白質(zhì)的溶解得以實現(xiàn)。隨著鹽溶液的離子強度提高，油籽粕中的蛋白質(zhì)的溶解程度開始上升，直至達到最大值。隨后離子強度的任何提高都不會增加溶解的總蛋白質(zhì)。引起最大蛋白質(zhì)溶解的食品級鹽溶液離子強度隨所用的鹽和所選擇的油籽粕而有所變化。通常優(yōu)選采用的離子強度值小于約0.8，更優(yōu)選離子強度值為約0.1至約0.6。在分批方法中，蛋白質(zhì)的鹽溶解在至少約5℃的溫度下，優(yōu)選在最高達約35℃下實現(xiàn)，優(yōu)選同時進行攪拌，以減少溶解時間，所述時間通常為約10分鐘至約60分鐘。優(yōu)選所實現(xiàn)的溶解作用要能從油籽粕中充分浸提出盡可能多的蛋白質(zhì)，以獲得總體上的高產(chǎn)物得率。溫度下限選定為約5℃，是因為低于此溫度時溶解作用慢得無法進行，而優(yōu)選的溫度上限選定為約35℃，是因為在分批模式下，溫度更高時所述方法會變得不經(jīng)濟。在連續(xù)方法中，從卡諾拉油籽粕浸提蛋白質(zhì)是通過適合實現(xiàn)從卡諾拉油籽粕連續(xù)浸提蛋白質(zhì)的任何方式來進行的。在一個實施方案中，卡諾拉油籽粕與食品級鹽溶液連續(xù)混合，所得混合物通過具有一定長度的管道或者導(dǎo)管輸送，輸送流速達成的停留時間足以實現(xiàn)期望依照本文所述參數(shù)進行的浸提作用。在這種連續(xù)程序中，鹽溶解步驟在最長為約10分鐘的時間內(nèi)快速完成，優(yōu)選所實現(xiàn)的溶解作用從卡諾拉油籽粕中充分浸提出盡可能多的蛋白質(zhì)。連續(xù)程序中的溶解過程優(yōu)選在高溫下實現(xiàn)，優(yōu)選約35℃以上，通常最高達約65℃。食品級鹽水溶液和卡諾拉油籽粕的天然pH約5至約6.8，優(yōu)選pH值約5.3至約6.2。可按需使用任何合適的酸(通常是鹽酸)或者堿(通常是氫氧化鈉)，將鹽溶液的pH調(diào)至約5至約6.8范圍的任何期望值。在溶解步驟進行過程中，食品級鹽溶液中的油籽粕濃度可能變化很大。典型的濃度值為約5至約15％w/v。用鹽水溶液進行的蛋白質(zhì)浸提步驟具有溶解卡諾拉粕中可能存在的脂類的額外效果，這會導(dǎo)致水相中存在脂類。浸提步驟所得的蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)濃度通常為約5至約40g/L，優(yōu)選為約10至約30g/L。鹽水溶液中可含有抗氧化劑。所述抗氧化劑可以是任何合適的抗氧化劑，如亞硫酸鈉或者抗壞血酸。所采用的抗氧化劑量在約0.01至約1wt％之間變化，優(yōu)選約0.05wt％?？寡趸瘎┯靡砸种频鞍踪|(zhì)溶液中酚類物質(zhì)的氧化。然后可通過任何合適方式，使浸提步驟所得的水相與殘余卡諾拉粕分離，例如通過采用潷析離心機，接著通過碟式離心法和/或過濾，除去殘余的粕。分離出的殘余粕可進行干燥，以便處置?？赏ㄟ^將粉狀活性炭或者其他色素吸附劑與分離出的蛋白質(zhì)水溶液混合，然后方便地通過過濾法除去吸附劑，以提供蛋白質(zhì)溶液，改善最終卡諾拉分離蛋白的顏色，使其顏色較淺，黃顏色較淡。也可使用滲濾法除去色素。所述色素去除步驟可在任何合適的條件下進行，通常在分離出的蛋白質(zhì)水溶液的環(huán)境溫度下，采用任何合適的色素吸附劑來進行。對于粉狀活性炭，用量為約0.025％至約5％w/v，優(yōu)選約0.05％至約2％w/v。在卡諾拉籽粕含有相當數(shù)量的脂類的情況下，如在美國專利第5,844,086號和第6,005,076號(轉(zhuǎn)讓至其受讓人，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)中所述，那么可將其中描述的除油步驟用于分離的蛋白質(zhì)水溶液和下文討論的濃縮蛋白質(zhì)水溶液。當進行顏色改善步驟時，這個步驟可在第一除油步驟之后進行。作為用鹽水溶液浸提油籽粕的替代方案，所述浸提可只用水來進行，盡管比起鹽水溶液，只用水往往從油籽粕浸提出較少的蛋白質(zhì)。在采用這種替代方案的情況下，可將鹽以上述濃度加入到從殘余油籽粕分離出的蛋白質(zhì)溶液中，以使蛋白質(zhì)在下述濃縮步驟中得以維持在溶液中。