專利名稱：用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞刺激因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程，特別是涉及一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞刺激因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白(EPO/G-CSF)。
紅細胞刺激因子和粒細胞集落刺激因子為兩類重要的血細胞因子。在人類的造血系統(tǒng)中，每一位成年男性平均每年在體內(nèi)生成大約4.5×1011個粒細胞和紅細胞，約相當于人的總體重(Dexteret al,Bioessay 2,154-158(1985))。血細胞生長因子是一組蛋白，產(chǎn)生于體內(nèi)，并具有特異性刺激血細胞生長分化的功能。正常情況下，血液系統(tǒng)細胞的生長分化是靠造血生長因子(Hemotopoietic Growth Factor)調節(jié)的，它們包括多功能性集落因子(Multipotent-CSF)，白細胞介素3(IL-3)，粒巨噬細胞集落因子(GM-CSF)，粒細胞集落因子(G-CSF)，紅細胞生長因子(EPO)，血小板生成素(TPO)，干細胞因子(SCF)等。這些因子協(xié)調或單獨地調節(jié)造血前階段細胞的增殖分化活動。
粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是選擇性和特異性地刺激中性粒細胞的增殖和分化，其作用機理是作用于細胞表面的特異性受體，通過結合后引起一系列信號傳遞，促使細胞生長和發(fā)育。在臨床上，用于提高病人的中性粒細胞數(shù)目及病人抵抗感染的能力。
紅細胞刺激因子(EPO)能促使幼稚紅細胞生長分化。對晚期BFU-E(Burst Forming Units-Erythrocytes)及CFU-E(C010ny Forming Units-Erythrocyte)有促進分化作用，并使其合成血紅蛋白變成成熟紅細胞。EPO能促進網(wǎng)質紅細胞的提前釋放，并能刺激骨髓巨核細胞。
對愛滋病和腫瘤化療患者，藥物和化療常常會對患者的造血系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重影響。因在臨床上已有EPO和G-CSF合用，使之增加患者自身的免疫功能和紅細胞計數(shù)，加快病人的恢復的例子，同時因為世界范圍內(nèi)的供血緊張，且會有病毒污染血源的可能，如愛滋，肝炎等，所以正如文獻Strauss et al,J.Clin.Apheresis,1995,10:145 Vamavakas et al,J.Clin.Apheresis,1997,12:945 Strauss etal,B100d,1993,81:1675中指出的生產(chǎn)復合性的血細胞生成因子具有非常重要的臨床意義。
世界上已有幾種構建復合性血液刺激因子的例子，如IL3/EPO,EPO/IL3,IL3/G-CSF(WO92/06116，專利申請)。實驗證明，IL3/EPO和FPO/IL3具有刺激BFU-E和CFu-E的作用。復合因子的構建和產(chǎn)生是根據(jù)其自身的功能，同時又具有雙重的協(xié)同作用；最新一例證明是有協(xié)同作用的生產(chǎn)紅細胞刺激因子/粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(EPO/GM-CSF)如文獻Antonio Metal,US Patent 5916773。
本發(fā)明的目的在于為了克服已有的紅細胞刺激因子或粒細胞集落刺激因子作用單一的缺點，為了尋找一種與單體EPO與C-CSF相比具有較高的生物活性的、同時具有刺激紅細胞和粒細胞的雙重作用，EPO與G-CSF連成一體，既有協(xié)同作用，又不產(chǎn)生抗體的，在臨床上具有實用價值的刺激血細胞生長功能的復合性的血細胞生成因子(一種融合蛋白)，從而提供一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞刺激因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明提供的用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞刺激因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白(以下簡稱EPO/G-CSF融合蛋白)，該EPO/G-CSF融合蛋白，具有其EPO的生物活性為1×105U/mg，和其G-CSF的生物活性為1×107U/mg；具有如下結構紅細胞生長因子-連接片段-粒細胞集落刺激因子EPO————LINKER————G-CSF所述的融合蛋白具有圖8的EPO/G-CSF融合蛋白示意圖(一級結構)。所述的融合蛋白包括EPO/G-CSF結構(1)通過連接片段把紅細胞生長因子尾與粒細胞集落刺激因子的頭連接，即C端——N端連接；還包括G-CSF/EPO結構(2)通過連接片段把粒細胞集落刺激因子的尾與紅細胞生長因子的頭連接，即C端——N端連接；所述的EPO/G-CSF融合蛋白是在其兩蛋白中間有一小段連接片段，該連接片段是連接肽，連接肽順序的一級結構用以連接EPO和G-CSF蛋白順序，連接肽具有如圖3的序列，連接肽是10-20個有相同的或不相同的氨基酸連接順序，具有這些連接順序的氨基酸都可以是連接肽，圖3所示的一種序列是最佳的例子。
