專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)葡萄糖的方法，具體涉及一種基于納米材料的的檢測(cè)葡萄糖的方法。
背景技術(shù)：
隨著糖尿病人越來(lái)越多，葡萄糖檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)中。目前，普遍被 應(yīng)用的葡萄糖檢測(cè)方法主要包括兩大類(lèi)酶學(xué)比色法和電化學(xué)法。電化學(xué)法檢測(cè)比較靈敏， 但是需要專(zhuān)門(mén)儀器即電極和電化學(xué)工作站，不便于檢測(cè)。酶學(xué)比色法應(yīng)用的較多，且被制成 試紙條用于便攜檢測(cè)，但由于這個(gè)反應(yīng)體系中用到了酶聯(lián)反應(yīng)，而生物酶需要一定的反應(yīng) 條件且很容易失活，所以保存時(shí)必須注意到維持兩種酶的活性。生物酶在溫和條件下具有較高的底物特異性和高的催化效率。但是酶易變 性、容易被蛋白酶降解且制備和純化費(fèi)時(shí)費(fèi)力。為了提高生物酶的穩(wěn)定性，增強(qiáng)酶活 性，提高酶的反應(yīng)效率，有很多文獻(xiàn)常使用固定化酶技術(shù)來(lái)改善酶的活性及保存條件。 Jianhong Liu (Langmuir 2009，25 (23)，13456-13460)等合成 了一種新型的復(fù)合物，將葡 萄糖氧化酶固定在復(fù)合物表面，在增強(qiáng)酶活性的同時(shí)，也提高了酶的穩(wěn)定性。Pratibha Pandey (Langmuir 2007，23 (6)，3333-3337)等在這個(gè)反應(yīng)體系中引入了納米材料，通過(guò)化 學(xué)鍵將葡萄糖氧化酶固定在納米金表面，增強(qiáng)酶活性，提高了穩(wěn)定性，且增強(qiáng)了酶對(duì)溫度和 PH的耐受性。還有一些文獻(xiàn)中，引入了量子點(diǎn)、Fe304等納米材料。但是上述方法只是提高了酶的性能，并沒(méi)有從根本上解決問(wèn)題，酶的活性還是受 到一系列因素的制約，且在反應(yīng)體系中引入其他物質(zhì)后，使整個(gè)體系變得更復(fù)雜。2007年，Lizeng Gao (nature nanotechnology，2007，1-7)等發(fā)現(xiàn)磁性納米顆粒具 有過(guò)氧化物酶活性后，有一些課題組嘗試將磁性納米顆粒代替辣根過(guò)氧化物酶而應(yīng)用于葡 萄糖的檢測(cè)，但是由于第一步催化葡萄糖的反應(yīng)還是需要葡萄糖氧化酶的幫助，所以還是 受到制約生物酶的一些因素的限制。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問(wèn)題在于提供基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，以克服傳統(tǒng) 的生物酶在反應(yīng)條件及保存上的不足，提供穩(wěn)定性高，不需要特定的反應(yīng)條件，易于保存， 成本較低的葡萄糖的檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，包括如下步驟(1)將葡萄糖氧化酶與葡萄糖溶液反應(yīng)；(2)加入過(guò)氧化物酶及顯色物質(zhì)；(3)觀察顯色，并測(cè)量溶液的吸光值；其中，所述的葡萄糖氧化酶為粒徑為10-20nm的納米金，所述的過(guò)氧化物酶為納 米四氧化三鐵。
優(yōu)選的，所述的納米金的粒徑為13nm，所述納米金的溶度為17nM。所述的納米金的制備方法包括取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 % HAuCl4溶液1. 7ml和48. 3ml的 超純水混合并加熱攪拌；在完全沸騰后，加入5ml的11. 6mg/ml的檸檬酸三鈉；停止加熱后 繼續(xù)攪拌，冷卻；靜置后過(guò)濾得到納米金顆粒。所述納米金與葡萄糖反應(yīng)的溫度為0°C -70°C，優(yōu)選為55_70°C。所述納米金與葡 萄糖反應(yīng)的酸堿度為PH2. 0-9. 0，優(yōu)選為pH2-4或pH7_9。所述納米四氧化三鐵的制備方法包括取3. 25g六水合三氯化鐵 溶于50ml去離子 水，通氮?dú)猓瑪嚢?