當進行除色步驟和/或第一脫脂步驟時，鹽通常是在這種操作完成后加入。另一種替代程序是在相對較高的pH值下，即高于約6.8，通常最高達約9.9下，用食品級鹽溶液浸提油籽粕?？赏ㄟ^使用任何合適的食品級堿，如氫氧化鈉水溶液，將食品級鹽溶液的pH調(diào)至期望的堿性值?；蛘?，可在相對較低的pH值下，即低于約pH 5，通常低至約pH 3下，用鹽溶液浸提油籽粕。在使用這種替代方案的情況下，隨后可通過任何合適方式，使油籽粕浸提步驟所得的水相與殘余卡諾拉粕分離，例如通過采用潷析離心法，接著通過碟式離心法和/或過濾，除去殘余的粕。分離出的殘余粕可進行干燥，以便處置。然后，如上所述，將在高或者低pH浸提步驟中獲得的蛋白質(zhì)水溶液的pH調(diào)至約5至約6.8的范圍，優(yōu)選約5.3至約6.2的范圍，接著再如下文所討論作進一步的處理。可適當使用任何合適的酸(如鹽酸)或者堿(如氫氧化鈉)，進行所述pH調(diào)整。然后將蛋白質(zhì)水溶液濃縮，通常約4至約20倍，以提高其中的蛋白質(zhì)濃度，同時保持其中的離子強度基本不變。通常進行這種濃縮操作，以提供蛋白質(zhì)濃度為至少約50g/L，優(yōu)選至少為約200g/L的濃縮蛋白質(zhì)溶液。可通過任何適合分批或者連續(xù)操作的合適方式，如通過采用任何合適的選擇性膜技術(shù)(如超濾或者滲濾)，來進行濃縮步驟，使用的膜例如中空纖維膜或者螺旋錯流膜，視不同的膜材質(zhì)及形式而定，其合適分子量截留值(MWCO)如約3,000至約100,000道爾頓，優(yōu)選約5,000至約10,000道爾頓。膜可以是中空纖維膜或者螺旋錯流膜。對于連續(xù)操作，確定膜的尺寸，以允許蛋白質(zhì)水溶液透過膜時能夠獲得期望的濃縮程度。然后，可使用摩爾濃度和pH與浸提溶液相同的鹽水溶液，對濃縮蛋白質(zhì)溶液進行滲濾步驟?？墒褂眉s2至約20體積的滲濾溶液，優(yōu)選約5至約10體積的滲濾溶液來進行這種滲濾操作。在滲濾操作中，更多數(shù)量的污染物可隨透過液通過膜而從蛋白質(zhì)水溶液中除去。滲濾操作可進行到透過液中沒有另外相當數(shù)量的酚類物質(zhì)和可見顏色存在為止?？梢暡煌哪げ馁|(zhì)及形式而定，使用分子量截斷值在約3,000至約100,000道爾頓的范圍內(nèi)，優(yōu)選約5,000至約10,000道爾頓的范圍內(nèi)的膜進行這種滲濾操作。在滲濾步驟的至少一部分過程中，在滲濾介質(zhì)中可存在抗氧化劑。所述抗氧化劑可以是任何合適的抗氧化劑，如亞硫酸鈉或者抗壞血酸。滲濾介質(zhì)中采用的抗氧化劑的量取決于所采用的材料，可在約0.01至約1wt％的范圍內(nèi)變動，優(yōu)選約0.05wt％?？寡趸瘎┯靡砸种茲饪s卡諾拉分離蛋白溶液中存在的酚類物質(zhì)的氧化。濃縮步驟和滲濾步驟可在任何合適的溫度下進行，通常為約20℃至約60℃，進行的時間足以實現(xiàn)期望的濃縮程度。所用的溫度和其他條件在一定程度上取決于用以進行濃縮操作的膜設(shè)備和期望的溶液蛋白質(zhì)濃度。在這個步驟中將蛋白質(zhì)溶液濃縮至高于約200g/L的優(yōu)選濃度，不僅將方法得率提高到高于約40％，優(yōu)選高于約80％的水平(以回收為干分離蛋白的浸提蛋白質(zhì)的比例計)，而且還降低了干燥后最終分離蛋白的鹽濃度。控制分離蛋白的鹽濃度的能力對于分離蛋白的應(yīng)用是重要的，鹽濃度的變化會影響具體食品應(yīng)用中的功能性質(zhì)和感觀性質(zhì)。眾所周知，超濾及類似的選擇性膜技術(shù)允許低分子量物質(zhì)通過，而阻止較高分子量物質(zhì)通過。低分子量物質(zhì)不僅包括食品級鹽的離子，也包括從原始材料中浸提出來的低分子量物料，如碳水化合物、色素和抗營養(yǎng)因子，以及任何低分子量形式的蛋白質(zhì)。視不同的膜材質(zhì)及形式而定，通常選定膜的分子量截斷值，以保證相當比例的蛋白質(zhì)得以保留在溶液中，同時又讓污染物通過。如美國專利第5,844,086號和第6,005,076號中所描述，如有需要，可對濃縮和任選滲濾過的蛋白質(zhì)溶液進行進一步的除油操作。作為上述脫色操作的替代方案，可對濃縮和任選滲濾過的蛋白質(zhì)溶液進行脫色操作。