專利名稱：益母草核糖體失活蛋白基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是涉及一種來自于中藥植物益母草的具有核糖體失活活性的抗真菌蛋白基因。
背景技術：
中藥是我國醫(yī)藥中獨具特色的重要組成部分。隨著醫(yī)藥市場的持續(xù)增長，植物藥市場的規(guī)模在快速增長，加之當今疾病譜和醫(yī)療模式的根本性變化，以及對化學藥物毒副作用認識的加深，人們保健意識增強，中醫(yī)藥已被越來越多的國家所認同，各國競相應用現(xiàn)代科技手段從傳統(tǒng)藥材中尋找新藥或藥物先導化合物。世界各國對植物藥的研究開發(fā)，必將形成全球的一個新的經(jīng)濟增長點(肖培根，2000)。然而，目前對于中藥的研究還主要停留在復方或復合成分上，對于藥用植物的有效成分研究不多，僅有青蒿素等少數(shù)單一有效成分得到深入研究和開發(fā)。
真菌病害是作物減產和品質下降的主要原因之一?；蚬こ虨橹参锟拐婢N提供了新途徑。植物界大量存在具有離體抑制真菌生長增殖能力的蛋白質，相應基因在轉基因植株中表達，可使這些植株具有抗真菌能力。核糖體失活蛋白(Ribosome-inativatingproteins，RIPs)就是其中之一。核糖體滅活蛋白，即rRNA N-糖苷酶(rRNA N-glycosidases，EC3.2.2.22)是一類蛋白毒素，廣泛存在與植物王國，有人推測它甚至可能存在于所有的植物中，只是含量相去甚遠，并在真菌和細菌中也有發(fā)現(xiàn)。它作用于真核細胞的核糖體，通過水解核糖體RNA上特異位點結合的堿基，抑制靶細胞的蛋自質合成，從而使核糖體失活。RIP不滅活自身的核糖體，卻能特異作用于親緣關系較遠的種類。人們普遍認為，植物核糖體失活蛋白的生理功能是起防御作用——抵抗病蟲害或者惡劣的環(huán)境。在應用上，這類具有選擇毒性的蛋白質的應用研究包括增強植物抗病性，同時，利用核糖體失活蛋白構造的免疫毒素在治療癌癥方面有廣闊的前景。
將藥用植物的有效成分研究與植物抗真菌基因工程育種相結合，將大大拓展中藥材植物這一寶貴資源的發(fā)掘與利用。但類似研究尚未見報道。
益母草是我國的一種傳統(tǒng)藥用植物，屬于唇形科(Labiatae)益母草屬(Leonurus)，以全草(包括種子)入藥，具有抗菌抗腫瘤作用及活血調經(jīng)、利尿消腫之功效。植物在生長發(fā)育過程中，面臨著各種病原微生物的侵染，但研究發(fā)現(xiàn)益母草卻很少感病，特別是在種子階段，多數(shù)種子在貯藏和萌發(fā)過程中基本不會感染病原菌。雖然國內外對核糖體失活蛋白的研究較多，但是，到目前為止，尚無對益母草核糖體失活蛋白基因的研究報道。
發(fā)明內容
本發(fā)明將藥用植物的有效成分研究與植物抗真菌基因工程育種相結合，其目的在于提供一種來自于中藥植物益母草的具有核糖體失活活性的抗真菌蛋白基因。該蛋白對絲狀真菌有明顯的抑制作用，能使酵母、真菌等微生物核糖體失去翻譯蛋白質的功能，在醫(yī)藥、植物抗病育種等方面有廣闊的應用價值。
本發(fā)明申請人通過對益母草種子抗真菌蛋白的提取與純化，得到一種具有核糖體失活蛋白活性的抗真菌蛋白Leonurin，進而進行了Leonurin的基因克隆。具體方法如下(1)蛋白質純化將益母草種子粉碎后，用10mM磷酸緩沖液(pH＝6.0，內含1mMEDTA，1mM Leupeptin 10mM硫脲)提取，提取液經(jīng)75％硫酸銨沉淀，85℃變性10min處理，離心(12000rpm，15min)后的上清液經(jīng)過SP Sepharose HP陽離子交換層析，收集有抗真菌活性的部分，再經(jīng)C8反相HPLC和C18反相HPLC層析，得到單一的具有核糖體失活蛋白活性的抗真菌蛋白Leonurin；(2)Leonurin的N-端測序純化的Leonurin經(jīng)電泳轉移到PVDF膜后，由湖南省生物研究所蛋白質化學研究室進行N-端測序，所測N端序列為pqsqtveecceslkdi；(3)Leonurin基因3’末端的擴增根據(jù)Leonurin的N-端氨基酸序列測定結果，設計一條簡并引物5’-ccgcagtcgcagac(atcg)gt(atcg)ga(ag)-3’，采用TaKaRa公司的3’-RACE試劑盒擴增Leonurin的3’端序列，擴增片段克隆到pUCm-T(上海Sangon)載體上，序列測定(上海Sangon)表明，擴增的片段為編碼Leonurin的部分cDNA基因，包含了成熟蛋白的所有編碼序列；(4)Leonurin全長cDNA基因的獲得根據(jù)3’-RACE擴增的編碼序列設計引物，利用YADE擴增Leonurin成熟蛋白編碼序列的5’端序列，擴增片段克隆到pUCm-T(上海Sangon)載體上，然后進行序列測定(上海Sangon)與拼接，從而獲得Leonurin的全長cDNA基因。