；在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下緩慢滴加0. 08M亞硫酸鈉25ml ；快速加入20ml氨水 后轉(zhuǎn)移至60°C油浴中反應(yīng)30分鐘，或室溫反應(yīng)2小時(shí)；磁分離，棄上清，洗滌，并加入鹽酸 懸浮。其中所述氨水是在12ml濃氨水加入8ml的去離子水。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于1、本發(fā)明中制備的納米金和納米四氧化三鐵，制備方法簡(jiǎn)便且快速、原料易得、成 本較低、可重復(fù)性高。2、本發(fā)明中制得的納米金的葡萄糖氧化酶活性與傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶相當(dāng)，對(duì)葡 萄糖的親和力相差不大。3、本發(fā)明中制得的納米金和納米四氧化三鐵均對(duì)反應(yīng)條件沒(méi)有特殊的要求。4、本發(fā)明中制得的納米材料反應(yīng)體系，與傳統(tǒng)的生物酶相比，具有很高的穩(wěn)定性， 能在室溫下保存。
圖1為比較本發(fā)明中的納米金與傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶對(duì)葡萄糖親和力的大小。圖2為根據(jù)本發(fā)明的方法測(cè)定的不同的葡萄糖濃度下，吸光值的變化。圖3為比較本發(fā)明中的納米金與傳統(tǒng)葡萄糖氧化酶對(duì)反應(yīng)溫度的要求。圖4為比較本發(fā)明中的納米金與傳統(tǒng)葡萄糖氧化酶對(duì)反應(yīng)pH的要求。圖5為比較本發(fā)明中的納米金和納米四氧化三鐵與生物酶的穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式下面根據(jù)附圖，給出本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例，并予以詳細(xì)描述，使能更好地理解本發(fā) 明的功能、特點(diǎn)。1、納米金的制備試劑包括氯金酸購(gòu)自Sigma公司，分析純的檸檬酸三鈉購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。制備過(guò)程包括以下幾個(gè)步驟(1)取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 % HAuCl4溶液1. 7ml和48. 3ml的超純(MilliQ)水倒入蒸餾 瓶?jī)?nèi)，設(shè)置加熱溫度開(kāi)始加熱，并將轉(zhuǎn)速調(diào)至200r/min ；其中，加熱溫度為120-130°C，目的 是將氯金酸溶液加熱。(2)在完全沸騰后，將轉(zhuǎn)速調(diào)至400r/min，并加入5ml的11. 6mg/ml的檸檬酸三 鈉；在高溫下能將氯金酸還原而生成納米金，在加入檸檬酸三鈉后可以觀察到溶液顏色從 無(wú)色變黑_褐色-紫色，最后為紫紅色。
(3)加熱20分鐘后，停止加熱，繼續(xù)攪拌半個(gè)小時(shí)，冷卻至室溫，防止粒徑不均一。(4)靜置12小時(shí)后，用0. 22um濾膜過(guò)濾除去反應(yīng)中的一些雜質(zhì)，得到粒徑比較均 一的濃度為17nM、粒徑為13nm的納米金。本發(fā)明的納米金與傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶對(duì)葡萄糖親和力的大小的比較如圖1所
示其中值得注意的是，HAuCl4溶液與超純水、檸檬酸三鈉的比例是固定的。三者之間 特定的比例用于制備特定粒徑、特定濃度的納米金。合成的納米金的粒徑經(jīng)過(guò)AFM或者TEM 表征。其中，納米金的粒徑優(yōu)選為10nm-20nm。2、磁性納米顆粒的制備試劑包括 六水合三氯化鐵、亞硫酸鈉、氨水、氯化鈉、鹽酸購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。制備過(guò)程包括以下幾個(gè)步驟(1)3. 25g六水合三氯化鐵溶于50ml去離子水，通氮?dú)?，攪?min ；其中，通入氮?dú)?的目的是去除溶液中的空氣，保持反應(yīng)體系是無(wú)氧狀態(tài)。