所述的融合蛋白具有EPO和G-CSF蛋白自然順序，并具有雙重活性，其EPO的生物活性為1×105U/mg，其G-CSF的生物活性為1×107U/mg。
EPO/G-CSF的質粒構建，其待征在于構建中使用設計合成的引物寡聚脫氧核苷酸P1,P2,P3,P4,P5,P6,P7,P8,它們的核苷酸序列是P1: 5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P2: 5, TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’P3: 5’ATGGCTGGACCTGCCACCCAGAGCC 3’P4: 5, TCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3’P5: 5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P6: 5’AGCTAGAATCCA CCCGCGGATCCA CCTCCTGATCCACCGCTGGACCTG CCACCCAGAGCC 3’
P7: 5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCGGACACCCCCCTGGGCCCTGCCA 3’P8: 5’AGCTAAAGCTTT CAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3’本發(fā)明提供的用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞刺激因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白，按以下步驟進行(1)為了獲得FPO/G-CSF融合基因質粒，首先從細胞中抽取信使核糖核酸(mRNA)，然后利用逆轉錄酶-DNA聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法制備單鏈和雙鏈互補脫氧核糖核酸(cDNA)；(2)經(jīng)過分離純化，將FPO的cDAN及G-CSF的cDNA分別克隆到載體上，以此為基礎進行融合蛋白的構建(見
圖1和2)；(3)利用聚合酶鏈反應(PCR)我們對二者進行了亞克隆和末端改造，以及增加了一小段連接體(見圖3和4)，通過限制性內(nèi)切酶，我們構建成了能夠表達EPO/G-CSF融合蛋白的質粒，并將其質粒轉化進入細胞株CHO或COS細胞。轉化后的CHO細胞能生產(chǎn)分泌EPO/G-CSF融合蛋白。
該方法詳細描述如下材料與方法一．細胞株包括CHO細胞株，COS細胞株。
菌株包括菌株DH5α，菌株HB101等質粒包括pTA連接質粒(3.9Kb,Ampr),pBR322。
真核細胞表達質粒包括pBS1(4.6Kb,DHFRr),pMCM(5.6Kb,Ampr)。
二．酶類DNA聚合酶(Clonetech)；限制性內(nèi)切酶(Promega,Biolab)；T4 DNA連接酶(Life Technologies)；mRNA純化Kit(Invitrogen)；cDNA合成Kit(Strategen)。
主要生化試劑和材料FPO標準品(Amgen)；dNTP(Perkin Elmer)；瓊脂糖(BRL)；氨卞青霉素(Sigma)；蛋白分子量標準(Bio-Rad)；DNA分子量標準(Life Technologies)；EPO ELISAKit(R&D)。
三．質粒的制備1．質粒篩選將含有目的質粒的細菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對數(shù)晚期(OD600約0.6)，將含有相應抗生素的LB培養(yǎng)液(預溫到37℃)放入燒瓶內(nèi)，加入對數(shù)晚期培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時，所得培養(yǎng)物的OD600值約0.4，于4℃以4000轉/分離心15分鐘，棄上清；將細菌沉淀重懸于用冰預冷的STE溶液中(STE溶液0.1mol/L NaCl,10mmol/L Tris·Cl,pH8.0,1mmol/L EDTA,pH8.0)，離心收集細菌細胞。將收集細菌的細胞重懸于用冰預冷的溶液中含10％蔗糖，50mmol/LTris·Cl,pH8.0溶液中，加溶菌酶溶液，混勻，在冰上放10分鐘，再加10％SDS，混勻，立刻加5mol/LNaCl(終濃度為1mol/L)混勻，在冰上放1小時，離心，將上清用酚氯仿和氯仿各提一次，將水相于室溫加入2倍體積乙醇混勻，于室溫放1-2小時，離心，回收質粒。
