用于治療癌癥的抗新血管系統(tǒng)制劑的制作方法

專利名稱：用于治療癌癥的抗新血管系統(tǒng)制劑的制作方法
背景技術(shù)：
相關(guān)領(lǐng)域的描述盡管生物醫(yī)學有了很大進步，但是癌癥的治療仍然頗具挑戰(zhàn)性。近年來，已描述了兩種極具前景的治療方法治療性疫苗和抗血管生成。
治療性疫苗基于對癌組織的觀察，所述癌組織通常表達某些抗原，總起來說優(yōu)選腫瘤相關(guān)抗原(TuAA)。TuAA包括通常由癌癥起源的組織選擇性表達的蛋白質(zhì)(分化抗原)，與癌癥的不同發(fā)展階段有關(guān)的蛋白質(zhì)(胎性癌和睪丸癌(cancer-testis)抗原)，由畸變?nèi)旧w重排產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或者來源于致癌病毒的蛋白質(zhì)。然后將這些TuAA，或其片段用作疫苗中的免疫原，以刺激細胞免疫殺滅腫瘤細胞，特別是細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的細胞免疫。
抗血管生成方法利用腫瘤需要補充血液供給以維持其持續(xù)生長。為此，腫瘤會分泌能促進新血管生長的血管生成因子。這種抗血管生成方法的目的是破壞腫瘤的養(yǎng)分提供，使其死亡，或至少限制其生長。對這種方法的研究已經(jīng)找到了可直接針對各種抗血管生成因子以及血管生成的化學治療藥物。
發(fā)明概述此處公開的本發(fā)明涉及設(shè)計用于刺激靶向腫瘤相關(guān)新血管系統(tǒng)(TuNV)的細胞免疫應答的組合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，該組合物刺激CTL反應。這種組合物可含有一個或多個靶抗原的表位。這個實施方案的一個方面具體地含有一個管家表位，另外具體地含有一個免疫表位或表位簇，另一個方面具體地結(jié)合管家表位和免疫表位。
本發(fā)明的實施方案涉及利用前列腺特異性膜抗原(PSMA)作為該組合物的靶抗原。該實施方案的各個方面包括來源于PSMA的各種表位，這些表位直接以多肽形式，或以一種能夠表達表位的核酸形式存在。其它的實施方案涉及其它TuNV相關(guān)抗原的利用。
在本發(fā)明的其它實施方案中，通過將兩種來源的免疫原組合為單一制劑或方法或治療，組合物直接靶向由癌細胞表達的TuNV和TuAA。
將免疫的T細胞繼承轉(zhuǎn)移到SCID小鼠中，可以實現(xiàn)對本發(fā)明組合物的臨床前評估，所述小鼠體內(nèi)帶有形成自移植的人皮膚微血管內(nèi)皮細胞(HDMEC)的微血管系統(tǒng)。還可以通過組合物免疫的HLA轉(zhuǎn)基因小鼠實現(xiàn)臨床前的評估，所述組合物由小鼠和人之間保守的表位組成。
本發(fā)明的實施方案涉及評價細胞介導的免疫的方法。該方法可包括下述步驟將血管細胞移植到免疫缺陷的哺乳動物體內(nèi)；在該哺乳動物體內(nèi)形成免疫應答；并測定特征以確定該哺乳動物體內(nèi)的細胞介導的免疫。例如，該細胞介導的免疫可以直接靶向新血管系統(tǒng)抗原。該新血管系統(tǒng)抗原可以被腫瘤相關(guān)的新血管系統(tǒng)優(yōu)先地表達，例如，在優(yōu)選的實施方案中可以是前列腺特異性膜抗原(PSMA)，血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)等等。這個建立的步驟可例如，通過將T細胞繼承轉(zhuǎn)移到哺乳動物體內(nèi)，通過用抗原接觸該哺乳動物等方式完成。該細胞介導的免疫可由細胞毒性T淋巴細胞介導。血管細胞可以是血管內(nèi)皮細胞，如人皮膚微血管內(nèi)皮細胞(HDMEC)，端粒酶轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細胞，等等。免疫缺陷的哺乳動物可以是小鼠，如SCID小鼠。表征步驟可包括評定參數(shù)，如血管形成，血管破壞，血管密度，輸送宿主哺乳動物血液的血管比例等等。
該方法還可進一步包括將腫瘤細胞或腫瘤組織移植到小鼠體內(nèi)的步驟。該表征步驟可包括評定參數(shù)，如腫瘤的存在，腫瘤生長，腫瘤大小，腫瘤出現(xiàn)的速度，抑制或防止腫瘤形成所需要的疫苗劑量，腫瘤血管形成，在腫瘤中壞死組織的比例等等。
該方法可進一步包括提供哺乳動物第一群體和哺乳動物第二群體的步驟；在第一群體中形成細胞介導的免疫；在第二群體形成不同的細胞介導的免疫；并且將獲自哺乳動物第一群體的結(jié)果與獲自哺乳動物第二群體的結(jié)果相比較。第一群體細胞介導的免疫可包括如原初免疫和對無關(guān)表位的免疫等等。
其它實施方案涉及評價細胞介導的免疫的方法，包括針對新血管系統(tǒng)抗原的免疫。該方法可包括以下步驟將MHC轉(zhuǎn)基因腫瘤細胞移植或注射到MHC轉(zhuǎn)基因哺乳動物中；在該哺乳動物體內(nèi)形成免疫應答；并測定特征以確定該哺乳動物體內(nèi)細胞介導的免疫。MHC轉(zhuǎn)基因哺乳動物可以是HLA轉(zhuǎn)基因哺乳動物，如HLA-A2轉(zhuǎn)基因哺乳動物。在優(yōu)選的實施方案中，該哺乳動物可以是小鼠?？赏ㄟ^接種疫苗形成細胞介導的免疫，在優(yōu)選的實施方案中，例如，可以在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移之前，其同時或其之后進行接種疫苗。在優(yōu)選的實施方案中，該細胞介導的免疫可由細胞毒性T淋巴細胞介導。新血管系統(tǒng)抗原可以被腫瘤相關(guān)新血管系統(tǒng)優(yōu)先地表達，該抗原也可以是腫瘤相關(guān)抗原。優(yōu)選地，該抗原可以是纖連蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域。該表征步驟可以包括，例如評價參數(shù)，包括腫瘤的存在，腫瘤的生長，腫瘤的大小，腫瘤出現(xiàn)的速度，抑制或防止腫瘤形成所需要的疫苗劑量，腫瘤的血管化，該腫瘤內(nèi)部壞死組織的比例等等。該方法可以進一步包括以下步驟提供哺乳動物的第一群體和哺乳動物的第二群體；在第一群體內(nèi)形成細胞介導的免疫；在第二群體內(nèi)形成不同的細胞介導的免疫；并將獲自哺乳動物第一群體的結(jié)果與獲自哺乳動物第二群體的結(jié)果相比較。第一群體的細胞介導的免疫可包括原初免疫，對無關(guān)表位的免疫等等。
另外的實施方案涉及治療腫瘤疾病的方法，包括免疫哺乳動物以誘導針對抗原的細胞免疫應答的步驟，所述抗原由腫瘤相關(guān)的新血管系統(tǒng)差異(differentially)表達。差異表達的抗原可以是蛋白質(zhì)，如前列腺特異性膜抗原，血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)等等。在其它優(yōu)選的實施方案中，該抗原可以是纖連蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域。例如，可以用來源于該蛋白質(zhì)序列的至少一種肽進行免疫，或者用能夠表達該蛋白質(zhì)或肽的核酸進行免疫等。所述的至少一種肽可以包括管家表位，例如在優(yōu)選的實施方案中，可以是與所述管家表位共C末端的。這些方法還可包括至少一個額外的肽，其中所述至少一個額外的肽包括免疫表位。這些方法可包括一個額外的步驟，在其中哺乳動物用直接靶向癌細胞的抗腫瘤治療活性物質(zhì)進行處理。抗腫瘤治療可以是靶向腫瘤相關(guān)抗原的免疫。優(yōu)選地，該細胞免疫應答可以包括CTL反應。
其它實施方案涉及免疫原性的組合物。這些免疫原性組合物可以包括至少相應于一種抗原的一個免疫原，所述抗原由腫瘤相關(guān)新血管系統(tǒng)表達，其中組合物可以誘導細胞免疫應答。免疫原可以與受體同種細胞沒有聯(lián)系?？乖梢允堑鞍踪|(zhì)，如前列腺特異性膜抗原，血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)，等等。在其它優(yōu)選的實施方案中，抗原可以是纖連蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域。該免疫原可以包括至少一種肽。這些組合物可以包括一種能夠表達抗原的核酸，其中所述抗原是一種蛋白質(zhì)或一種肽。這些組合物可包括至少一種含有管家表位的肽，在優(yōu)選的實施方案中，所述的至少一種肽可以是與所述管家表位共C末端的。另外，這些組合物還可另外含有至少一種帶有一種免疫表位的肽。這些組合物可含有至少一種相應于腫瘤相關(guān)抗原的免疫原。在優(yōu)選的實施方案中，細胞免疫應答可以包括CTL反應。
實施方案涉及抗腫瘤疫苗的設(shè)計方法。該方法可含有以下步驟鑒定由腫瘤相關(guān)新血管系統(tǒng)差異表達的抗原；并將該抗原組分合并到一疫苗中。該組分可以包括例如該抗原的多肽片段，編碼該抗原或抗原片段的核酸等。
其它的實施方案涉及研究模型的制造方法。這些方法可包括將血管細胞和腫瘤細胞移植到免疫缺陷的哺乳動物中。腫瘤細胞和血管細胞可被移植成彼此靠近的位置。血管細胞可以是血管內(nèi)皮細胞，比如HDMEC。在優(yōu)選的實施方案中，血管內(nèi)皮細胞可被端粒酶轉(zhuǎn)化。免疫缺陷的哺乳動物可以是小鼠，如SCID小鼠。
其它實施方案涉及研究模型。這些研究模型可包括免疫缺陷的哺乳動物。該哺乳動物可含有移植的血管細胞和移植的腫瘤細胞。血管細胞和腫瘤細胞可被移植成彼此靠近的位置。
附圖簡述

圖1A，B和C顯示PSMA163-192蛋白酶消化在T＝60分鐘時間點等分試樣的N-末端池測序(pool sequencing)結(jié)果。
圖2顯示HLA-A2PSMA168-177和HLA-A2PSMA288-297與對照的結(jié)合曲線。
圖3顯示PSMA281-310蛋白酶消化在T＝60分鐘時間點等分試樣的N-末端池測序結(jié)果。
圖4顯示HLA-A2PSMA461-489，HLA-A2PSMA460-469，和HLA-A2PSMA663-671和對照的結(jié)合曲線。
圖5顯示檢測PSMA463-471反應性的HLA-A1+CD8+T細胞的基于γ-IFN的ELISPOT試驗的結(jié)果。
圖6顯示利用抗HLA-A1mAb阻斷T細胞的反應活性，說明HLA-A1的限制性識別，所述T細胞為圖10中所用的T細胞。
圖7顯示HLA-A2PSMA663-671和對照的結(jié)合曲線。
圖8顯示HLA-A2PSMA662-671和對照的結(jié)合曲線。
圖9顯示來自用ED-B 29-38肽免疫的HHD-A2小鼠的CTL表位特異性溶解作用。
優(yōu)選實施方案的詳細描述此處公開的本發(fā)明的實施方案提供了針對腫瘤的新血管系統(tǒng)的組合物，組合物或疫苗的設(shè)計方法，以及涉及產(chǎn)生細胞免疫應答，優(yōu)選T細胞應答，更優(yōu)選CTL應答的治療方法。這些方法以及組合物可特別用于治療及預防癌癥。其它實施方案涉及組合物評價模型。