在這里，可使用粉狀活性炭以及顆粒狀活性炭(GAC)。可用作顏色吸附劑的另一種材料是聚乙烯吡咯烷酮。顏色吸附劑處理步驟可在任何便利條件下，通常在卡諾拉蛋白質(zhì)溶液的環(huán)境溫度下進行。對于粉狀活性炭，用量可以為約0.025％至約5％w/v，優(yōu)選約0.05％至約2％w/v。當用聚乙烯吡咯烷酮作為顏色吸附劑時，用量可以為約0.5％至約5％w/v，優(yōu)選約2％至約3％w/v?？赏ㄟ^任何便利手段，如通過過濾，將顏色吸附劑從卡諾拉蛋白質(zhì)溶液中除去。可對從任選脫色步驟獲得的濃縮和任選滲濾過的蛋白質(zhì)溶液進行巴氏滅菌，以殺滅任何細菌，所述細菌可能因為保藏或者其他原因在原來的粕中早已存在，且在浸提步驟中被從粕中浸提到卡諾拉分離蛋白溶液中。這種巴氏滅菌可在任何期望的巴氏滅菌條件下進行。通常，將濃縮和任選滲濾過的蛋白質(zhì)溶液加熱到約55°至約70℃的溫度，優(yōu)選約60°至約65℃，保持約10至約15分鐘，優(yōu)選約10分鐘。然后可將巴氏滅菌過的濃縮蛋白質(zhì)溶液冷卻，優(yōu)選冷卻至約25°至約40℃的溫度，以供如下所述進行進一步的處理。然后通過任何便利技術(shù)，如噴霧干燥法或冷凍干燥法，使從濃縮步驟、任選滲濾步驟、任選脫色步驟和任選除油步驟獲得的濃縮蛋白質(zhì)溶液干燥成干品形式，以提供蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％蛋白質(zhì)(Nx6.25)，優(yōu)選至少約100wt％蛋白質(zhì)(Nx6.25)，且基本未變性(通過差示掃描量熱法測定)的卡諾拉分離蛋白。卡諾拉分離蛋白的卡諾拉蛋白質(zhì)分布為約25至約55wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)、約45至約75wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)和約0至約15wt％的12S卡諾拉蛋白質(zhì)，優(yōu)選約40至約50wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)、約50至約60wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)和約1至約5wt％的12S卡諾拉蛋白質(zhì)。如前所述，卡諾拉分離蛋白的一個潛在用途是在水產(chǎn)養(yǎng)殖中。在鮭科魚類的飼養(yǎng)中，飼料約占生產(chǎn)費用的35至60％，且約一半的飼料成本來自蛋白質(zhì)來源。優(yōu)質(zhì)的魚粉被用作鮭科魚類食物中蛋白質(zhì)的主要來源，因為它味道極佳，可消化蛋白質(zhì)和能量水平高，氨基酸和脂肪酸分布極好。然而，魚粉在質(zhì)量、可獲得性和價格方面各不相同。質(zhì)量受原材料類型和新鮮程度、加工和貯藏條件以及可溶性物質(zhì)與濾餅的比例和抗氧化劑水平的影響。由于對有鰭魚類和甲殼類養(yǎng)殖、寵物食品和特種牲畜飼料的需求增加，預(yù)測魚粉的價格將提高。由于水產(chǎn)養(yǎng)殖的利潤水平取決于生產(chǎn)成本和飼養(yǎng)產(chǎn)品市場價格之間的關(guān)系，較高的魚粉價格將意味著生產(chǎn)成本增加，從而減少利潤空間。降低生產(chǎn)成本的一個方法是通過開發(fā)新的更便宜的蛋白質(zhì)產(chǎn)品來部分或全部代替鮭科魚類食物中的魚粉。魚粉的一個替代品來源是油籽粕，包括卡諾拉油籽粕。這種粕化學(xué)組成相當固定，且成本不到高質(zhì)量的魚粉的一半(以每公斤蛋白質(zhì)計)。另外，如下表6所示，基于魚類所需的必需氨基酸分布，卡諾拉油籽粕的等級極好。然而，卡諾拉油籽粕由于存在包括植酸、硫代葡萄糖苷和酚類化合物的抗營養(yǎng)因子(ANF)及不溶性纖維，使其適口性和可消化性下降，其使用存在缺點。一項未發(fā)表的研究評估了卡諾拉蛋白濃縮物(74wt％蛋白質(zhì))對淡水虹鱒魚(Oncorltynchus inykiss)和海水大西洋鮭(Salmo salar)的營養(yǎng)價值。