2．DNA片段的放大用PCR方法將EPOcDNA(以及其它DNA片段)放大，放置在PCR儀中進行擴增94℃,45秒，55℃,45秒，72℃,1-2分鐘，循環(huán)35次后，72℃,7-10分鐘。(詳見實施例)。
3．DNA片段的連接用相同限制性內(nèi)切酶切質粒和EPOcDNA(以及其它DNA片段)，37℃,30-60分鐘，經(jīng)瓊脂糖電泳純化后，用T4 DNA連接酶連接，形成重組質粒的構造。(詳見實施例)。
4．限制性內(nèi)切酶分析用限制性內(nèi)切酶切重組質粒，經(jīng)瓊脂糖電泳純化后，得到EPOcDNA(以及其它DNA片段)，由此證明連接的正確性。
5．DNA 序列分析用Sanger雙脫氧鏈終止法，將dNTP,DNA模板，Klenow，等量加在4個管中，55℃,30分鐘，分別加入ddA,ddG,ddT,ddC，保存于室溫15-20分鐘，按常規(guī)方法處理，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測序。
6．SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)電泳等采用常規(guī)方法，均參照文獻(Sambrook Jet al,ALaboratory Methods-Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,2nd Edition,1989；Current Protocol of Molecular Biology,John Wiley & Sons)。
五．細胞培養(yǎng)從液氮中取出冷凍細胞，置37℃水浴中迅速融化，將細胞懸液移入離心管內(nèi)，加入培養(yǎng)基，離心10分鐘，用含10％小牛血清(Life Technologies)的α-MEM(α-Dullbecco’sModified Fagle Medium,Life Technologies)培養(yǎng)基重懸細胞，然后移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，接種3×104cells/cm2，將細胞置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃,5％CO2，至活細胞比例＞85％(48-72小時)。
六．樣品蛋白含量測定1．染色液的配制100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml 95％乙醇中，然后與100ml 85％(W/V)磷酸混合，用水稀釋至1000ml；2．測定方法若蛋白量為＞0.2mg/ml，取0.1ml樣品與5ml染色液均勻混合，靜置10-30分鐘后測定A600nm；若蛋白量為5-100mg/ml，取0.8ml樣品與0.2ml染色液均勻混合后進行測定；以BSA測得曲線為標準曲線。
本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明為一種利用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞生長因子(EPO)/粒細胞集落刺激因子(G-CSF)融合蛋白(EPO/G-CSF)。通過對紅細胞生長因子和粒細胞集落刺激因子的亞克隆和末端改造以及用聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)的方法，把兩個基因通過一小斷多肽連接起來，使之形成表達質粒，將其轉化進入哺乳動物細胞并得到了高效表達，融合蛋白具有紅細胞生長因子和粒細胞集落刺激因子的雙重活性。經(jīng)過生物活性鑒定，與相同劑量的EPO和G-CSF單體相比，融合蛋白具有較高的生物活性；同時本發(fā)明也提出了連接肽順序，此順序致關重要，既能將EPO/G-CSF連成一體且有生物活性，同時又不產(chǎn)生抗體。融合蛋白具有EPO和G-CSF蛋白自然順序，并具有雙重活性，其EPO的生物活性為1×105U/mg，其G-CSF的生物活性為1×107U/mg。本發(fā)明在用于相關患者的血細胞生長發(fā)育中具有臨床應用的實際價值。
下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細的說明圖1是EPO cDNA的合成及重組質粒的構建。
圖2是G-CSF cDNA的合成及重組質粒的構建。
圖3是中間連接片段的結構一種圖例。
圖4A是通過PCR方法修飾和構建的FPO和圖4B是通過PCR方法修飾和構建的G-CSF質粒，兩個cDNA序列的兩端都得到了修飾，既末端改造。
圖5是構建pTrm-EPO-LINKER-G-CSF質粒的流程圖。
圖6是重新改造構建的pTrm-EPO-LINKER-G-CSF質粒。
圖7是pmNAD EPO-LINKER-G-csF質粒的構建流程圖。
圖8是本發(fā)明的EPO/G-CSF融合蛋白的示意圖(一級結構)。
圖9是蛋白純化圖1．標準樣品；2．EPO；3.0。CSF；4．融合蛋白。