組合物，組合物的設(shè)計，以及使用組合物進行治療本發(fā)明的實施方案涉及針對腫瘤新血管系統(tǒng)(TuNV)的免疫原性組合物，包括疫苗，用于產(chǎn)生細胞免疫應答，特別是T細胞應答和具體地，CTL應答。“腫瘤新血管系統(tǒng)”廣義地包括在腫瘤塊之中或其周圍發(fā)現(xiàn)的任何血管系統(tǒng)，維持腫瘤生長或腫瘤生長所必需的血管系統(tǒng)等等。應當指出，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，雖然本文的討論通常涉及腫瘤和腫瘤新血管系統(tǒng)，但本發(fā)明的實施方案還可被用于與不合適的血管生成相關(guān)的其它病情或疾病。
到目前為止，抗腫瘤疫苗的設(shè)計已經(jīng)集中于惡性細胞本身所表達的抗原。然而，較大的腫瘤是非常復雜的結(jié)構(gòu)，并不是簡單的細胞均質(zhì)體。所有的細胞，特別是快速生長的細胞，需要供給營養(yǎng)(氧，葡萄糖，氨基酸，等等)，以及除去代謝廢物的手段，以保持代謝的活性以及完整性。這通常是通過血液和淋巴流動通過各種身體器官而實現(xiàn)。在細胞水平上，身體的組織被一層精細的毛細血管-微小的血管網(wǎng)絡(luò)滲透，通過它們可以在細胞周圍通過擴散互相交換營養(yǎng)和廢物。擴散在相對較短的距離內(nèi)有效。毛細血管床分布十分廣泛，細胞通常都位于其附近，只有少數(shù)細胞遠離毛細血管。如果腫瘤僅僅通過其本身惡性細胞的繁殖而生長的話，那么不久，在腫塊內(nèi)部的那些細胞將不能維持其本身。實際上，未血管化的腫瘤內(nèi)部經(jīng)常含有壞死組織。因此，為了不受抑制地生長，腫瘤會分泌出能促進新血管向內(nèi)生長即TuNV的因子。由于TuNV會表達使其與其它組織區(qū)別開的抗原，就可以用針對TuNV的治療性組合物治療癌癥，而不是直接靶向癌細胞本身。適當?shù)腡uNV抗原可以包括，例如那些通常在新血管系統(tǒng)中表達或由TuNV優(yōu)先表達的抗原。
在本發(fā)明的一些實施方案中，組合物可含有例如表位肽或肽?？蓪⒚庖弑砦磺度氡砦淮睾偷鞍踪|(zhì)片段。管家表位可具備適當?shù)腃-末端。在本發(fā)明的其它實施方案中，例如，組合物可含有能夠在pAPC上表達這些表位的核酸。
在優(yōu)選的實施方案中，組合物可直接施用給接受治療的哺乳動物的淋巴系統(tǒng)。這可應用于多肽和基于核酸的組合物。這種類型的給藥方法以及相關(guān)技術(shù)已公開在美國專利申請?zhí)?9/380,534，其于1999年9月1日提交，以及于2001年2月2日提交的其部分連續(xù)申請；美國專利申請?zhí)?9/776,232，兩者的名稱為“A METHEOD OF INDUCING A CTLRESPONSE”。
在一個優(yōu)選的實施方案中，通過本發(fā)明組合物的作用破壞腫瘤中的血管，可以除去腫瘤中的所有細胞。然而，小的腫瘤，包括微小轉(zhuǎn)移瘤在內(nèi)，典型地是非血管化的。另外，已經(jīng)報道了有些未血管化的腫瘤，它們并非明顯地依賴通過滲透腫瘤塊的管道的血流(Maniotis A.J等，Am.J.Pathol.155739-752，1999)。因此，在其它實施方案中，這些組合物通常有效作為可能不會消除所有的癌細胞的腫瘤控制劑。因此，本發(fā)明提供各種手段用于消除腫瘤，控制腫瘤生長，減少腫瘤負荷，改善整體臨床狀況等等。在一些實施方案中，期望將該組合物與其它直接靶向癌細胞的治療相結(jié)合。另外，有證據(jù)說明腫瘤內(nèi)的血管系統(tǒng)本質(zhì)上可以是由內(nèi)皮細胞及癌細胞組成的嵌合體(Chang Y.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9714608-14613，200)。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，可在組合物治療過程后，給藥生物或化學治療劑。在特別優(yōu)選的實施方案中，治療可包括在給藥抗TuNV組合物的同時或之后，給藥抗TuAA的組合物。
如上所述，這些組合物適用的TuNV抗原可包括例如通常在新血管系統(tǒng)內(nèi)表達的或由TuNV優(yōu)先表達的那些抗原。發(fā)現(xiàn)TuAA的各種技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。這些的技術(shù)的實例包括但不限于示差雜交和扣除雜交，包括使用微矩陣；克隆表達；SAGE(基因表達連續(xù)分析)；SEREX(重組表達克隆抗原的血清學鑒定)；原位RT-PCI；免疫組織化學(如對于PSMA)；EST分析；各種利用大部分或部分，和/或顯微解剖的組織等等。這些以及其它方法的利用給予了本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒定靶細胞內(nèi)部包含的可能被用作免疫原性組合物的抗原的基因和基因產(chǎn)物所必需的技術(shù)。無論靶細胞是癌細胞還是內(nèi)皮細胞，這些即使都適用于發(fā)現(xiàn)TuAA?？勺屑殭z查任何被鑒定的抗原的表位，該表位可用于本發(fā)明的實施方案中。
構(gòu)成血管系統(tǒng)內(nèi)層的內(nèi)皮細胞可以表達管家蛋白酶體(housekeepingproteasomes)。因此，相應于管家蛋白酶體(即管家表位)的消化產(chǎn)物，靶向內(nèi)皮細胞的組合物可以由肽，或者能夠表達該肽的核酸組成。IFN-γ，其由免疫系統(tǒng)活化的細胞分泌，可以誘導免疫蛋白酶體在靶細胞中表達。通常，免疫蛋白酶體存在于專業(yè)抗原呈遞細胞(pAPC)中。因此，它可以有助于將免疫表位或表位簇包容在CTL誘導組合物中，以確保無論靶細胞處于什么位置，CTL都能識別靶細胞。這對于易于呈現(xiàn)抗原呈遞功能的內(nèi)皮細胞特別理想。這些概念在下述文件中被更完整地解釋2000年4月28日提交的美國專利申請?zhí)?9/560,465，2001年11月7日提交的申請?zhí)?0/005,905；和它的連續(xù)申請，2001年12月7日提交的美國申請?zhí)枺撸撸撸撸?，代理人記錄?attorney docket number)CTLIMM.21CP1C，每個名稱均為“EPITOPE SYNCHRONIZATION INANTIGEN PRESENTING CELLS”。
如上所述，免疫原性組合物，包括在優(yōu)選的實施方案中的疫苗，都可包括例如TuNV抗原和表位。這些表位可包括一個或多個管家表位和/或一個或多個免疫表位?？衫妹绹鴮＠暾?zhí)?9/561,074公開的方法鑒定用于組合物的特定表位，該申請名稱為“METHOD OF EPITOPEDISCOVERY”，申請日為2000年4月28日。例如，可將已知的或預測能夠結(jié)合某些MHC限制性元件的肽序列，與由蛋白酶消化產(chǎn)生的片段相比較，以鑒定具有共同C末端的肽。
可用于本發(fā)明實施方案的表位，包括ED-B和PSMA的表位的實例在下述文件中公開美國臨時專利申請?zhí)枺撸?，名稱為“EPITOPESEQUENCES”，代理人記錄號CTLIMM.027PR；與這個申請同日提交，2002年3月7日，以及兩個美國臨時專利申請，每個名稱為“EPITOPESEQUENCES”；申請?zhí)?0/282,211，2001年4月6日提交，以及60/337,017，于2001年11月7日提交。將這些申請的每一個全文并入本文作為參考。
PSMA是TuAA的一個實例，可在一些實施方案中作為靶物質(zhì)。PSMA在大多種腫瘤類型的新血管系統(tǒng)中表達，而不是由正常組織的血管內(nèi)皮表達(Chang S.M.等，Cancer Res.59(13)3192-8，1999；Clin CancerRes.102674-81，1999)。PSMA是一種膜抗原，同樣，可以用單克隆抗體(mAb)攻擊表達PSMA的TuNV。然而，mAb治療癌癥的效果已經(jīng)顯示，該方法比起初預期的要困難得多。而且，由于發(fā)現(xiàn)其它抗原與TuNV相關(guān)聯(lián)，很可能其中許多抗原會證實不在血管系統(tǒng)的表面表達，使得這些抗原難以受到mAb的攻擊。
另一方面，T細胞，尤其CTL，通過主要組織相容性復合體(MHC)限制的抗原呈遞過程來檢驗細胞內(nèi)部組分的表達。用于測定抗自身抗原的T細胞活化疫苗以及組合物的效率的參數(shù)十分精細。一些涉及合理的表位選擇的關(guān)鍵特性和參數(shù)公開在美國專利申請?zhí)?9/560,465，名稱“EPIIOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS”，于2001年4月28日提交；美國專利申請?zhí)?9/561,074，名稱“METHOD OF EPITOPEDISCOVERY”，于2001年4月28日提交；以及美國專利申請?zhí)?9/561,571，名稱為“EPITOPE CLUSTERS”，于2001年4月28日提交。促進表位同步化的DNA疫苗的設(shè)計特點公開在美國專利申請?zhí)?9/561,572，名稱為“EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATEDANTIGENS”，于2001年4月28日提交，以及美國臨時申請?zhí)?0/336,968，名稱為“EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATEDANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN”，于2001年11月7日提交。特別有效的疫苗運送方法公開在美國專利申請?zhí)?9/380,534，于1999年9月1日提交，以及其連續(xù)部分申請美國專利申請?zhí)?9/776,232，于2001年2月2日提交；兩者的名稱為“A METHOD OF INDUCING A CTLRESPONSE”。上述每一個參考文獻全文并入本文作為參考。
可用于實施方案的TuNV抗原的另一個例子是纖連蛋白，優(yōu)選ED-B結(jié)構(gòu)域。纖連蛋白經(jīng)受發(fā)育調(diào)節(jié)的選擇性的剪接(developmentallyregulated alternative splicing)，具有由單個外顯子編碼的ED-B結(jié)構(gòu)域，該外顯子主要是在胎性癌組織被使用。Matsuura，H.和S HakomoriProc.Natl.Acad.Sci.USA，826517-6521，1985；Carnemolla B等，J.Cell Biol.1081139-1148，1989；Loridon-Rosa B等，Cancer Res.501608-1612，1990；Nicolo，G.等，Cell Differ.Dev.32401-408，1990；Borsi，L.等，Exp.Cell Res.19998-105，1992；Dyama，F(xiàn).等，Cancer Res.532005-2011，1993；Mandel，U.等，APMIS 102695-702，1994；Farnoud，MR.等，Int.J.Cancer 6127-34，1995；Pujuguet，P.等，Am.J.Pathol.148579-592，1996；Gabler，U.等，Heart 75358-362，1996；Chevalier，X.Br.J.Rheumatol.35407-415，1996；Midulla，M.Cancer Res.60164-169，2000。