在蛋白質(zhì)可消化性方面，卡諾拉蛋白產(chǎn)品的蛋白質(zhì)消化系數(shù)比魚粉好，能量消化系數(shù)與魚粉近似，計算出的可消化能量與魚粉近似?？ㄖZ拉蛋白質(zhì)產(chǎn)品即使在低于最適蛋白質(zhì)濃度下，仍顯示出與市售飼料相同的生長率和飼料攝入率。蛋白質(zhì)功效比例(PER)是所有蛋白質(zhì)制品的唯一最重要積極(positive)指標。在未發(fā)表研究中所用的卡諾拉蛋白質(zhì)由于加工困難，其蛋白質(zhì)濃度低于最佳值，但盡管如此，卡諾拉蛋白產(chǎn)品膳食具有與基本膳食可比的PER，所述基本膳食是特殊研究膳食(specialresearch diet)和特殊商業(yè)膳食(special commercial diet)。特殊商業(yè)飲食的PER在統(tǒng)計學(xué)上與卡諾拉蛋白產(chǎn)品和基礎(chǔ)PER值相同。這些結(jié)果不能用濃縮物或分離物形式的大豆蛋白取得。鑒于本發(fā)明產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)分布和通過本文所述程序進行的真正分離蛋白的提供，預(yù)期通過使用本發(fā)明產(chǎn)品，可獲得的鮭科魚類飼養(yǎng)結(jié)果比在未發(fā)表的研究中獲得的有所改善。當通過對濃縮蛋白質(zhì)溶液進行干燥制得卡諾拉分離蛋白時，所述產(chǎn)品比經(jīng)上述已有技術(shù)即美國專利申請第10/137,391號所討論的PMM方法分離所得的產(chǎn)品含有明顯更高濃度的殘余鹽。鹽的存在對分離蛋白的某些用途，例如在水產(chǎn)養(yǎng)殖的用途不會有害。然而，在鹽的存在對卡諾拉分離蛋白的預(yù)期用途有害的情況下，可在干燥之前通過透析或滲濾蛋白質(zhì)水溶液(其可為濃縮、任選滲濾的卡諾拉蛋白質(zhì)溶液形式)將鹽除去。
實施例實施例1本實施例說明本發(fā)明提供卡諾拉分離蛋白的方法。在19.8℃下，將150kg AL022批市售卡諾拉油籽粕加入到1010.5L 0.1M鹽水(NaCl)中，混合30分鐘，以提供蛋白質(zhì)水溶液。在混合的中途(15分鐘)，加入0.05wt％或500g w/v的抗壞血酸作為抗氧化劑。浸提pH是6.12，鹽的天然pH未作調(diào)整。為從浸提溶液中除去粕，將粕漿通過真空過濾帶，結(jié)果獲得790L平均蛋白質(zhì)含量為1.74wt％(17.4g/L)的溶液。然后將所述溶液通過自動清洗離心機(desludger centrifuge)和裝有2.0um過濾墊的壓濾機以進一步澄清蛋白質(zhì)溶液。最終的澄清蛋白質(zhì)提取物體積為780L，蛋白質(zhì)含量為1.58wt％(15.8g/L)。然后在二膜系統(tǒng)上用聚偏二氟乙烯(PVDF)5螺旋錯流膜使700L的澄清蛋白質(zhì)溶液等分試樣進行超濾(UF)。這些膜的MWCO范圍為5000道爾頓?？傮w積從700L減少至32L或者說減少21.8倍體積。所得的32L濃縮蛋白質(zhì)溶液或截留液平均蛋白質(zhì)含量為25.10wt％(251g/L)。將UF步驟所得的截留液在60℃下巴氏滅菌10分鐘，然后將等分試樣在APV噴霧干燥器上進行干燥。干制品的最終蛋白質(zhì)含量原樣為93.08wt％，以干重計為95.46wt％(Nx6.25)。(百分氮含量用Leco FP528定氮儀測定)。該批標識為BW-AL022-I02-03A。
實施例2本實施例描述實驗室規(guī)模的卡諾拉分離蛋白樣品的制備。將75kg實施例1所用的相同卡諾拉粕加入到500mL 0.10M鹽水溶液(15％w/w)中，混合物在旋轉(zhuǎn)搖動器上以220rpm振蕩30分鐘。含1.99wt％蛋白質(zhì)的浸出物以10,000rpm離心20分鐘，并通過縐布槽紋(crepe-fluted)濾紙過濾。在Amico Ultrafiltration裝置上用5000MWCO的聚醚砜(PES)膜濃縮350ml濾液，直至收集到150ml截留液。用350L 0.1M鹽水溶液對截留液進行滲濾(DF)，產(chǎn)生75ml含6.24wt％蛋白質(zhì)的DF截留液。在冷凍溫度下，使用Spectra/Por 6-8,000MWCO管對截留液進行透析。將透析樣品冷凍，然后凍干。所得卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)含量為101wt％(Nx6.25)。