表1是EPO/G-CSF融合蛋白生物化學特征測定。
表2是EPO/G-CSF融合蛋白動物實驗數(shù)據(jù)。
實施例1．引物寡聚脫氧核苷酸的設計與制備P1: 5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P1是從EPO基因起始因子開始，包括信號肽鏈。
P2: 5’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3，P2是互補于3，末端的寡聚脫氧核苷酸，與P1一起，通過PCR，放大并克隆全長(蛋白編碼)EPOcDNA。
P3: 5’ATGGCTGGACCTOCCACCCAGAGCC 3，P3是從起始因子開始的G-CSF寡聚脫氧核苷酸。
P4: 5’TCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3，P4是互補于3，末端的引物，它與P3一起放大并克隆全長(蛋白編碼)的G-CSF cDNA。
P5: 5,AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3,P5的后部分與EPO的起始密碼之后的脫氧核苷酸序列一致。在起始密碼之前，我們加7一個BamHⅠ位點。
P6:5,AGCTAGAATCCA CCC6CGGATCCA CCTCCTGATCCACCGCTGGACCTG CCACCCAGAGCC 3’P6是與EPO cDNA終止密碼之前的序列互補(不包括終止密碼)，并額外加了一段連接肽的核苷酸序列，其中含有一個SacⅡ。在SacⅡ位點之后又加了一個EcoRⅠ位點。
P7: 5,AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCGGACACCCCCCTGGGCCCTGCCA 3,P7是與G-CSF成熟蛋白的5’脫氧核苷酸的起始序列一致(在信號下游不包括信號肽)，在上游加了一段連接肽的脫氧核苷酸序列，其中包括了SacⅡ位點，同時在SacⅡ位點前插入了一個EcoRⅠ位點。
P8: 5,AGCTAAAGCTTT CAGGGCTGGGCAAGGTGGCOTAGA 3,P8與G-CSF cDNA的末端互補(包括終止密碼)，并帶有一個HindⅢ位點。
實施例2．人EPO、G-CSF和EPO／G-CSF融合基因全長核苷酸序列的測定為了獲得EPO、G、CSF基因以及EPO/G-CSF融合基因，我們對每一cDNA及改造后序列進行了亞克隆和末端改造，并利用常規(guī)方法對每一段cDNA及改造后的融合基因進行了核苷酸序列測定詳見實施例1和圖1-7)。
實施例3．EPO和G-CSF cDNA的制備用1μg mRNA為起始物，將mRNA溶入20μl去離子的水中，加熱65℃,10-20分鐘，置于冰浴中備用；然后加入cDNA合成緩沖混合液和AMV逆轉錄酶，其中含有1μM mRNA,50mM Tris.HCl(pH8.3),40mM KCl,6mM MgCl2,4mM DTT,0.5mM dNTP,0.1mM poly(dT)12-18,0.1mg/ml BSA。在37℃反應一小時。從上面的反應液中，取5μl，放入DNA聚合酶鏈反應(PCR)的試管中，依次加入100pmol P1和P2的上下游引物，克隆放大EPO基因(見實施例1),5μl PCR緩沖液(10X)，2.5mmol／L的dNTp和5單位的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)，最終體積為50μl；放置PCR僅中進行擴增94℃,45秒，55℃,45秒，72℃,1-2分鐘，循環(huán)35次后，72℃,7-10分鐘；反應完成后立刻取出，放置冰浴中待用。P3和P4克隆放大G。CSF基因，除P引物外，G-CSF的克隆和放大過程與EPO一樣。
實施例4．EPO和G-CSF重組質粒的構建按照圖1和圖2,PCR反應后，分別從兩個裝有EPO基因和G-CSF基因試管中，各取5μl反應液，加入另一試管中，其中含有pTa載體以及T4 DNA連接酶，形成EPO和G-CSF的基本構造，成為以后基因改造的基礎。對所有質粒均進行了限制性內(nèi)切酶的分析以保證序列的正確性。
實施例5．FPO/G-CSF表達重組質粒的構建
按照圖3-6流程，經(jīng)過改建和亞克隆后形成EPO/G-CSF重組質粒。經(jīng)過對其最后表達質粒的限制性內(nèi)切酶分析和序列測定后，證明其結構與所設計的結構一致。
實施例6．EPO/G-CSF融合基因在真核細胞中的高效表達用于表達EPO/G-CSF蛋白的真核細胞株為CHOdhfr-(CHO,DUKXBl)(Urlaub G,et al,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.77:1216)。利用Lipofectin(Life Technologies)將EPO/G-CSF融合基因進行轉化；轉化克隆生長于氨甲蝶吟(Methotrexate,Sigma)中；逐漸增加氨甲蝶吟濃度以選擇出高效表達細胞株。本實施例用免疫雜交試劑盒EPO ELISA KIT(R&D)和G-CSF ELISA KIT(R&D)對其融合蛋白的活性進行了測定。