ED-B結(jié)構(gòu)域還在新血管系統(tǒng)的纖連蛋白中表達，Kaczmarek，J.等，Int.J.Cancer 5911-16，1994；Castellani，P.等，Int.J.Cancer59612-618，1994；Neri D等Nat.Biotech.151271-1275，1997；Karelina，T.V.和A.Z.Eisen Cancer Detect.Prev.22438-444，1998；Tarli，L.等，Blood 94192-198，1999；Castellani，P.等.ActaNeurochir.(Wien)142277-282，2000。作為胎性癌結(jié)構(gòu)域，除由TuNV表達之外，ED-B結(jié)構(gòu)域通常在腫瘤細胞表達的纖連蛋白中發(fā)現(xiàn)。所以，靶向ED-B結(jié)構(gòu)域的CTL-誘導組合物可顯示兩種作用機理引導腫瘤細胞水解，以及通過破壞TuNV而破壞腫瘤的血液供給。
應當指出，纖連蛋白ED-B結(jié)構(gòu)域的表達已經(jīng)在腫瘤相關(guān)的以及正常的新血管系統(tǒng)中被報道(Castellani P.等Int.J.Cancer 59612-618，1994)。因此，基于它的組合物，或類似表達的抗原，對與不適當?shù)难苌捎嘘P(guān)的其它疾病也是有效的。另外，由于CTL活性可以在停止給藥組合物后快速地下降，因此，對正常血管生成的干擾可達到最小。
其它免疫原性組合物的靶物質(zhì)包括生長因子受體，包括與血管細胞相關(guān)的那些受體。一個這樣的實例為血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)。美國專利申請?zhí)?,342,221，包括VEGF和VEGFR2的討論部分。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，與血管細胞有關(guān)的任何其它抗原或蛋白質(zhì)都可以作為該免疫原性組合物的靶物質(zhì)，包括目前已知的以及還有待于鑒定的那些物質(zhì)。
動物模型，制備模型的方法，以及組合物評價基于前述考慮設(shè)計的組合物對各種靶物質(zhì)都有效。然而，可在任何時候，但優(yōu)選在臨床試用前，簡易地進行附加的評價。例如可利用這種評價來進一步輔助組合物的設(shè)計。本發(fā)明的其它實施方案涉及評價免疫原性組合物的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用適于評價組合物的動物模型容易地評價本發(fā)明的組合物。例如按照以下的常規(guī)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以快速并高效地評價TuNV組合物。因此，使用本文描述的模型或根據(jù)本文的指導，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以幾乎不用實驗，即可評價任何針對任何TuNV抗原的TuNV組合物。此外的實施方案涉及動物研究模型的制備方法。其它實施方案涉及研究模型動物。以下更完整地闡明這些實施方案。
基于異體移植的人血管系統(tǒng)的模型一些實施方案涉及研究人微血管形成機理的模型體系。例如在一些實施方案中，該模型體系能夠用于在臨床使用前評價組合物。該模型包括將端粒酶轉(zhuǎn)化的人皮膚微血管內(nèi)皮細胞(HDMEC)皮下移植到SCID小鼠中，所述細胞混合了MATRIGEL(Becton Dickinson)。Yang.J等在Nature Biotech 19219-224，2001中描述了皮下移植端粒酶轉(zhuǎn)化的HCMEC。本發(fā)明組合物激活的T細胞可被繼承轉(zhuǎn)移，例如，移植到這種移植小鼠中，就可以評價T細胞破壞或防止這種人微血管形成的能力。在其它實施方案中，小鼠可被直接接種疫苗并進行評價。另外，在此外的實施方案中，通過用其它物種和物種匹配的端粒酶代替DMEC，和通過使用與那些下面描述的適于人體系的類似的試劑，該模型體系可進一步適當?shù)赜糜跍y試在非人物種中組合物功效。
優(yōu)選地，呈遞受試組合物表位的MHC的限制性元件被移植到小鼠中的HDMEC系分享。T細胞可來源于體外免疫的人T細胞，或通過免疫HLA-轉(zhuǎn)基因小鼠(本領(lǐng)域公知的程序和實施例公開在上述并入的專利申請中)獲得。使用HLA轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的T細胞可以在繼承轉(zhuǎn)移的T細胞和宿主之間形成匹配的遺傳背景，從而減少同種的或異種的反應可能性，該反應可能使對結(jié)果的解釋復雜化。然而，根據(jù)可購得的小鼠的品系，可能需要雜交育種，以獲得在相同的遺傳背景下HLA轉(zhuǎn)基因和SCID表型?；蛘?，可對供體T細胞(人或鼠)進行一輪或多輪體外刺激，以富集想要的群體或形成克隆，從而同樣避免不想要的反應活性。
體外免疫的方法在本領(lǐng)域是已知的，例如Stauss等Proc.Natl.Aced.Sci USA 897871-7875，1992；Salgaller等，Cancer Res.554972-4979，1995；Tsai等，J.lmmunoI.1581796-1802，1997；和Chung等，J.Immunother.22279-287，1999。無論在體內(nèi)或體外，一旦產(chǎn)生這種T細胞，就可用本發(fā)明的組合物和/或細胞因子(參見例如Kurokawa T等，Int.J.Cancer 91749-746，2001)或其它有絲分裂原進行刺激，通過體外擴增獲得足量的T細胞。這些T細胞可構(gòu)成能夠識別一個或多個表位的克隆或多克隆群體。在優(yōu)選的實施方案中，使用大約105-108細胞在小鼠中進行繼承轉(zhuǎn)移實驗。(參見例如Drobyski W.R.等，Blood 972506-2513，2001；Seeley B.M.等，Otolaryngol HeadNeck Surg.124436-441，2001；Kanwar，J.R.等，Cancer Res.611948-1956，2001)。克隆及其它更加富集的群體通常需要移植較少的細胞。
可在移植或形成HDMEC之前，與其同時或在其之后進行T細胞轉(zhuǎn)移?？杀辉u價以評估組合物效力的參數(shù)包括血管形成，血管密度的改變，輸送小鼠血液的能力(如Yang等人所述)等?？稍诙肆Ｃ皋D(zhuǎn)化的HDMEC移植后1星期，優(yōu)選在2星期之后，以及至少6星期進行評估；和在T細胞移植后，優(yōu)選1到3星期后，從一天到超過6星期進行評估。通常，評估可包括將接受與靶抗原反應的T細胞的小鼠與接受原初(包括假免疫(sham-immunized))、或無關(guān)表位反應性的T細胞的小鼠相比較。
通常，相關(guān)的抗原可由新血管系統(tǒng)表達，或由TuNV優(yōu)先表達。可用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)證實表達，包括免疫組織化學法和RT-PCR。例如可與HDMEC一起移植腫瘤細胞。這會導致抗原的誘導表達，所述抗原是由TuNV優(yōu)先表達的那些抗原。在一個實施例中，可通過以下完成將一塊腫瘤組織移植到含HDMEC的MATRIGEL移植物的附近位置，在該移植物位點注射腫瘤細胞，將含腫瘤細胞的MATRIGEL移植到含HDMEC的MATRIGEL移植物的附近位置，將腫瘤細胞和HDMEC都合并到同一MATRIGEL移植物中，也可利用其它適當?shù)姆椒▉硗瓿伞Ｕ缫陨系挠懻?，在一些實施方案中，腫瘤細胞與血管細胞一起移植。如此處理的動物能夠用作研究模型。另外可對該方法進行的改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
HLA-轉(zhuǎn)基因動物模型至于人和模型物種之間序列和/或表達框架中保守的抗原，HLA-轉(zhuǎn)基因品種允許另一個方法，即對模型動物接種疫苗，以抗同基因腫瘤。纖連蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域提供了這樣一個機會，因為它是血管生成的標記，并且在人和小鼠中都具有相同的氨基酸順序(Nilsson F.等CancerRes.61711-716，2001)。而且，已經(jīng)分離并增殖了來自HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠品系的自發(fā)性腫瘤組織。以上論述了表位的發(fā)現(xiàn)和選擇，以及組合物的設(shè)計和CTL誘導的組合物的運送。
腫瘤細胞系，Ml，來源于自發(fā)性唾液腺囊腺癌。Ml腫瘤細胞系及其用法已公開在美國臨時申請?zhí)枴?，代理人記錄號CTLIMM.028PR，與這個申請同日提交，2001年3月7日，名稱為“AN HLA-TRANSGENIC MURINETUMOR CELL LINE”。腫瘤細胞系可在S.Pascolo等人(J.Exp.Med.，1852043-2051，1997)的HHD-A2轉(zhuǎn)基因小鼠品系的個體中產(chǎn)生。這些小鼠表達單個單鏈I型分子，該分子包括人β2-微球蛋白，以及HLA-A2.1的α-1和α-2結(jié)構(gòu)域，與來源于鼠的I型分子H2Db相平衡。腫瘤塊可被移植到新的個體中，該腫瘤可以再生長，通常在1-3個星期之內(nèi)，從3mm體積塊成長為3cm。或者，腫瘤組織可被分散，腫瘤細胞在體外生長。收集后，可將腫瘤細胞皮下注射到頸或腹部(2.5×106細胞，連續(xù)3天)，導致在大約5-12星期內(nèi)，早期傳代細胞產(chǎn)生可見的腫瘤。在細胞變得更適應體外生長之后，單次注射1×106-1×107細胞，導致在10天內(nèi)引發(fā)可見的腫瘤。通常，原始的腫瘤一貫存在于唾液腺附近，但是繼發(fā)瘤也可在各種部位出現(xiàn)，包括腎，肺，肝，和腹肌。
為評價組合物的效力，可在形成腫瘤之前，與其同時或在其之后給藥組合物，這可根據(jù)該組合物預想的機理而定。對于傾向用某種減小腫瘤體積(debulking)的技術(shù)(如外科手術(shù))使用的治療組合物，同時給藥是合適的。在治療開始前建立的腫瘤越好，那么測試就越令人信服。
已描述了兩種用于試驗適用于人的組合物的動物評估模型。然而，獸醫(yī)組合物的申請與其類似，僅僅需要替換物種匹配的內(nèi)皮細胞，MHC，TuAA，等等。
下述實施例僅僅為說明目的，不應以任何方式將其視為對本發(fā)明范圍的限制。
實施例實施例1.