(5)序列同源性分析相似性比較在NCBI站點上用BLAST完成，BLAST分析表明，Leonurin與napin類蛋白有一定的序列相似性，而napin類蛋白多為儲藏蛋白，但Leonurin具有抗真菌活性和核糖體失活蛋白活性，因此，Leonurin是一個新的具有核糖體失活蛋白活性的抗真菌蛋白，Leonurin基因是一個新基因。
上述方法獲得的Leonurin全長cDNA基因及其推斷的氨基酸序列如下ctctccttgtggcgctggtggctgtaggcggagccaccaccttcaccaccaccgtcaccaccacttcattcgacgtcgacgacacccagcgatcccaatgcagtcaa ATG CTG CAG GGT CGC CAG TTC CGC TCC TGC CAA AGC TACM L Q G R Q F R S C Q S YCTT AGG CAG CGT GGG AAT GTT CTA GAA ATG GCC ACC GGA AAC CCT CAG TCG CAG ACG GTTL R Q R G N V L E M A T G N P Q S Q T VGAA GAA TGC TGC GAG AGT CTG AAG GAT ATT GAG CGG AAA CAG CAG CAA TGC GGG TGT GAAE E C C E S L K D I E R K Q Q Q C G C EGCC ATC AAG CAC GCG ATG AGG CAG ATG CAG GGG GGG CAG AGC GAG GAG GTG TAT CGA AAGA I K H A M R Q M Q G G Q S E E V Y R KGCT AGG ATG CTG CCA CGT ACT TGC GGA TTA AGG TCA CAG CAA TGC CAG TTT AAT GTT ATCA R M L P R T C G L R S Q Q C Q F N V I
TTT GTG TAG atgattaaggcctatcggccttaatttgtaataaagctgaggaaataaacgagctagtgatcacttcF VAtgatcactatgttttttgtgcgtggttccaaataaaaaaaaaaaaaaaaggatccggtacctctagatcag本發(fā)明的優(yōu)點是(1)由于Leonurin基因來源于常用中藥—益母草，而該種植物以全株(包括種子)入藥，因此所獲得的具有核糖體失活蛋白活性的抗真菌蛋白Leonurin對人畜及植物安全無害；(2)抑菌實驗及分析試驗表明，Leonurin不僅具有核糖體失活蛋白活性，還具有抗真菌作用Leonurin抑制酵母核糖體和鼠肝核糖體翻譯蛋白質活性的IC50分別為20ng和35ng；15mg/ml的Leonurin對假絲酵母、黑曲霉、茄類鐮孢菌、棉花枯萎病菌等真菌具有抑制作用。因此，該基因通過轉基因的手段，使之在植物中高豐度表達，不僅僅可用于植物抗病的基因工程育種，而且其表達產物經(jīng)純化后具有抗菌抗腫瘤、治療癌癥等藥用價值。
具體實施例方式實施例將益母草種子粉碎后，用10mM磷酸緩沖液(pH＝6.0，內含1mMEDTA，1mM Leupeptin10mM硫脲)提取，提取液經(jīng)75％硫酸銨沉淀，85℃變性10min處理，離心(12000rpm，15min)后的上清液經(jīng)過SP Sepharose