實施例3本實施例提供對實施例1和2中生產(chǎn)的卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)分析。對如實施例1和2所述制備的卡諾拉分離蛋白進行HPLC分析。臺式浸提物、臺式DF透過液、臺式DF UF透析的卡諾拉分離蛋白HPLC色譜圖分別見圖1A、1B和1C。兩個不同日期測定的BW-AL022-I02-03A樣品HPLC色譜圖見圖2A和2B。如實施例1和2所述制備的卡諾拉分離蛋白的分析結(jié)果包含于下表1-5中。表5包含樣品與典型的得自PMM(C300)和得自上清液(C200)的卡諾拉分離蛋白的氨基酸比較分析，所述卡諾拉分離蛋白如2002年10月9日提交的共同待審美國專利申請第10/266,701號所述進行制備，所述專利申請轉(zhuǎn)讓至其受讓人，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。從這些數(shù)據(jù)可看到，臺式分離物(實施例2)顯示出的蛋白質(zhì)比例(基于峰面積)比I02分離物(實施例1)高。兩者都顯示出球狀蛋白質(zhì)(7S、12S、＞12S和亞單位)占總蛋白質(zhì)峰面積的約2/3，白蛋白(2S和油菜籽蛋白原(pronapin))占另外1/3。在HPLC色譜圖中發(fā)現(xiàn)的其它成分表明在臺式分離物中植酸水平相對較高，酚類(及雜類成分)含量較低(基于峰面積)。這個結(jié)果表明臺式分離物比I02分離物含有較少的游離酚酸。顏色差異(基于A330’)可能是由于蛋白質(zhì)上所粘附的酚類不能通過過濾膜除去。從2003年9月19日的首次掃描到2003年12月18日的最近操作，I02 HPLC-SEC(圖2，表2)分布除抗壞血酸外基本保持不變。如這一時間范圍的峰面積所測出，抗壞血酸隨時間而氧化，數(shù)量發(fā)生減少。結(jié)果，如所顯示，其它成分比例提高，但這對蛋白質(zhì)比例影響極微。臺式樣品(再溶解的提取物、UF透過液、DF透過液、DF截留液和DF透析FD截留液)(圖1，表1)的HPLC-SEC分析表明，UF、DF和透析步驟除去了大部分的酚類物質(zhì)和雜類成分，但除去植酸不夠有效。植酸往往與蛋白質(zhì)牢固地結(jié)合。盡管如此，在臺式透過液的HPLC色譜圖中還是觀察到植酸，這表明部分植酸(可能是總量的20-30％)通過膜除去。如所顯示，實施例1的分離物含有鹽和其它礦物質(zhì)，占分離物最終干重的約3％(表3)。沒有檢測到毒性成分。結(jié)果顯示由于在本樣品的制備中使用DF和透析步驟，臺式分離物蛋白質(zhì)含量較高。在表4A和4B中，將氨基酸分析結(jié)果轉(zhuǎn)換為“克每100克氨基酸”。表中同時顯示平均值和標準偏差，表明差異極少。這是所期望的，因為DF和透析步驟除去的是非蛋白質(zhì)，所述步驟不以任何顯著方式影響氨基酸平衡，除非有大量的游離氨基酸和縮氨酸存在。表5將當前樣品的氨基酸分布與先前研究的結(jié)果進行了比較。當前截留液的成分與先前的截留液(得自A8和A10粕)以及得自A10粕的Puratein樣品非常相似。Puratein是PMM和Supertein的混合物，應(yīng)當與截留液分析結(jié)果相似。表5還顯示了C200和C300(A10粕)的氨基酸分布。截留液和Puratein樣品落在這兩種分離物之間，這是所期望的。賴氨酸這種必需氨基酸在谷類中含量低。油籽特別是卡諾拉的賴氨酸水平往往較高。截留液分析揭示出相當數(shù)量的賴氨酸，這將改善這種分離物的營養(yǎng)品質(zhì)(即使用于魚類或其它非人類飼料)。表5底部顯示，截留液分離物的必需氨基酸組成相當高?？傊?，分析結(jié)果顯示截留液C500是一種質(zhì)量氨基酸組成在C200和C300之間的分離物。這種分離物的非蛋白質(zhì)水平低，而臺式研究顯示鹽類、酚類物質(zhì)和其它未知物質(zhì)通過超濾除去。如臺式浸提資料所示，滲濾和透析可改善非蛋白質(zhì)的去除。然而，如I02結(jié)果所示，這不是生產(chǎn)分離物所必需的。