使用已被鑒定的抗原PSMA和此處公開的ED-B，進行臨床前的研究。研究的結(jié)果顯示了優(yōu)異的備選表位。參見下面的表9。
實施例1.1簇分析(PSMA163-192)在433A ABI肽合成儀上，利用標準固相F-moc化學合成肽，AFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDM，PSMA163-192，(SEQ ID NO.3)，其含有來自前列腺特異性膜抗原的Al表位簇，以及PSMA168-190(SEQ ID NO.4)。側(cè)鏈脫保護并與樹脂解離后，首先將肽溶于甲酸，然后稀釋到30％的乙酸中，在反相制備HPLC C4柱上進行層析，條件為線性AB梯度(5％B/min)，流速4ml/min，其中洗脫劑A為0.1％含水TFA，洗脫劑B為0.1％TFA的乙腈溶液。根據(jù)質(zhì)譜分析法判斷在16.642min的分餾物含有預期的肽，收集該分餾物并凍干。然后用蛋白酶體消化該肽并進行基本如上所述的質(zhì)譜分析。質(zhì)譜的主峰歸納在表1中。
表1.PSMA163-192質(zhì)量峰鑒定
黑體字序列對應于預測與MHC結(jié)合的肽，參見表2。
N末端池序列(pool sequence)分析用ABI 473A蛋白質(zhì)測序儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，將在蛋白酶消化1小時時的一個等分試樣進行N末端氨基酸序列分析?；跍y序循環(huán)(sequence cycle)，蛋白質(zhì)測序儀的重復產(chǎn)率，和在分析的序列中唯一的氨基酸的相對產(chǎn)率的考慮，來確定切割的位點和功效。也就是，如果(在分析序列中)唯一的殘基X僅僅在第n個循環(huán)出現(xiàn)，那么切割位點存在于在N末端方它前面的n-1個殘基。除幫助分辨在將質(zhì)量分配給序列過程中模糊的情況之外，這些數(shù)據(jù)還可提供比質(zhì)譜分析法更加可信的標記，指示各種片段的相對產(chǎn)率。
至于PSMA163-192(SEQ ID NO.3)，這種池測序可支持在V177之后的單一主要切割位點，以及幾個次要切割位點，特別是在V179之后。檢查圖1A-C的結(jié)果可揭示以下內(nèi)容第3個循環(huán)中的S，指示存在底物的氮末端。
第5個循環(huán)中的Q，指示存在底物的氮末端。
第1個循環(huán)中的N，指示V177后切割。
第3個循環(huán)中的N，指示V175后切割。注意表1中的176-192片段。
第5個循環(huán)中的T，指示V177后切割。
第1-第3個循環(huán)中的T，指示R181，A180和Y179后增加的常見切割。其中，僅最后一種情況與通過質(zhì)譜檢測的峰相對應；163-179和180-192，參見表1。其它缺失表示它們在比在質(zhì)譜中檢測的片段小的片段上。
第4，第8和第10個循環(huán)中的K，分別指示E183，Y179，和V177后切割，所有對應于通過質(zhì)譜觀測到的片段。參見表1。
第1和第3個循環(huán)中的A，分別指示存在底物的N末端，以及V177后切割。
第4和第8個循環(huán)中的P，指示存在底物的N末端。
第6和第10循環(huán)中的G，指示存在底物的N末端。
第7個循環(huán)中的M，指示存在底物的氮末端和/或F185后切割。
第15個循環(huán)中的M，指示V177后切割。。
第一個循環(huán)可以指示D191后切割，參見表1。
第4和第13個循環(huán)中的R，指示V177后切割。
第2和第11個循環(huán)中的R，指示V179后切割。
第2，第6和第13個循環(huán)中的V分別指示V175，M169后切割，以及存在底物的氮末端。注意表1中，在176和170開始的片段。
第1，第2和第14個循環(huán)中的Y分別指示V175，V177后切割，以及存在底物的氮末端。
第11和第12個循環(huán)中的L，分別指示V177后切割以及存在底物N的末端，是與其它數(shù)據(jù)最一致的解釋。與質(zhì)譜結(jié)果相比，我們發(fā)現(xiàn)在第2，第5和第9個循環(huán)中的L，分別與F186，E183或M169和Y179后切割相符。參見表1。
表位鑒定選擇出通過SYFPEITHI或NIH算法預測的能夠與HLA結(jié)合的具有8-10個氨基酸長序列的共C末端片段用于進一步分析。該方法的消化以及預測步驟可以任何順序進行。雖然本文描述的用于蛋白酶體消化的底物肽被具體地設(shè)計成含有預測的HLA-A1結(jié)合序列，但是，可事后檢測實際的消化產(chǎn)物對其它MHC分子的實際或預測的結(jié)合。選擇的結(jié)果示于表2。
表2.通過蛋白酶消化產(chǎn)生的片段預測HLA結(jié)合
未預測HLA-A*0201結(jié)合試驗使用改良的Stauss等方法，(Proc Nat Acad Sci USA 89(17)7871-5(1992))，測試備選表位PSMA168-177，GMPEGDLVYV(SEQ ID NO.6)與HLA-A2.1的結(jié)合。具體地，T2細胞，其能在表面表達無活性的(empty)或不穩(wěn)定的MHC分子，用Iscove’s改良的Dulbecco’s培養(yǎng)基(IMDM)洗滌T2細胞兩次，并在無血清的AIM-V培養(yǎng)基(LifeTechnologies，Inc.Rockville，MD)中過夜培養(yǎng)，所述AIM-V培養(yǎng)基補充有3μg/ml的人β2微球蛋白(Sigma，St.Louis，MO)，并以800，400，200，100，50，25，12.5，和6.25μg/ml的量向96孔平底培養(yǎng)板中加入肽，所述培養(yǎng)板中含有3×105細胞/200μl/孔。在分配到培養(yǎng)板之前，利用重復吹吸將肽與細胞混合(可將肽加入到單獨的孔中)，輕輕地晃動培養(yǎng)板2分鐘。在5％CO2保溫箱內(nèi)，37℃孵育。第二天，用不含血清的RPMI培養(yǎng)基洗滌兩次，除去未結(jié)合的肽，加入飽和量的抗I型HLA單克隆抗體，異硫氰酸熒光素(F1TC)-結(jié)合的抗HLA A2，A28(One LambdaCanoga Park CA)。4℃孵育30分鐘后，用補充有0.5％BSA，0.05％(w/v)疊氮化鈉，pH7.4-7.6(染色緩沖劑)的PBS洗滌細胞3次。(或者，可使用W6/32(Sigma)作為抗I型HLA單克隆抗體，用染色緩沖劑洗滌細胞，然后在4℃下，與異硫氰酸熒光素(F1TC)結(jié)合的山羊F(ab’)抗鼠-IgG(Sigma)一起孵育30分鐘，并如上所述洗滌3次)。用0.5ml染色緩沖劑重懸細胞。使用FACScan(Becton Dickinson，San Jose，CA)，通過流式細胞術(shù)分析由于與肽結(jié)合而穩(wěn)定化的表面HLA-A2.1分子。如果流式細胞術(shù)不能立即進行，可加入四分之一體積的2％多聚甲醛固定細胞并貯藏在4℃黑暗中。
如圖2所示，這個表位顯示即使在低于陽性對照肽濃度條件下，仍具有顯著的結(jié)合。在該試驗中以Melan-A肽作為對照(在本文中都以其作為對照)，ELAGIGILTV(SEQ ID NO106)，其實際上是天然序列(EAAGIGILTV；SEQID NO107)的變體，并在該試驗中顯示高的親合力affinity。已知的A2.1結(jié)合劑FLPSDYFPSV(HBV18-27SEQID NO107)也用作陽性對照。HLA-B44結(jié)合肽，AEMGKYSFY(SEQ ID NO109)，用作陰性對照。從陰性對照獲得的熒光類似于試驗中不使用肽的情況下所獲得的信號。陽性和陰性對照肽選自Current Protocols in Immunology的18.3.2頁的表18.3.1，John Wiley和Sons，紐約，1998。
實施例1.2簇分析(PSMA281-310)。
使用標準固相F-moc化學法，在433A ABI肽合成儀上合成另一個肽RGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMG，PSMA281-310(SEQID NO.18)，其含有一個來自前列腺特異性膜抗原的A1表位簇，和PSMA283-307(SEQ ID NO.19)。側(cè)鏈脫保護并與樹脂解離后，將含于ddH2O的肽在反相制備HPLC C18柱上進行層析，條件為線性AB梯度(5％B/min)，流速4ml/min，其中洗脫劑A為0.1％含水TFA，洗脫劑B為0.1％TFA的乙腈溶液。根據(jù)質(zhì)譜分析法判斷，在17.061分鐘時的分餾物含有預期的肽，收集該分餾物并凍干。然后用蛋白酶體消化該肽并進行基本如上所述的質(zhì)譜分析。質(zhì)譜的主峰歸納在表3中。
表3.PSMA281-310質(zhì)峰鑒定 黑體字序列相應于預測與MHC結(jié)合的肽，參見表4。
