血漿游離dna文庫的構建方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種“少量DNA文庫的構建方法”，首先對血漿游離DNA或片段化DNA進行末端修復，并同時對5’端進行磷酸化修飾，得到修復后DNA；之后直接與人工接頭進行平末端連接，經(jīng)純化后得到較純凈的連接處帶有缺口的含接頭DNA；然后在PCR擴增之前使用PCR聚合酶進行缺口的修補，得到修補后完整的含接頭DNA；再進行PCR擴增反應，產(chǎn)物純化后得到最終高通量測序文庫。本方法不僅簡便、高效，減少了純化步驟，降低了文庫構建過程中DNA的損失，而且使用特定的接頭及平末端的連接方式，有效地解決微量DNA文庫構建過程中容易出現(xiàn)接頭自連的問題；同時，擴增前修補缺口，保證擴增前有足夠的完整的模板進行擴增反應。
【專利說明】血漿游離DNA文庫的構建方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及擴增前修補缺口的血漿DNA文庫構建方法，特別是涉及可應用于無創(chuàng) 產(chǎn)前診斷的孕婦血漿中游離DNA文庫構建方法。
【背景技術】
[0002] 根據(jù)醫(yī)學統(tǒng)計，每年出生的新生兒中，約有2?3%罹患先天性疾病或出生缺陷， 造成了嬰幼兒長期臥病、殘障，甚至夭折，給社會和家庭帶來巨大的負擔。導致先天性疾病 或出生缺陷的原因主要有染色體異常、單基因遺傳病、多基因遺傳病、致畸胎因素等，其中 染色體異常占較大比例。在講求優(yōu)生保健的現(xiàn)代社會，如何防治先天性疾病或出生缺陷，成 為十分重要的課題。而產(chǎn)前診斷、及時發(fā)現(xiàn)、及時終止妊娠是預防遺傳缺陷患兒出生的重要 手段。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法是通過羊水穿刺、絨毛活檢以及胎兒臍帶血檢查直接獲取胎兒 遺傳物質(zhì)來進行診斷，這些產(chǎn)前診斷技術都是侵入性的，有一定的風險，可能會造成胎兒損 傷、母體流產(chǎn)或?qū)m內(nèi)感染，甚至胎死宮內(nèi)等，難以被廣大孕婦和家庭所接受。
[0003] 1997年Lo等研究報道了孕婦血漿中有胎兒游離DNA的存在，后來有研究也報道 發(fā)現(xiàn)孕婦血漿中存在胎兒RNA，這些重大發(fā)現(xiàn)為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了新的可能。在孕婦外 周血中胎兒游離DNA占孕婦血漿總DNA的3%?30%，無創(chuàng)產(chǎn)前診斷就是指抽取孕婦外 周血，通過對孕婦外周血中游離胎兒DNA進行高通量測序，通過生物信息學分析來檢測胎 兒是否患有21-三體綜合征（唐氏綜合征）、18-三體綜合征（愛德華氏綜合征）、13-三 體綜合征（帕陶氏綜合征）等染色體數(shù)目異常疾病，是產(chǎn)前診斷領域的一項新興技術。與 侵入性產(chǎn)前診斷相比較，無創(chuàng)產(chǎn)前診斷具有安全性高、靈敏度高、特異性好、檢測時間早、 快速等特點。
[0004] 目前，無創(chuàng)產(chǎn)前診斷過程中血漿游離DNA的文庫構建一般是在提取孕婦血漿中的 游離DNA后，通過末端修復一純化一加A-純化一連接頭一純化一擴增一純化等步驟來完 成。文庫構建過程中，步驟繁瑣，需經(jīng)過多次純化過程，會造成DNA的損失，同時在接頭連接 的過程中會出現(xiàn)接頭自連現(xiàn)象，致使文庫構建效率低、質(zhì)量差。或者通過末端修復并加A后 純化、連接頭后純化、擴增、純化等步驟來完成。雖然減少了純化步驟，降低了DNA的損耗， 但是仍然有接頭自連的問題難以解決。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明旨在提供一種高通量測序文庫的構建方法，以解決現(xiàn)有的少量DNA樣本建 庫，尤其是血漿游離DNA建庫過程中DNA損耗及容易出現(xiàn)接頭自連等問題。本方法不僅簡 便、高效，減少了純化步驟，降低了文庫構建過程中DNA的損失，而且使用特定的接頭及平 末端的連接方式，有效地解決微量DNA文庫構建過程中容易出現(xiàn)接頭自連的問題。同時，使 用特殊的文庫擴增聚合酶，擴增前修補缺口，保證擴增前有足夠的完整的模板進行擴增反 應。
[0006] -種少量DNA文庫構建方法，采用下述順序、方法步驟：
[0007] (1)對DNA片段進行末端修復成平端及5'端磷酸化，得到修復后DNA，
[0008] (2)修復后DNA直接與接頭進行平末端連接，純化，得到連接處帶有缺口的含接頭 DNA；