公開內(nèi)容的總結(jié)現(xiàn)總結(jié)本公開內(nèi)容如下本發(fā)明提供制備具有多種用途(包括在水產(chǎn)養(yǎng)殖中)的卡諾拉油籽分離蛋白的新方法。在本發(fā)明的范圍內(nèi)可能有各種修改方案。
表1aC500樣品，UF DF FD，Lab#21,681，03/12/17-19
表1bC500樣品，Lab#21,681，HPLC-SEC結(jié)果
表1cC500樣品，1％W/V Lab#21,681
n.d.＝未測，UF＝超濾，DF＝滲濾，F(xiàn)D＝凍干，AU＝吸光度單位球蛋白＝＞12S+12S+7S+亞單位表2aC500樣品，BW-AL022-I02-03A#1SD，Lab#20,576，03/12/19
表2bC500樣品，Lab#20,576，HPLC-SEC結(jié)果
表2cC500樣品，1％W/V Lab#20,576
n.d.＝未測，UF＝超濾，DF＝滲濾，SD＝噴霧干燥，AU＝吸光度單位球蛋白＝＞12S+12S+7S+亞單位表3BW-AL022-I02-03A#1C500Lab#20,576，Dec.23/03實驗室外結(jié)果
1包括對鈉的氯化物的估計。
2鉛和鎘都在閾限之下。
表4A
注兩個樣品是分離蛋白，基于粗蛋白質(zhì)(Nx6.25)而不是氨基酸分析。氨基酸分析通常由于谷氨酰胺和天冬酰胺的脫氨作用導(dǎo)致?lián)p失一些氮。
表4B
e＝11必需氨基酸aa＝氨基酸*谷氨酸和天冬氨酸主要是脫氨的谷氨酰胺和天冬酰胺。
表5
Puratein是C200和C300的摻合物，接近C500的預(yù)期組成。
當前分析結(jié)果蘇氨酸和組氨酸稍微偏低，谷氨酸則輕稍微偏高。
總的來說，分析結(jié)果非常近似，在200和C300的典型分析結(jié)果之間。
表6硬骨魚對Burcon截留液的氨基酸需求(g/100g蛋白質(zhì))
1加拿大安大略省圭爾夫市圭爾夫大學(xué)動物和家禽科學(xué)系魚類營養(yǎng)研究實驗室D.P.Bureau & C.Y.Cho
權(quán)利要求
1.一種制備卡諾拉分離蛋白的方法，所述方法包括(a)浸提卡諾拉油籽粕，以導(dǎo)致所述卡諾拉油籽粕中的蛋白質(zhì)溶解，形成蛋白質(zhì)含量為約5至約40g/L和pH約5至約6.8的蛋白質(zhì)水溶液；(b)使蛋白質(zhì)水溶液與殘余卡諾拉油籽粕分離；(c)使用選擇性膜技術(shù)，將所述蛋白質(zhì)水溶液的蛋白質(zhì)濃度提高到至少約50g/L，同時保持離子強度基本不變，以提供濃縮蛋白質(zhì)溶液；(d)將濃縮蛋白質(zhì)溶液干燥，以提供以干重計蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(Nx6.25)的卡諾拉分離蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)含量為至少約100wt％(Nx6.25)d.b.。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述卡諾拉分離蛋白的卡諾拉蛋白質(zhì)分布為約25至約55wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)，約45至約75wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)和約0至約15wt％的12S卡諾拉蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述卡諾拉分離蛋白的卡諾拉蛋白質(zhì)分布為約40至約50wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)，約50至約60wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)和約1至約5wt％的12S卡諾拉蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求1的方法，所述方法以分批模式進行，其中所述卡諾拉油籽粕的所述浸提通過在至少約5℃溫度下使用離子強度為至少約0.05和pH約5至約6.8的鹽水溶液實現(xiàn)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述鹽溶液離子強度為約0.1至約0.6。