*僅就質(zhì)量而言，該峰還可以是296-310或288-303。
**僅就質(zhì)量而言，該峰還可以是298-307。HPLC和質(zhì)譜分析結(jié)合，顯示在一些后面時間點，該峰是兩個物種的混合物。
僅就質(zhì)量而言，該峰還可以是289-298。
僅就質(zhì)量而言，該峰還可以是281-295或294-306。
§僅就質(zhì)量而言，該峰還可以是297-303。
僅就質(zhì)量而言，該峰還可以是285-306。
#僅就質(zhì)量而言，該峰還可以是288-303。
這些交替的排布均不支持N末端池序列分析。
N末端池序列分析用ABI 473A蛋白質(zhì)測序儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，將在蛋白酶消化(參見以上實施例3部份3)1小時時的一個等分試樣進行N末端氨基酸序列分析?；跍y序循環(huán)，蛋白質(zhì)測序儀的重復產(chǎn)率，和在分析的序列中唯一的氨基酸的相對產(chǎn)率的考慮，來確定切割的位點和功效。也就是，如果(在分析序列中)唯一的殘基X僅僅在第n個循環(huán)出現(xiàn)，那么切割位點存在于在N末端方向它前面的n-1個殘基。除幫助分辨在將質(zhì)量分配給序列過程中模糊的情況之外，這些數(shù)據(jù)還可提供比質(zhì)譜分析法更加可信的標記，指示各種片段的相對產(chǎn)率。
關(guān)于PSMA281-320(SEQ ID NO.18)，該池測序支持在其它次要的切割位點中，V287和I297之后的兩個主要切割位點。檢查表3中的結(jié)果揭示了下述內(nèi)容在第4和第11循環(huán)中的S，分別指示V287后的切割和存在底物的N-末端。
在第8循環(huán)中的H，指示V287后的切割。與從10到11存在的高度的下降相對，在位置9和10峰高沒有下降，可提示在A286和E285后也有切割，而不是表示在測序反應中潛伏的峰。
在第2，第4和第7循環(huán)中的D，分別指示Y299，I297，和V294后的切割。這個最后的切割在表4中的所有片段或在以下注釋中的交替排布中末出現(xiàn)。
在第6循環(huán)中的Q，指示I297后的切割。
在第10和第12循環(huán)中的M，分別指示Y299和I297后的切割。
表位鑒定選擇出通過SYFPEITHI或NIH算法預測的能夠與HLA結(jié)合的具有8-10個氨基酸長序列的共C末端片段用于進一步分析。該方法的消化以及預測步驟可以任何順序進行。雖然本文描述的用于蛋白酶體消化的底物肽被具體地設(shè)計成含有預測的HLA-A1結(jié)合序列，但是，可事后檢測實際的消化產(chǎn)物對其它MHC分子的實際或預測的結(jié)合。選擇的結(jié)果示于表4。
表4.
通過蛋白酶產(chǎn)生的片段PSMA281-319預測與HLA的結(jié)合
末預測如表4所示，對表位實行可靠序列的N末端加成常常可產(chǎn)生有益的，甚至更好的表位，用于相同或不同的MHC限制元件。注意例如(G)LPSIPVHPI與HLA-A*0201的結(jié)合，其中通過依賴N末端修飾以產(chǎn)生用于HLA-B7，-B*5101，和Cw*0401的表位，10-mer可作用對幾種MHC類型有用的疫苗。
HLA-A*0201結(jié)合試驗
基本如上述實施例1.1所述，用PSMA288-297，GLPSIPVHPI，(SEQ ID NO.21)進行HLA-A*0201結(jié)合研究。如圖2所示，這個表位顯示即使在低于陽性對照肽濃度條件下，仍具有顯著的結(jié)合。
實施例1.3簇分析(PSMA454-481)如上所述，通過MPS合成另一個肽SSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHLTKEL，PSMA454-481(SEQ ID NO.28)(純度＞95％)，其含有一個來自前列腺特異性膜抗原的表位簇，并對其進行蛋白酶體消化和質(zhì)譜分析。質(zhì)譜的主峰歸納在表5中。
表5.PSMA454-481質(zhì)量峰鑒定
黑體字序列相應于預測與MHC結(jié)合的肽，參見表6。
*僅僅根據(jù)質(zhì)量，該峰可同樣地指定為肽455-472，然而認為僅N-末端氨基酸的蛋白酶去除不太可能。如果該結(jié)果重要，可通過N-末端測序解決。
**根據(jù)質(zhì)量，該片段還可能代表455-464。
表位鑒定選擇出通過SYFPEITHI或NIH算法預測的能夠與HLA結(jié)合的具有8-10個氨基酸長序列的共C末端片段用于進一步分析。該方法的消化以及預測步驟可以任何順序進行。雖然本文描述的用于蛋白酶體消化的底物肽被具體地設(shè)計成含有預測的HLA-A2.1結(jié)合序列，但是，可事后檢測實際的消化產(chǎn)物對其它MHC分子的實際或預測的結(jié)合。選擇的結(jié)果示于表6。
表6.通過蛋白酶體產(chǎn)生的片段預測HLA結(jié)合
未預測如表6所示，對表位實行可靠序列的N末端加成常?？僧a(chǎn)生有益的，甚至更好的表位，用于相同或不同的MHC限制元件。注意例如(L)RVDCTPLMY(SEQ ID NOS 35和(36))與HLA-B*2702/5的結(jié)合，其中10-mer具有真實的預測的解離半衰期，而共同C末端則沒有。另外，注意SIEGNYTLRV(SEQ ID NO 30)的情況，預測的HLA-A*0201表位，通過依賴于N末端修飾以產(chǎn)生表位，其可用作對HLA-B*5101有用的疫苗。
HLAA-A*0201結(jié)合試驗基本如以上實施例1.1所述，用PSMA460-469，YTLRVDCTPL，(SEQ ID NO.33)進行HLA-A*0201結(jié)合研究。如圖4所示，發(fā)現(xiàn)該表位與HLA-A2.1的結(jié)合程度類似已知的用作陽性對照的A2.1結(jié)合體FLPSDYFPSV(HBV18-27；SEQID NO.108)。另外，PSMA461-469(SEQ ID NO32)也差不多結(jié)合。
ELISPOT分析PSMA463-471(SEQ ID NO.35)通過在包被緩沖劑(35mM碳酸氫鈉，15mM碳酸鈉，pH9.5)中，用50μl/孔的4μg/ml鼠抗人IFN單克隆抗體在4℃過夜孵育，使捕獲抗體包被硝酸纖維素支持的微量滴定板的各孔。用PBS洗滌4次，每次5min，除去未結(jié)合的抗體。然后通過加入200μl/孔具有10％血清的RPMI培養(yǎng)基封閉膜上未結(jié)合的位點，并在室溫下孵育1hr。以1∶3連續(xù)稀釋抗原刺激的CD8+T細胞，并以100μl/孔的量，接種到微量滴定板各孔中，起始濃度為2×105細胞/孔。(在先的抗原刺激基本上如Scheibenbogen C等人的描寫，Int.J.Cancer 71932-936，1997；將其全文并入本文作為參考。)加入PSMA462-471(SEQ ID NO.36)和IL-2，使PSMA462-471終濃度為10μg/ml，而IL-2的終濃度為100U/ml，并將細胞培養(yǎng)在37℃，5％CO2，水飽和的大氣中，40小時。孵育后，用含有0.05％吐溫-20的PBS(PBS-吐溫)，以200μl/孔的量洗滌板6次。檢測抗體，以50μl/孔的量加入2g/ml生物素化的鼠抗人IFN單克隆抗體的PBS+10％胎牛血清溶液，在室溫下孵育板2小時。用200μl PBS-吐溫洗滌4次，除去未結(jié)合的檢測抗體。向每孔中加入100μl抗生物素蛋白結(jié)合的辣根過氧化酶(Pharmingen，San Diego，CA)，并在室溫下孵育1小時。用200μl PBS-吐溫洗滌6次除去未結(jié)合的酶。按下述制備底物將20mg 3-氨基-9-乙基coarbasole片劑溶解在2.5ml N，N-二甲基甲酰胺中，并將該溶液加入到47.5ml的0.05M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH5.0)中。在即將以100μl/孔的量分配底物之前，向底物溶液中加入25μl 30％的H2O2，并在室溫下孵育板。顯色后(通常15-30min)，用水洗滌該板，停止反應?？諝飧稍镌摪?，并使用立體顯微鏡計算斑點。
圖5顯示檢測PSMA463-471(SEQ ID NO.35)反應性的HLA-A1+CD8+T細胞，該細胞先前產(chǎn)生自HLA-A1+CD8+T細胞與自體樹突狀細胞及肽的培養(yǎng)物。在無肽的培養(yǎng)物中未檢測到反應性(數(shù)據(jù)未顯示)。在該情況下，可見該肽反應性的T細胞以2.2×104中有1個-6.7×104中有1個之間的頻率存在于培養(yǎng)物中?？笻LA-A1單克隆抗體阻斷-IFN產(chǎn)生的能力已經(jīng)確實地證明這的確是HLA-A1-限制的反應；參見圖6。