HP陽離子交換層析，收集有抗真菌活性的部分，再經(jīng)C8反相HPLC和C18反相HPLC層析，得到單一的具有核糖體失活蛋白活性的抗真菌蛋白Leonurin；純化后的Leonurin經(jīng)電泳轉移到PVDF膜，由湖南省生物研究所蛋白質化學研究室進行N-端測序，所測N端序列為pqsqtveecceslkdi；根據(jù)Leonurin的N-端氨基酸序列測定結果，設計一條簡并引物5’-ccgcagtcgcagac(atcg)gt(atcg)ga(ag)-3’，采用TaKaRa公司的3’-RACE試劑盒擴增Leonurin的3’端序列，克隆到pUCm-T(上海Sangon)載體上，序列測定(上海Sangon)表明，擴增的片段為編碼Leonurin的部分cDNA基因，包含了成熟蛋白的所有編碼序列；根據(jù)3’-RACE擴增的編碼序列設計引物，利用YADE擴增Leonurin成熟蛋白編碼序列的5’端序列，擴增片段克隆到pUCm-T(上海Sangon)載體上，然后進行序列測定(上海Sangon)與拼接，從而獲得Leonurin的全長cDNA基因；在NCBI站點上用BLAST完成序列同源性分析，表明Leonurin基因是一個新基因。
權利要求
1.一種益母草核糖體失活蛋白基因，其特征在于具有如下的基因序列ctctccttgt ggcgctggtg gctgtaggcg gagccaccac cttcaccacc accgtcacca60ccacttcatt cgacgtcgac gacacccagc gatcccaatg cagtcaaatg ctgcagggtc120gccagttccg ctcctgccaa agctacctta ggcagcgtgg gaatgttcta gaaatggcca180ccggaaaccc tcagtcgcag acggttgaag aatgctgcga gagtctgaag gatattgagc240ggaaacagca gcaatgcggg tgtgaagcca tcaagcacgc gatgaggcag atgcaggggg300ggcagagcga ggaggtgtat cgaaaggcta ggatgctgcc acgtacttgc ggattaaggt360cacagcaatg ccagtttaat gttatctttg tgtagatgat taaggcctat cggccttaat420ttgtaataaa gctgaggaaa taaacgagct agtgatcact tcatgatcac tatgtttttt480gtgcgtggtt ccaaataaaa aaaaaaaaaa aaggatccgg tacctctaga tcag 534
2.一種益母草核糖體失活蛋白基因編碼的蛋白質，其特征在于該蛋白質具有如下的氨基酸序列Met Leu Gln Gly Arg Gln Phe Arg Ser Cys Gln Ser Tyr Leu Arg1 5 10 15Gln Arg Gly Asn Val Leu Glu Met Ala Thr Gly Asn Pro Gln Ser20 25 30Gln Thr Val Glu Glu Cys Cys Glu Ser Leu Lys Asp Ile Glu Arg35 40 45Lys Gln Gln Gln Cys Gly Cys Glu Ala Ile Lys His Ala Met Arg50 55 60Gln Met Gln Gly Gly Gln Ser Glu Glu Val Tyr Arg Lys Ala Arg65 70 75Met Leu Pro Arg Thr Cys Gly Leu Arg Ser Gln Gln Cys Gln Phe80 85 90Asn Val Ile Phe Val9全文摘要
一種益母草核糖體失活蛋白基因，通過對益母草種子抗真菌蛋白的提取與純化，得到具有核糖體失活蛋白活性的抗真菌蛋白Leonurin，并經(jīng)一系列生物技術克隆得到。本發(fā)明將藥用植物的有效成分研究與植物抗真菌基因工程育種相結合，抑菌實驗及分析試驗表明，Leonurin不僅具有核糖體失活蛋白活性，還具有抗真菌作用。因此，該基因通過轉基因的手段，使之在植物中高豐度表達，不僅僅可用于植物抗病的基因工程育種，而且其表達產物經(jīng)純化后具有抗菌抗腫瘤、治療癌癥等藥用價值。
文檔編號C07K14/415GK1563381SQ20041003077
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月9日 優(yōu)先權日2004年4月9日
發(fā)明者楊星勇, 肖月華, 裴炎 申請人:西南農業(yè)大學