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述鹽溶液pH約5.3至約6.2。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述卡諾拉油籽粕的所述浸提通過攪拌鹽水溶液約10至約30分鐘來實現(xiàn)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中在浸提步驟中卡諾拉油籽粕在所述鹽水溶液中的濃度為約5至約15wt％。
10.權(quán)利要求5的方法，其中所述浸提步驟所得的所述蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)濃度為約10至約30g/L。
11.權(quán)利要求5的方法，其中所述鹽水溶液含有抗氧化劑。
12.權(quán)利要求1的方法，所述方法以連續(xù)方式實現(xiàn)，其中所述浸提步驟如下實現(xiàn)(i)在約5°至約65℃溫度下將所述卡諾拉油籽粕與離子強度至少約0.5和pH約5至約6.8的鹽水溶液連續(xù)混合，(ii)在最高約10分鐘的時間內(nèi)通過管道連續(xù)輸送所述混合物，同時使蛋白質(zhì)從卡諾拉油籽粕中浸提出來，形成蛋白質(zhì)含量為約5至約40g/L的蛋白質(zhì)水溶液。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述鹽溶液離子強度為約0.1至約0.8。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述鹽溶液pH為約5.3至約6.2。
15.權(quán)利要求12的方法，其中在所述混合步驟中油籽粕在所述鹽水溶液中的濃度為約5至約15w/v％。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述溫度為至少約35℃。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述蛋白質(zhì)水溶液的蛋白質(zhì)含量為約10至約30g/L。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述鹽水溶液含有抗氧化劑。
19.權(quán)利要求1的方法，其中在所述使蛋白質(zhì)水溶液與殘余卡諾拉油籽粕分離之后，對蛋白質(zhì)水溶液進行色素去除步驟。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述色素去除步驟通過對蛋白質(zhì)水溶液進行滲濾來實現(xiàn)。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述色素去除步驟通過將色素吸附劑與蛋白質(zhì)水溶液混合，隨后從蛋白質(zhì)水溶液中除去色素吸附劑來實現(xiàn)。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述色素吸附劑是粉狀活性炭。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述油籽粕用水浸提，隨后向所得蛋白質(zhì)水溶液中加入鹽，以提供離子強度為至少約0.05的蛋白質(zhì)水溶液。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述濃縮步驟通過超濾實現(xiàn)，以產(chǎn)生蛋白質(zhì)含量為至少約200g/L的濃縮蛋白質(zhì)溶液。