實施例1.4簇分析(PSMA653-687)用MPS合成另外的肽，F(xiàn)DKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYPSMA653-687(SEQ ID NO.37)(純度＞95％)，其含有來自前列腺特異性膜抗原的A2表位簇，以及PSMA660-681(SEQ ID NO 38)，并如上所述進行蛋白酶體消化和質(zhì)譜分析。質(zhì)譜的主峰歸納在表7中。
表7.PSMA653-687質(zhì)量峰鑒定
黑體字序列相應于預測與MHC結(jié)合的肽，參見表7。
*僅僅根據(jù)質(zhì)量，該峰可同樣地指定為在654起始的肽，然而認為僅N-末端氨基酸的蛋白酶去除不太可能。如果該問題重要，可通過N-末端測序解決。
**僅僅根據(jù)質(zhì)量，這些峰可能已被分配給內(nèi)部片段，但是根據(jù)消化的總圖譜來看，不太可能。
表位鑒定選擇出通過SYFPEITHI或NIH算法預測的能夠與HLA結(jié)合的具有8-10個氨基酸長序列的共C末端片段用于進一步分析。該方法的消化以及預測步驟可以任何順序進行。雖然本文描述的用于蛋白酶體消化的底物肽被具體地設(shè)計成含有預測的HLA-A2.1結(jié)合序列，但是，可事后檢測實際的消化產(chǎn)物對其它MHC分子的實際或預測的結(jié)合。選擇的結(jié)果示于表8。
表8.通過蛋白酶體產(chǎn)生的片段預測HLA結(jié)合
未預測如表8所示，對表位實行可靠序列的N末端加成常?？僧a(chǎn)生有益的，甚至更好的表位，用于相同或不同的MHC限制元件。注意例如(R)MMNDQLMFL(SEQ ID NOS.39和(40))與HLA-A*02的結(jié)合，其中10-mer保持了真實的預期結(jié)合潛力。
HLA-A*0201結(jié)合試驗基本如實施例1.1所述，用PSMA663-671(SEQ ID NO39)和PSMA662-671，RMMNDQLMFL(SEQ ID NO67)進行HLA-A*0201結(jié)合研究。如圖4，7和8所示，該表位即使在低于陽性對照肽(FLPSDYFPSV(HBV18-27)；SEQ IDNO.108)的濃度下，仍顯示顯著的結(jié)合。雖然未平行進行，但與對照相比，提示PSMA662-671(其在親合力方面接近Melan A肽)具有這兩個PSMA肽的超級結(jié)合活性。
實施例2使用此處公開的組合物進行多中心臨床研究。研究結(jié)果顯示該組合物對于減小實性腫瘤和對于通常誘導抗血管生成活性是有用的并且有功效的。
實施例3.在異體移植的人血管系統(tǒng)模型中評價PSMA組合物靶抗原反應性的CTL的產(chǎn)生A.小鼠的體內(nèi)免疫麻醉HHD1轉(zhuǎn)基因A*0201小鼠(Pascolo，S，等，J.Exp.Med.1852043-2051，1997)，并在尾部基點皮下注射100μlPBS溶液，避開側(cè)面的尾部靜脈，所述PBS溶液中含有100nmol PSMA288-297(SEQ ID NO21)以及20μg HTL表位肽，并且該PBS溶液已被50μl IFA(不完全弗氏佐劑)乳化。
B制備刺激細胞(LPS胚細胞)。
處死2只免疫的以及未免疫的天然小鼠，將它們的尸體放入酒精，利用它們的脾臟。利用無菌的工具，將小鼠左邊(中間略低的位置)皮膚的上皮層切開，露出腹膜。用酒精浸透腹膜，并無菌取出脾。將脾放入培養(yǎng)皿中，皿中帶有不含血清的培養(yǎng)基。使用3ml注射器的無菌柱塞搗碎脾臟以分離脾細胞。將細胞收集在50ml錐形管中，管內(nèi)含有不含血清的培養(yǎng)基，洗滌平皿孔。離心細胞(12000rpm，7min)，并用RPMI洗滌一次。以1×106細胞/毫升的濃度，將新鮮的脾細胞重懸于RPMI-10％FCS(胎牛血清)。加入25g/ml脂多糖和7μg/ml葡聚糖硫酸酯。在T-75燒瓶中，37℃，5％CO2條件下，孵育細胞3天。將脾胚細胞收集在50ml管中，沉淀(12,000rpm，7min)并以3×107/ml的量重懸于RPMI。以50μg/ml的量，用引發(fā)肽(priming peptide)沖擊胚細胞，室溫下(RT)4小時，以25μg/ml量的絲裂霉素C處理20min，并用DMEM洗滌三次。21C.體外刺激LPS刺激胚細胞后三天，并在同一天裝入肽，處死接觸過抗原的小鼠(在免疫后14天)，取出脾。在37℃和5％CO2條件下，在24孔板上，用1×106LPS胚細胞/孔的胚細胞，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3×106脾細胞，所述DMEM培養(yǎng)基補充有10％FCS，5×10-5M(β)巰基乙醇，100μg/ml鏈霉素和100IU/ml青霉素。在第3天向培養(yǎng)物中加入5％(體積/體積)的ConA上清液，并可在第7天移植。還在標準鉻釋放試驗中測試該CTL等分試樣，以確?；钚?。
移植和繼承轉(zhuǎn)移將1×106端粒酶轉(zhuǎn)化的HDMEC在10μl EGM-2-VM培養(yǎng)基(Clonetics，San Diego，CA)中的溶液與0.5ml MATRIGEL(Becton Dickinson)在冰上混合。通過25標準規(guī)格的針，沿著SCID小鼠胸腔的中線，皮下注射該混合物。一周以后，靜脈注射(或者可腹膜內(nèi)注射)0.2毫升1×107T細胞(靶表位反應性的或假免疫)。
評定(顯微形態(tài)測定法)移植1和2個星期后，除去移植物，固定在10％的緩沖液中過夜，石蠟包埋并分段。使用抗人IV型膠原IgG以及熒光標記的二次抗體免疫熒光檢測人微血管，在10mM pH6.0檸檬酸中微波處理薄片段2×7分鐘，釋放并收集抗原。評價血管密度，作為陽性染色的環(huán)狀構(gòu)造的平均數(shù)的函數(shù)，所述構(gòu)造是在五個分離的，隨機選擇的，來自每個移植物的至少三個片段的20x可見區(qū)中觀察到的。
實施例4.在HLA轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的纖連蛋白ED-B疫苗A.形成腫瘤收獲在加入了10％血清的完全RPMI中生長的腫瘤細胞，并用PBS通過離心洗滌。以5×106細胞/ml的濃度，將細胞懸浮在PBS中，并將0.5ml該懸液(早期傳代)皮下注射到腹部。
B.接種疫苗將核苷酸序列插入合適的疫苗載體中(例如pVAX1(InvitrogenInc，Carlsbad，CA)或美國專利申請?zhí)?9/561,572描述的載體，該申請名稱為“EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS”，2001年4月28日提交，所述核苷酸序列編碼HLA-A2限制的纖連蛋白ED-B結(jié)構(gòu)域來源的管家表位，例如ED-B29-38(SEQ ID NO.103)。用0，2，10，50，100，和200μg的載體在PBS中的溶液節(jié)點內(nèi)(intranodally)注射HHD-A2小鼠的腹股溝淋巴結(jié)，每隔一天，在8天內(nèi)進行(4次注射)，每個側(cè)面輪流注射(單一劑量/小鼠或小鼠組)。注射系列在注射腫瘤細胞當天開始，在之前2星期，以及在之后4和10星期。
C.評價在接受賦形劑而不是疫苗注射的小鼠中，注射腫瘤細胞之后大約12個星期觀察到可見的腫瘤。該疫苗的效力可以表示為在相同時間內(nèi)未形成腫瘤的接種疫苗動物的比例，在同一時間點腫瘤的相對大小，接種疫苗動物中腫瘤出現(xiàn)之前時間的延遲，以及抑制或防止腫瘤形成需要的劑量和組合物循環(huán)的數(shù)目。
D.交替性的時間表更具侵襲性的新近的(later)傳代Ml細胞的有效性能夠更壓縮實驗時間。腫瘤細胞接種當天并不對小鼠接種疫苗，而是在之前1、2個星期，以及注射1×106細胞后3或4天。接種腫瘤細胞大約10天后，評價接種疫苗的效力。
E.用肽免疫用ED-B29-38(SEQ ID NO.103)在弗氏完全佐劑中的溶液免疫HHD-A2小鼠，收集脾細胞并使用標準方法體外再刺激。所獲的CTL能特異性溶解肽沖擊過的T2細胞，其為HLA-A2+(圖9)。
實施例5.表位和表位簇表9顯示PSMA和ED-B的表位和表位簇，可用于構(gòu)建本發(fā)明的組合物。
表9.SEQ ID NOS.*
1這個H在SWISSPROT數(shù)據(jù)庫中發(fā)表為Y。
*SEQ ID NOS.5-17，20-27，29-36，39-88和92-105的任一序列，都可作為本發(fā)明各種實施方案中的表位。SEQ ID NOS.3，4，18，19，28，37，38，89和90的任一序列均可作為含表位或表位簇的序列，如同在本發(fā)明各實施方案中所述。
**此處和全文所用的所有登錄號可在NCBI數(shù)據(jù)庫登陸，例如Entrez seek和國際互聯(lián)網(wǎng)的檢索系統(tǒng)。
PSMA位點NM_0044762653bp mRNA PRI 01-NOV-2000定義人葉酸水解酶(前列腺特異性膜抗原)1(FOLH1)，mRNA.