實施例7．EPO/G-CSF融合蛋白的分離純化收集無血清細胞培養(yǎng)液(CHO-S-SFMII,Life Technologies)將其濃縮，然后在(20mMTris.HCl,pH6.0,50mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT)溶液中進行透析，溫度40℃，透析時間24小時；將透析后的溶液上樣于已平衡后的DEAE-Sepharose柱(5×20cm)用20mMTris.HCl,pH 6.0,50mM NaCl的緩沖液平衡5-10倍柱體積)。用梯度洗脫方法(洗脫液為0.05-1MNaCl)洗脫融合蛋白。分管收集各洗脫峰，經(jīng)活性測定后，收集有活性部份，將其濃縮后，用高壓氣相色譜(HPLC)分離純化，得到純化的融合蛋白。
實施例8．EPO/G-CSF融合蛋白生物化學特征的測定為了鑒別EPO/G-CSF融合蛋白的生化特征，本實施例做了免疫雜交實驗，其結果為蛋白分子量在預定范圍之內(nèi)。生物活性測定方法用Broxmeyeretal(Exp.hemat015,87(1971))和Luetal(Blood 61,250(1983))的方法，測定CFU-GM(C010ny FormingUnits。Granulocyte Macrophage)以及BFU-E的集落數(shù)目；對CFU-GM和BFU-E的集落數(shù)目進行比較和分析，EPO/G-CSF融合蛋白具有雙重活性以及協(xié)同作用(見表1)表1中所列四組實驗結果為一組5只小鼠。
表1CFU-GM(Colonles) BFU-E(Colonies)Medium 0±0 0±0對照組G-CSF 75±5.4 3±1EPO(1U) 0±0 26±1EPO/G-CSF 85±5 83±7
其測定方法為利用低密度粘著于培養(yǎng)皿的骨髓細胞，對所有集落進行測定。低密度細胞在IMDM(Iscov’s Modifled Dulbecco’s Media)培養(yǎng)液中(含有小牛血清)，37℃，生長1-2小時，按Ficoll-Hypague方法分離(Pharmacia)。
對CFU-GM的測定在1ml瓊脂培的培養(yǎng)皿中(含有McCoy’s培養(yǎng)液和10％加熱處理后的小牛血清)，放置1×105細胞，培養(yǎng)七天后，檢測其集落數(shù)目和形態(tài)，通過系列稀釋后與標準品對照。
對BFU-E的測定在1ml IMDM培養(yǎng)液中(含有0.8％甲基纖維素，methylcellulose,20％小牛血清，0.05mM巰基乙醇，β-Mercaptoethanol,1U EPO或者EPO/G-CSF融合蛋白)，放置1×105細胞，培養(yǎng)十四天后，檢測其集落數(shù)目和形態(tài)，通過系列稀釋后與標準品對照。以上為五組獨立實驗結果的平均值。從結果看G-CSF能夠協(xié)同紅細胞增殖及分化。純化后的EPO/G-CSF，測得其EPO的活性為1×105U/mg,G-CSF的活性為1×107U/mg。
實施例9．動物實驗將24只小老鼠分成4組，每組6只。A組為對照組，皮下注射生理鹽水；B組注射單體EPO(300U/每公斤體重)；C組注射單體G-CSF(5μg/每公斤體重)；D組為實驗組，注射本發(fā)明的融合蛋白(5μg/每公斤體重)。每天注射一次，連續(xù)七天后，檢測血沉和中性細胞數(shù)量。其結果如下(表2)表2實驗組 紅細胞壓積 中性拉細肥數(shù)目A無變化 無變化B增加1.5％ 無大變化C無大變化 增加4-6倍D增加1％增加約4倍
權利要求
1．一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞刺激因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于該EPO/G-CSF融合蛋白具有EPO和G-CSF蛋白自然順序，并具有雙重活性，其EPO的生物活性為1×105U/mg，和其G-CSF的生物活性為1×107U/mg；其結構為通過一連接片段把紅細胞生長因子與粒細胞集落刺激因子連接起來，結構如下紅細胞生長因子-連接片段-粒細胞集落刺激因子EPO————LINKER————G-CSF或 G-CSF————LINKER————EPO和具有EPO/G-CSF融合蛋白一級結構如下APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALRAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRGGSGGGSAAGGSGGTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLVSECATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP
2．按權利要求1所述的一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞刺激因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于所述的EPO/G-CSF融合蛋白結構是通過連接片段把紅細胞生長因子尾與粒細胞集落刺激因子的頭連接，即C端——N端連接。
3．按權利要求1所述的一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞刺激因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于所述的G-CSF/EPO融合蛋白結構是通過連接片段把粒細胞集落刺激因子的尾與紅細胞生長因子頭連接，即C端——N端連接。
4．按權利要求1所述的一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞刺激因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于所述的EPO/G-CSF融合蛋白的連接片段是連接肽，連接肽順序的一級結構用其連接EPO和G-CSF蛋白順序，連接肽是具有10-20個有相同的或不相同的氨基酸連接順序。
5．按權利要求4所述的一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞刺激因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于所述的連接肽具有如下的序列5’-GGT GGA TCA GGA GGT GGA TCC GCG GGT GGT GGA TCT GGC GGA-3’Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly
6．按權利要求1-6中的任意一項權利要求所述的一種用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞刺激因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白，其特征在于所述的E EPO/G-CSF的質粒構建中使用設計合成的引物寡聚脫氧核苷酸P1,P2,P3,P4,P5,P6,P7,P8，它們的核苷酸序列是P1: 5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P2: 5, TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’P3: 5’ATGGCTGGACCTGCCACCCAGAGCC 3’P4: 5, TCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3’P5: 5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P6: 5’AGCTAGAATCCA CCCGCGGATCCA CCTCCTGATCCACCGCTGGACCTG CCACCCAGAGCC 3’P7: 5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCGGACACCCCCCTGGGCCCTGCCA 3’P8: 5’AGCTAAAGCTTT CAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3’
7．一種制備權利要求1所述的紅細胞刺激因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白的方法，其特征在于按以下步驟進行(1)為了獲得EPO/G-CSF融合基因質粒，首先從細胞中抽取信使核糖核酸mRNA，然后利用逆轉錄酶-DNA聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法制備單鏈和雙鏈互補脫氧核糖核酸cDNA；(2)經(jīng)過分離純化，將EPO的cDAN及G-CSF的cDNA分別克隆到載體上，以此為基礎進行融合蛋白的構建；(3)利用聚合酶鏈反應(PCR)對二者進行了亞克隆和末端改造，以及增加了一小段連接體，通過限制性內(nèi)切酶，構建成了能夠表達EPO/G-CSF融合蛋白的質粒，并將其質粒轉化進入CHO或COS細胞。轉化后的CHO細胞能生產(chǎn)分泌EPO/G-CSF融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及用基因工程方法生產(chǎn)紅細胞生長因子/粒細胞集落刺激因子融合蛋白。通過對紅細胞生長因子和粒細胞集落刺激因子的亞克隆和末端改造以及用聚合酶鏈反應方法,把兩個基因通過一段多肽連接起來,使之形成表達質粒,將其轉化進入哺乳動物細胞并得到了高效表達。該融合蛋白具有紅細胞生長因子和粒細胞集落刺激因子的雙重活性,與相同劑量的EPO和G－CSF單體相比,融合蛋白具有較高的生物活性。本發(fā)明EPO的生物活性為1×10
文檔編號C07K19/00GK1311332SQ0110426
公開日2001年9月5日 申請日期2001年2月27日 優(yōu)先權日2001年2月27日
發(fā)明者李洪興 申請人:李欣越