25.權(quán)利要求1的方法，其中使用離子強度與浸提步驟相同的鹽水溶液對所述濃縮蛋白質(zhì)溶液進行滲濾。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述滲濾通過使用約2至約20體積的滲濾溶液實現(xiàn)。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述滲濾通過使用約5至約10體積的滲濾溶液實現(xiàn)。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述至少部分滲濾步驟在抗氧化劑的存在下實現(xiàn)。
29.權(quán)利要求1的方法，其中對所述濃縮蛋白質(zhì)溶液進行色素去除步驟。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述色素去除步驟通過使用顆粒狀活性炭或聚乙烯吡咯烷酮來實現(xiàn)。
31.權(quán)利要求1的方法，其中對所述濃縮蛋白質(zhì)溶液進行巴氏滅菌步驟。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述巴氏滅菌步驟通過將濃縮蛋白質(zhì)溶液加熱至約55°至約70℃的溫度，保持約10至約15分鐘來實現(xiàn)。
33.權(quán)利要求1的方法，所述方法包括將干燥的卡諾拉分離蛋白配制成用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料組合物。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述飼料組合物配制成用于飼養(yǎng)鮭科魚類。
35.一種用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料組合物，所述飼料組合物包含通過權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)的卡諾拉分離蛋白。
36.權(quán)利要求35的飼料組合物，其中所述飼料組合物配制成用于飼養(yǎng)鮭科魚類。
37.一種用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料組合物，所述飼料組合物包含卡諾拉分離蛋白，所述卡諾拉分離蛋白的蛋白質(zhì)含量為至少約90％，且卡諾拉蛋白質(zhì)分布為約25至約55wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)、約45至約75wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)和約0至約15wt％的12S卡諾拉蛋白質(zhì)。
38.權(quán)利要求37的飼料組合物，其中所述卡諾拉蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)含量為至少約100％，且卡諾拉蛋白質(zhì)分布為約40至約50wt％的2S卡諾拉蛋白質(zhì)，約50至約60wt％的7S卡諾拉蛋白質(zhì)和約1至約5wt％的12S卡諾拉蛋白質(zhì)。
39.權(quán)利要求37的飼料組合物，所述飼料組合物配制成用于飼養(yǎng)鮭科魚類。
全文摘要
一種通過以下程序制得的用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的卡諾拉分離蛋白浸提卡諾拉油籽粕，以導(dǎo)致所述卡諾拉油籽粕中的蛋白質(zhì)溶解，形成蛋白質(zhì)含量為約5至約40g/L和pH約5至約6.8的蛋白質(zhì)水溶液。使蛋白質(zhì)水溶液與殘余卡諾拉油籽粕分離后，使用選擇性膜技術(shù)，將所述蛋白質(zhì)水溶液的蛋白質(zhì)濃度提高至至少約50g/L，同時保持離子強度基本不變。干燥濃縮蛋白質(zhì)溶液，以提供蛋白質(zhì)含量為至少約90wt％(Nx6.25)d.b.的卡諾拉分離蛋白。
文檔編號C07K14/415GK1976595SQ200580011523
公開日2007年6月6日 申請日期2005年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月17日
發(fā)明者M·施維策爾, B·E·格林, R·維拉森 申請人:伯康營養(yǎng)科學(xué)(Mb)公司