登錄號NM_004476版本NM_004476.1 GI4758397關(guān)鍵詞來源人.
有機體人真核生物；后生動物；脊索動物；有頭類；脊椎動物；Euteleostomi；哺乳綱；真獸亞綱；靈長類；狹鼻類；人科；人。
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特征 位置/限定詞來源1..2653/有機體＝″人″/db_xref＝″分類單位9606″/染色體＝″11″/圖譜＝″11p11.2″/性別＝″男″/細胞_系＝″LNCaP-ATCC″/細胞_類型＝″前列腺″/組織_類型＝″前列腺癌轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)″/組織_文庫＝″Ron以色列的LNCaP cDNA″基因1..2653/基因＝″FOLH1″/注釋＝″FOLH；PSM；PSMA″/db_xref＝″基因座ID2346″/db_xref＝″MIM600934″CDS262..2514/基因＝″FOLH1″/注釋＝″葉酸水解酶1(前列腺特異性膜抗原)″/密碼子_起始＝1/db_xref＝″基因座ID2346″/db_xref-″MIM600934″/證據(jù)＝實驗/產(chǎn)物＝″葉酸水解酶(前列腺特異性膜抗原)1″/蛋白質(zhì)id＝″NP004467.1″/db_xref＝″GI4758398″/翻譯＝″MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPP
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登錄號X07717版本X07717.1 GI31406關(guān)鍵詞交替剪接；纖連蛋白。
來源人。
有機體人真核生物；后生動物；脊索動物；有頭類；脊椎動物；Euteleostomi；哺乳綱；真獸亞綱；靈長類；狹鼻類；人科；人。
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標題序列分析和體內(nèi)表達顯示人纖連蛋白基因的ED-B和ED-A區(qū)的交替剪接是獨立事件。
雜志Nucleic Acids Res.16(8)，3545-3557(1988)MEDLINE 88233940特征 位置/限定詞來源1..2823/有機體＝″人″
/db_xref＝″分類單位9606″/克?。健錗A10″外顯子1..104/數(shù)目＝1/產(chǎn)物＝″纖連蛋白″CDS連接(＜2..104，1375..1647，2758..＞2823)/密碼子_起始＝1/產(chǎn)物＝″纖連蛋白″/蛋白質(zhì)_id＝″CAB52437.1″/db_xref＝″GI5725425″/翻譯＝″CTFDNLSPGLEYNVSVYTVKDDKESVPISDTIIPEVPQLTDLSFVDITDSSIGLRWTPLNSSTIIGYRITVVAAGEGIPIFEDFVDSSVGYYTVTGLEPGIDYDISVITLINGGESAPTTLTQQTAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTW″(SEQ ID NO.90)內(nèi)含子105..1374/數(shù)目＝1外顯子1375..1647/注釋＝″ED-B外顯子″/數(shù)目＝2/產(chǎn)物＝″纖連蛋白″內(nèi)含子1648..2757/數(shù)目＝2外顯子2758..2823/數(shù)目＝3/產(chǎn)物＝″纖連蛋白″堿基數(shù)824a 556c 528g 915t起點1 ctgcactttt gataacctga gtcccggcct ggagtacaat gtcagtgttt acactgtcaa61 ggatgacaag gaaagtgtcc ctatctctga taccatcatc ccaggtaata gaaaataagc121 tgctatcctg agagtgacat tccaataaga gtggggatta gcatcttaat ccccagatgc181 ttaagggtgt caactatatt tgggatttaa ttccgatctc ccagctgcac tttccaaaac241 caagaagtca aagcagcgat ttggacaaaa tgcttgctgt taacactgct ttactgtctg
301 tgcttcactg ggatgctgtg tgttgcagcg agtatgtaat ggagtggcag ccatggcttt361 aactctgtat tgtctgctca catggaagta tgactaaaac actgtcacgt gtctgtactc421 agtactgata ggctcaaagt aatatggtaa atgcatccca tcagtacatt tctgcccgat481 tttacaatcc atatcaattt ccaacagctg cctatttcat cttgcagttt caaatccttc541 tttttgaaaa ttggatttta aaaaaaagtt aagtaaaagt cacaccttca gggttgttct601 ttcttgtggc cttgaaagac aacattgcaa aggcctgtcc taaggatagg cttgtttgtc661 cattgggtta taacataatg aaagcattgg acagatcgtg tccccctttg gactcttcag721 tagaatgctt ttactaacgc taattacatg ttttgattat gaatgaacct aaaatagtgg781 caatggcctt aacctaggcc tgtctttcct cagcctgaat gtgcttttga atggcacatt841 tcacaccata cattcataat gcattagcgt tatggccatg atgttgtcat gagttttgta901 tgggagaaaa aaaatcaatt tatcacccat ttattatttt ttccggttgt tcatgcaagc961 ttattttcta ctaaaacagt tttggaatta ttaaaagcat tgctgatact tacttcagat1021 attatgtcta ggctctaaga atggtttcga catcctaaac agccatatga tttttaggaa1081 tctgaacagt tcaaattgta ccctttaagg atgttttcaa aatgtaaaaa atatatatat1141 atatatatat tccctaaaag aatattcctg tttattcttc tagggaagca aactgttcat1201 gatgcttagg aagtcttttc agagaattta aaacagattg catattacca tcattgcttt1261 aacattccac caattttact actagtaacc tgatatacac tgctttattt tttcctcttt1321 ttttccctct attttccttt tgcctccccc tccctttgct ttgtaactca atagaggtgc1381 cccaactcac tgacctaagc tttgttgata taaccgattc aagcatcggc ctgaggtgga1441 ccccgctaaa ctcttccacc attattgggt accgcatcac agtagttgcg gcaggagaag1501 gtatccctat ttttgaagat tttgtggact cctcagtagg atactacaca gtcacagggc1561 tggagccggg cattgactat gatatcagcg ttatcactct cattaatggc ggcgagagtg1621 cccctactac actgacacaa caaacgggtg aattttgaaa acttctgcgt ttgagacata1681 gatggtgttg catgctgcca ccagttactc cggttaaata tggatgtttc atgggggaag1741 tcagcaattg gccaaagatt cagataggtg gaattggggg gataaggaat caaatgcatc1801 tgctaaactg attggagaaa aacacatgca atatcttcag tacactctca tttaaaccac1861 aagtagatat aaagcctaga gaaatacaga tgtctgctct gttaaatata aaatagcaaa1921 tgttcattca atttgaagac ctagaatttt tcttcttaaa taccaaacac gaataccaaa1981 ttgcgtaagt accaattgat aagaatatat caccaaaatg taccatcatg ctcttccttc2041 taccctttga taaactctac catgctcctt ctttgtagct aaaaacccat caaaatttag2101 ggtagagtgg atgggcattg ttttgaggta ggagaaaagt aaacttggga ccattctagg2161 ttttgttgct gtcactaggt aaagaaacac ctctttaacc acagtctggg gacaagcatg2221 caacatttta aaggttctct gctgtgcatg ggaaaagaaa catgctgaga accaatttgc2281 atgaacatgt tcacttgtaa gtagaattca ctgaatggaa ctgtagctct agatatctca2341 catgggggga agtttaggac cctcttgtct ttttgtctgt gtgcatgtat ttctttgtaa
2401 agtactgcta tgtttctctt tgctgtgtgg caacttaagc ctcttcggcc tgggataaaa2461 taatctgcag tggtattaat aatgtacata aagtcaacat atttgaaagt agattaaaat2521 cttttttaaa tatatcaatg atggcaaaaa ggttaaaggg ggcctaacag tactgtgtgt2581 agtgttttat ttttaacagt agtacactat aacttaaaat agacttagat tagactgttt2641 gcatgattat gattctgttt cctttatgca tgaaatattg attttacctt tccagctact2701 tcgttagctt taattttaaa atacattaac tgagtcttcc ttcttgttcg aaaccagctg2761 ttcctcctcc cactgacctg cgattcacca acattggtcc agacaccatg cgtgtcacct2821 ggg(SEQ ID NO.91)//
序列表<110>麥康公司約翰·J·L·西馬德戴維·C·戴蒙德<120>用于治療癌癥的抗新血管系統(tǒng)制劑<130>CTLIMM.015VPC<150>US60/274,063<151>2001-03-07<160>109<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>750<212>PRT<213>人<400>1Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg1 5 10 15Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe20 25 30Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu35 40 45Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu50 55 60Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile65 70 75 80Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile85 90 95Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His100 105 110Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile115 120 125Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe130 135 140Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro145 150 155 160Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr165 170 175Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met180 185 190Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val