[0009] (3)使用PCR聚合酶進行缺口的修補，得到修補后完整的含接頭DNA，
[0010] (4)PCR擴增，純化，最終獲得高通量測序文庫。
[0011] 所述步驟⑵中的接頭為接頭A和接頭B，接頭A由SEQIDNOl和SEQIDN02等 摩爾量退火組合而成，所述接頭B由SEQIDN03和SEQIDN04等摩爾量退火組合而成，
[0012] SEQIDNOl：
[0013] 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '
[0014] SEQIDN02 ：
[0015]5，-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATC-3，，
[0016] SEQIDN03 ：
[0017] 5，-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACIIIIIIATC-3，，
[0018] SEQIDN04 ：
[0019] 5 '-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC T-3'，所述序列3中的六個堿基"IIIIII"表示測序平臺多樣品混合文庫中的標簽序列。
[0020] 所述測序平臺為為illumina測序平臺，所述"IIIIII"可以為任意六個堿基的隨 機組合。
[0021] 所述堿基序列在illumina測序平臺中可以為"ATCACG"，或者為"CGATGT"，或者 為"TTAGGC"，或者為"TGACCA"，或者為"ACAGTG"，或者為"GCCAAT"，或者為"CAGATC"，或 者為"ACTTGA"，或者為"GATCAG"，或者為"TAGCTT"，或者為"GGCTAC"，或者為"CTTGTA"。
[0022] 所述步驟（1)使用T4DNA聚合酶、大腸桿菌DNA多聚酶I大片段使DNA修復成平 末端。
[0023] 所述步驟（1)使用T4多核苷酸激酶使DNA平末端5'端磷酸化。
[0024] 所述DNA片段為血漿游離DNA，大小為100-250bp;或者為基因組DNA經(jīng)超聲破碎 為 100-250bp。
[0025] 本發(fā)明的文庫構建方法，首先對血漿游離DNA或片段化DNA進行末端修復成平端， 并同時對5'端進行磷酸化修飾，得到修復后DNA;之后直接與人工接頭進行平末端連接，得 到連接處帶有缺口的含接頭DNA;經(jīng)純化后得到較純凈的連接處帶有缺口的含接頭DNA;然 后在PCR擴增之前使用PCR聚合酶進行缺口的修補，得到修補后完整的含接頭DNA;再進行 PCR擴增反應，得到擴增產(chǎn)物；純化后得到最終高通量測序文庫。
[0026] 本發(fā)明的文庫構建方法，在進行DNA末端修復后不需進行純化，利用修復體系直 接進行接頭的連接，減少了純化步驟造成的DNA損失；本發(fā)明的文庫構建方法，使用的接頭 只有一端是平末端，保證了與目的DNA連接的方向正確；使用的接頭平末端未經(jīng)過磷酸化 修飾，保證了連接反應時不會生成接頭自連產(chǎn)物；本發(fā)明的文庫構建方法，使用特殊的DNA 聚合酶進行連接處缺口的修補，保證PCR擴增前對連接處缺口進行完美修復。
[0027] 在高通量測序領域，文庫構建好后，通常需要對文庫進行質(zhì)檢。質(zhì)檢內(nèi)容包括瓊脂 糖凝膠電泳評估文庫片段大?。徊捎脤崟r熒光定量PCR評估文庫濃度、是否有接頭自連污 染。當文庫濃度較低時，無法進行后續(xù)的高通量測序。當文庫中含有自連的接頭時，同樣無 法進行高通量測序。以Hiseq2000為例，其要求文庫濃度不低于2nM，且文庫中沒有自連的 接頭污染。
[0028] 本發(fā)明的技術方案，通過采用修復末端后直接連接接頭，減少了純化步驟從而減 少了DM損失。本發(fā)明中所使用的單向平末端接頭不進行磷酸化修飾，從而避免了文庫構 建過程中產(chǎn)生的接頭自連現(xiàn)象以及保證接頭連接方向的正確。本發(fā)明中所使用的PCR聚 合酶在PCR反應前進行修補缺口的反應，保證了足夠的完整的模板進行后續(xù)的PCR擴增 反應。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029] 圖1示明了本發(fā)明的文庫構建流程；
[0030] 圖2示明了本發(fā)明實施例與對照例文庫構建結果的電泳圖；
[0031] 圖3示明了本發(fā)明實施例文庫實時熒光定量PCR質(zhì)檢熔解曲線圖；
[0032] 圖4示明了本發(fā)明對照例文庫實時熒光定量PCR質(zhì)檢熔解曲線圖；
[0033] 圖5示明了本發(fā)明實施例與對照例文庫實時熒光定量PCR質(zhì)檢熔解曲線對比 圖。
【具體實施方式】