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actggaaact tttctacaca aaaagtcaag atgcacatcc actctaccaa tgaagtgaca 1320agaatttaca atgtgatagg tactctcaga ggagcagtgg aaccagacag atatgtcatt 1380ctgggaggtc accgggactc atgggtgttt ggtggtattg accctcagag tggagcagct 1440gttgttcatg aaattgtgag gagctttgga acactgaaaa aggaagggtg gagacctaga 1500agaacaattt tgtttgcaag ctgggatgca gaagaatttg gtcttcttgg ttctactgag 1560tgggcagagg agaattcaag actccttcaa gagcgtggcg tggcttatat taatgctgac 1620tcatctatag aaggaaacta cactctgaga gttgattgta caccgctgat gtacagcttg 1680gtacacaacc taacaaaaga gctgaaaagc cctgatgaag gctttgaagg caaatctctt 1740tatgaaagtt ggactaaaaa aagtccttcc ccagagttca gtggcatgcc caggataagc 1800aaattgggat ctggaaatga ttttgaggtg ttcttccaac gacttggaat tgcttcaggc 1860agagcacggt atactaaaaa ttgggaaaca aacaaattca gcggctatcc actgtatcac 1920agtgtctatg aaacatatga gttggtggaa aagttttatg atccaatgtt taaatatcac 1980ctcactgtgg cccaggttcg aggagggatg gtgtttgagc tagccaattc catagtgctc 2040ccttttgatt gtcgagatta tgctgtagtt ttaagaaagt atgctgacaa aatctacagt 2100atttctatga aacatccaca ggaaatgaag acatacagtg tatcatttga ttcacttttt 2160tctgcagtaa agaattttac agaaattgct tccaagttca gtgagagact ccaggacttt 2220gacaaaagca acccaatagt attaagaatg atgaatgatc aactcatgtt tctggaaaga 2280gcatttattg atccattagg gttaccagac aggccttttt ataggcatgt catctatgct 2340ccaagcagcc acaacaagta tgcaggggag tcattcccag gaatttatga tgctctgttt 2400gatattgaaa gcaaagtgga cccttccaag gcctggggag aagtgaagag acagatttat 2460gttgcagcct tcacagtgca ggcagctgca gagactttga gtgaagtagc ctaagaggat 2520tctttagaga atccgtattg aatttgtgtg gtatgtcact cagaaagaat cgtaatgggt 2580atattgataa attttaaaat tggtatattt gaaataaagt tgaatattat atataaaaaa 2640aaaaaaaaaa aaa2653<210>3<211>30<212>PRT<213>人<400>3Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn1 5 10 15Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met20 25 30<210>4<211>23<212>PRT<213>人<400>4Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu1 5 10 15Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg20
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1.一種評價細胞介導的免疫的方法，其包括以下步驟將血管細胞移植到免疫缺陷哺乳動物體內(nèi)；在所述哺乳動物體內(nèi)形成免疫應答；和鑒定一種特征，以確定在所述哺乳動物體內(nèi)細胞介導的免疫。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞介導的免疫是針對一種新血管系統(tǒng)抗原。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述新血管系統(tǒng)抗原被腫瘤相關(guān)新血管系統(tǒng)優(yōu)先表達。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述新血管系統(tǒng)抗原是前列腺特異性膜抗原(PSMA)或血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述形成步驟是通過將T細胞繼承轉(zhuǎn)移到哺乳動物體內(nèi)而完成。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述形成步驟是通過用一種抗原接觸所述哺乳動物而完成。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞介導的免疫是由細胞毒性T淋巴細胞介導的。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述血管細胞是血管內(nèi)皮細胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述內(nèi)皮細胞是HDMEC。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述內(nèi)皮細胞是端粒酶轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細胞。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫缺陷的哺乳動物是小鼠。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述免疫缺陷的小鼠是SCID小鼠。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述表征步驟包括評價一個參數(shù)，所述參數(shù)選自血管形成，血管破壞，血管密度，和輸送所述宿主哺乳動物血液的向管比例。
14.權(quán)利要求1的方法，其進一步包括將腫瘤細胞或腫瘤組織移植到小鼠體內(nèi)的步驟。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述表征步驟包括評價一個參數(shù)，所述參數(shù)選自腫瘤出現(xiàn)，腫瘤生長，腫瘤大小，腫瘤出現(xiàn)的速度，抑制或防止腫瘤形成所需要的疫苗劑量，腫瘤血管化和在腫瘤內(nèi)壞死組織的比例。
16.權(quán)利要求1的方法，其進一步包括以下步驟提供哺乳動物第一群體和哺乳動物第二群體；在所述第一群體內(nèi)形成細胞介導的免疫；和在所述第二群體內(nèi)形成不同的細胞介導的免疫；將獲自所述哺乳動物第一群體的結(jié)果與獲自所述哺乳動物第二群體結(jié)果相比較。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述第一群體的細胞介導的免疫選自原初免疫和對無關(guān)表位的免疫。
18.一種評價細胞介導的免疫的方法，包括以下步驟將MHC轉(zhuǎn)基因腫瘤細胞移植或注射到一種MHC轉(zhuǎn)基因哺乳動物內(nèi)；在所述哺乳動物體內(nèi)形成免疫應答；和鑒定一種特征，以確定所述哺乳動物體內(nèi)的細胞介導的免疫。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述MHC轉(zhuǎn)基因哺乳動物是一種HLA-轉(zhuǎn)基因哺乳動物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述HLA-轉(zhuǎn)基因哺乳動物是一種HLA-A2轉(zhuǎn)基因哺乳動物。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述哺乳動物是小鼠。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述細胞介導的免疫是通過接種疫苗而形成的。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述接種疫苗發(fā)生在移植所述腫瘤細胞之前，與其同時，或在其之后。
24.權(quán)利要求18的方法，其中所述細胞介導的免疫是由細胞毒性T淋巴細胞介導的。
25.權(quán)利要求18的方法，其中所述新血管系統(tǒng)抗原被腫瘤相關(guān)新血管系統(tǒng)優(yōu)先表達。
26.權(quán)利要求18的方法，其中所述新血管系統(tǒng)抗原也是一種腫瘤相關(guān)抗原。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述抗原是纖連蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域。
28.權(quán)利要求18的方法，其中所述表征步驟包括評價一個參數(shù)，所述參數(shù)選自腫瘤的出現(xiàn)，腫瘤的生長，腫瘤的大小，腫瘤出現(xiàn)的速度，抑制或防止腫瘤形成所需要的疫苗劑量，腫瘤的血管化，所述腫瘤內(nèi)部壞死組織的比例等等。
29.權(quán)利要求18的方法，其進一步包括以下步驟提供哺乳動物第一群體和哺乳動物第二群體；在所述第一群體內(nèi)形成細胞介導的免疫；在所述第二群體內(nèi)形成不同的細胞介導的免疫；和將獲自所述哺乳動物第一群體的結(jié)果與獲自所述哺乳動物第二群體的結(jié)果相比較。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述第一群體的細胞介導的免疫選自原初免疫和對無關(guān)表位的免疫。
31.一種治療腫瘤疾病的方法，其包括免疫哺乳動物以誘導針對抗原的細胞免疫應答的步驟，所述抗原由腫瘤相關(guān)的新血管系統(tǒng)差異表達。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述差異表達的抗原是一種蛋白質(zhì)。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述蛋白質(zhì)是前列腺特異性膜抗原。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述抗原是纖連蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域。
35.權(quán)利要求32的方法，其中免疫是用至少一種來源于所述蛋白質(zhì)序列的肽進行。
36.權(quán)利要求32的方法，其中免疫是用一種核酸進行，所述核酸能夠表達所述蛋白質(zhì)或肽。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述的至少一種肽包含一個管家表位。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述的至少一種肽是與所述管家表位共C末端的。
39.權(quán)利要求37的方法，其進一步包括至少一種另外的肽，其中所述的至少一種另外的肽包含一個免疫表位。
40.權(quán)利要求31的方法，其包括一個額外的步驟，其中所述哺乳動物是用直接靶向癌細胞的抗腫瘤治療活性物質(zhì)進行治療。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述抗腫瘤治療是靶向腫瘤相關(guān)抗原的免疫。
42.權(quán)利要求31的方法，其中所述細胞免疫應答包括一種CTL應答。
43.一種免疫原性組合物，其包括至少一種免疫原，所述免疫原相應于一種腫瘤相關(guān)新血管系統(tǒng)表達的抗原，其中所述組合物可誘導一種細胞免疫應答。
44.權(quán)利要求43的組合物，其中所述免疫原與一種細胞不相關(guān)，所述細胞與受體同種。
45.權(quán)利要求43的組合物，其中所述抗原是一種蛋白質(zhì)。
46.權(quán)利要求45的組合物，其中所述蛋白質(zhì)是前列腺特異性膜抗原。
47.權(quán)利要求43的組合物，其中所述抗原是纖連蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域。
48.權(quán)利要求43的組合物，其中所述的免疫原包括至少一種肽。
49.權(quán)利要求43的組合物，其包括一種能夠表達所述抗原的核酸，并且其中所述抗原是一種蛋白質(zhì)或一種肽。
50.權(quán)利要求49的組合物，其包含至少一種包含一個管家表位的肽。
51.權(quán)利要求50的組合物，其中所述的至少一種肽是與所述管家表位共C末端的。
52.權(quán)利要求50的組合物，其另外包括至少一種包含一個免疫表位的肽。
53.權(quán)利要求43的組合物，其另外包括至少一種相應于一種腫瘤相關(guān)抗原的免疫原。
54.權(quán)利要求43的組合物，其中所述細胞免疫應答包括一種CTL應答。
55.一種抗腫瘤疫苗的設(shè)計方法，其包括以下步驟鑒定一種由腫瘤相關(guān)新血管系統(tǒng)差異表達的抗原；和將所述抗原的一個組分合并到一種疫苗中。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述組分是所述抗原的一個多肽片段。
57.權(quán)利要求55的方法，其中所述組分一種核酸，其編碼所述抗原或所述抗原的一個片段。
58.一種制備一個研究模型的方法，其包括將一種血管細胞和一種腫瘤細胞移植到一種免疫缺陷的哺乳動物體內(nèi)，其中所述腫瘤細胞被移植到靠近所述血管細胞的位置。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述血管細胞是一種血管內(nèi)皮細胞。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述血管內(nèi)皮細胞是HDMEC。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述血管內(nèi)皮細胞是端粒酶轉(zhuǎn)化的。
62.權(quán)利要求58的方法，其中所述免疫缺陷的哺乳動物是小鼠。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述小鼠是SCID小鼠。
64.一種研究模型，其包括一種免疫缺陷的哺乳動物，所述哺乳動物包含一種移植的血管細胞和一種移植的腫瘤細胞，其中所述血管細胞以及所述腫瘤細胞被移植成彼此靠近。
全文摘要
此處公開的是免疫原性的組合物，設(shè)計免疫原性組合物的方法，使用免疫原性組合物治療的方法，評估由免疫原性組合物產(chǎn)生的細胞介導的免疫的方法，研究模型，和制備研究模型的方法，所有涉及靶向腫瘤血管系統(tǒng)。
文檔編號C07K14/74GK1703247SQ02806006
公開日2005年11月30日 申請日期2002年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月7日
發(fā)明者約翰·J·L·西馬德, 戴維·C·戴蒙德 申請人:麥康公司