[0034] 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。
[0035] 按照圖1所示的文庫構建流程進行構建的。所使用的接頭序列為上述權利要求7 中所列序列。其中序列1與序列2等摩爾量退火組合成接頭A，序列3與序列4等摩爾量退 火組合成接頭B。
[0036] SEQIDNOl：
[0037] 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '
[0038] SEQIDN02 ：
[0039] 5, -AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATC-3，，
[0040] SEQIDN03 ：
[0041]5，-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACIIIIIIATC-3，，
[0042] SEQIDN04 ：
[0043] 5，-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA TCT-3'，所述序列3中的六個堿基"IIIIII"表示測序平臺多樣品混合文庫中的標簽序 列。
[0044] 下面實施例所使用樣品為正常人血漿游離DNA。使用市售試劑盒進行血漿游離 DNA抽提。DNA使用Qubit熒光計進行定量。
[0045]1、對照例：血漿DNA文庫構建
[0046] 1)樣本及試劑
[0047] 取Qubit定量后的血漿游離DNA5ng，使用市售高通量測序文庫構建試劑盒進行 文庫構建。
[0048] 2)對血漿游離DNA進行末端修復及加dATP
[0049] 反應體系如下： DNA 55.5ui 丨'ti?1丨末端修M及加Aftf浞介 3MI
[0050] iU代末端修Si及加A反應Buffer6.5ui總體積65ul
[0051] 反應條件：混勻后20°C孵育30分鐘。65°C孵育30分鐘。
[0052] 3)接頭連接
[0053] 反應體系如下： 少驟2)反應體系 65讀 ι}?餌連接反丨SiI5ul
[0054] lU色連接接頭 2.5ul Ilifi!連接反應増強劑 Iul 總體積83.5ul
[0055] 反應條件：混勻后20°C孵育15分鐘。
[0056] 在上述3)的體系中加入3ul市售試劑盒中酶進行酶切。
[0057] 反應條件：混勻后37°C孵育15分鐘。
[0058] 對上述產(chǎn)物進行磁珠純化。操作流程按照AmpureXPBeads純化說明書進行。
[0059] 4)PCR擴增
[0060] 反應體系如下： 步驟3)冋收產(chǎn)物 23磁 Γ|?售2XPCR反應混合物 25ul
[0061] il/ffliidexUKIlIui tl/售通.)UPCR^丨物 ω 總體積50ul
[0062] 反應條件：98°C預變性30秒；然后98°C變性10秒，65°C30秒，72°C30秒，共10 個循環(huán)；最后72 °C延伸5分鐘。
[0063] 對上述產(chǎn)物進行磁珠純化。操作流程按照AmpureXPBeads純化說明書進行。
[0064] 對步驟4)中的PCR純化產(chǎn)物進行Qubit定量。
[0065] 2、實施例：血漿DNA文庫構建
[0066] 1)樣本及試劑
[0067] 取Qubit定量后的血漿游離DNA5ng，使用市售相關試劑進行文庫構建。
[0068] 2)對血漿游離DNA進行末端修復及5'端磷酸化修飾
[0069] 反應體系如下：
[0070] DNA 25ul
[0071] 市售末端修復反應混合物 IOul
[0072] 總體積 35ul
[0073] 反應條件：混勻后20°C孵育30分鐘。70°C孵育15分鐘使酶失活。
[0074] 3)接頭連接
[0075] 反應體系如下： 步驟2)反故體系 35ul 辦愾快速連接bufTer(2X) SOui
[0076] 丨丨評丨快速迮接酶（25U/ul) Sul 接頭ASui 接頭BSul
[0077] 總體積 100ul
[0078] 反應條件：混勻后20°C孵育15分鐘。65°C20分鐘使酶失活。
[0079] 對上述產(chǎn)物進行磁珠純化。操作流程按照AmpureXPBeads純化說明書進行。
[0080] 4)修復缺口及PCR擴增
[0081] 反應體系如下： :步驟3)純化產(chǎn)物 34.5ul 電售反應Buffer(5X) IOul
[0082] 丨丨jff_PCR擴增_ (5U/ul) 0.5ul 辦售文庫擴增⑴物混合物（IOX)Sui總體積5(M
[0083] 反應條件：72°C孵育15分鐘，修補缺口；95°C預變性3分鐘；95°C變性15秒，58°C 退火15秒，72°C延伸30秒，共10個循環(huán)；最后72°C延伸1分鐘。
[0084] 對上述產(chǎn)物進行磁珠純化。操作流程按照AmpureXPBeads純化說明書進行。
[0085] 對步驟4)中的PCR純化產(chǎn)物進行Qubit定量。
[0086] 3、檢測：文庫質(zhì)檢
[0087] 1)配制2%瓊脂糖膠。對對照例和實施例中的兩個文庫各取IOOng進行瓊脂糖膠 電泳鑒定。DNAmarker使用TAKARADL1000marker5ul。鑒定結果如圖2所示，圖2從左 至右依次為TAKARADL1000marker、實施例文庫、對照例文庫。從圖2可知，本發(fā)明的實施 例文庫與對照例文庫主帶（300bp左右）均較明顯。
[0088] 2)通過實時熒光定量PCR進一步檢測對照文庫與實驗文庫是否有接頭污染。對照 例和實施例中的兩個文庫各取Iul，使用KAPABI0SYSTEMS公司的高通量測序文庫定量試 劑盒進行檢測。檢測結果如圖3-圖5所示，圖4顯示對照例文庫有少許自連接頭污染（熔 解曲線溫度82°C處），而本發(fā)明的實施例文庫無任何自連接頭污染。
[0089] 從以上描述中可以看出，上述實施例通過使用本發(fā)明的方法構建的血漿游離DNA 文庫，從根本上避免了高通量測序文庫構建容易出現(xiàn)自連接頭污染的現(xiàn)象，提高了文庫質(zhì) 量。
[0090]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并不用于限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進等，均包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權利要求】
1. 一種血漿游離DNA文庫構建方法，采用下述順序、方法步驟： (1) 對DNA片段進行末端修復成平端及5'端磷酸化，得到修復后DNA， (2) 修復后DNA直接與接頭進行平末端連接，純化，得到連接處帶有缺口的含接頭 DNA ； (3) 使用PCR聚合酶進行缺口的修補，得到修補后完整的含接頭DNA， (4) PCR擴增，純化，最終獲得高通量測序文庫。
2. 根據(jù)權利要求1所述的構建方法，所述步驟（2)中的接頭為接頭A和接頭B，所述 接頭A由SEQ ID N01和SEQ ID N02等摩爾量退火組合而成，所述接頭B由SEQ ID N03和 SEQ ID N04等摩爾量退火組合而成， SEQ ID N01 ： 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 ' SEQ ID N02 ： 5' -AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATC-3'， SEQ ID N03 ： 5' -AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACIIIIIIATC-3'， SEQ ID N04 ： 5, -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3,，所 述序列3中的六個堿基"IIIIII"為測序平臺多樣品混合文庫中的標簽序列。
3. 根據(jù)權利要求2所述的構建方法，所述測序平臺為為illumina測序平臺，所述 " IIIIII "可以為任意六個堿基的隨機組合。
4. 根據(jù)權利要求3所述的構建方法，所述六個堿基序列在illumina測序平臺中為 "ATCACG"，或者為 "CGATGT"，或者為 "TTAGGC"，或者為 "TGACCA"，或者為 "ACAGTG"，或者 為 "GCCAAT"，或者為 "CAGATC"，或者為 "ACTTGA"，或者為 "GATCAG"，或者為 "TAGCTT"， 或者為"GGCTAC"，或者為"CTTGTA"。
5. 根據(jù)權利要求1所述的構建方法，所述步驟（1)使用T4DNA聚合酶、大腸桿菌DNA多 聚酶I大片段使DNA修復成平末端。
6. 根據(jù)權利要求1所述的構建方法，所述步驟（1)使用T4多核苷酸激酶使DNA平末端 5'端磷酸化。
7. 根據(jù)權利要求1所述的構建方法，所述PCR聚合酶為市售DNA聚合酶。
8. 根據(jù)權利要求1所述的構建方法，所述DNA片段為血漿游離DNA，大小為100-250bp ; 或者為基因組DNA經(jīng)超聲破碎為100-250bp。
【文檔編號】C40B50/06GK104357918SQ201410690349
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權日:2014年11月25日
【發(fā)明者】王永利, 呂悅心, 劉玉瑛, 陳初光 申請人:北京閱微基因技術有限公司