(2)在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，緩慢滴加0. 08M亞硫酸鈉25ml ；可以觀察到溶液從棕紅 色反應(yīng)到亮黃色，說(shuō)明有三價(jià)鐵離子的形成。(3)快速加入20ml氨水后轉(zhuǎn)移至60°C油浴中反應(yīng)30分鐘，或室溫反應(yīng)2小時(shí)；其 中，所述氨水是在12ml濃氨水加入8ml的去離子水。(4)磁分離，棄上清，分別用lg/L氯化鈉溶液、去離子水洗滌，最后加入0. OlM的鹽 酸懸浮磁珠；其中，洗滌的目的是將沒(méi)有磁性的納米顆粒除去，用低濃度的鹽酸懸浮磁珠的 目的是使溶液體系的PH維持在弱酸性的條件下。此方法合成的納米四氧化三鐵具有很強(qiáng)的磁性和很強(qiáng)的過(guò)氧化物酶活性。3、檢測(cè)葡萄糖試劑包括葡萄糖氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶及顯色物質(zhì)2，2_聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻 唑-6-磺酸)ABTS均購(gòu)自Sigma公司，分析純的葡萄糖購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。檢測(cè)葡萄糖的過(guò)程包括如下幾個(gè)步驟(1)將17nM納米金15ul與0. 2M葡萄糖30ul在37°C反應(yīng)30分鐘；(2)在上述溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的納米四氧化三鐵40ul及顯色物質(zhì) ABTS(10M,ρΗ3·0)IOOul ；(3) 30分鐘后磁分離，觀察顯色，測(cè)410nm處的吸光值。此檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單易行，結(jié)果如圖2所示，隨著葡萄糖濃度的增大，其吸光值增加， 重復(fù)性強(qiáng)。根據(jù)此濃度曲線，可用于葡萄糖的定量測(cè)定。其中，步驟(1)是納米金將葡萄糖催化產(chǎn)生葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。用納米金代替 傳統(tǒng)的檢測(cè)體系中的生物酶，在反應(yīng)條件和穩(wěn)定性上都具有很大的優(yōu)勢(shì)。其中，步驟(2)是在過(guò)氧化氫的存在下，納米四氧化三鐵將還原態(tài)的顯色物質(zhì)氧 化而顯色，氧化的顯色物質(zhì)在410nm處有吸光值。4、納米金的反應(yīng)條件的探究
試劑包括EDTA、三乙胺、羥胺、鹽酸、三氯化鐵、三氯乙酸均購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。
將上述試劑配制成如下溶液溶液一5福 EDTA+0. ΙδΜ 三乙胺溶液二3Μ ΝΗ20Η溶液三:1MHC1+0. IM FeC13+0. 25M CC13C00H反應(yīng)溫度的探究將17nM納米金15ul和2*10_3mg/ml葡萄糖氧化酶5ul分別與0. 2M葡萄糖30ul 混合后分別放置于調(diào)節(jié)至不同溫度(0°C-7(TC)的水浴鍋，反應(yīng)30min后，進(jìn)行顯色，探究 不同反應(yīng)溫度對(duì)此反應(yīng)的影響。由此實(shí)施例結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖氧化酶在不同溫度下的活性呈現(xiàn)“鐘罩型”特征，即 溫度過(guò)高或過(guò)低，其活性都受到影響，溫度過(guò)低時(shí)活性受到抑制，溫度過(guò)高時(shí)葡萄糖氧化酶 又將失活，其最適反應(yīng)溫度為37°C。而對(duì)于納米金，隨著溫度的升高，其催化活性越高，在 葡萄糖氧化酶失活時(shí)，納米金仍具有很高的活性，說(shuō)明納米金對(duì)反應(yīng)溫度沒(méi)有特殊要求，在 0-70°C都催化葡萄糖氧化，其中優(yōu)選溫度為55-70°C。反應(yīng)pH的探究將Iml納米金(13nm、17nM)濃縮后除去上清，加入不同ρΗ(2· 0-9. 0)的緩沖液 PBS (稀釋10倍至濃度為IOOmM) IOOul，再加入IM葡萄糖40ul，反應(yīng)30min后，檢測(cè)產(chǎn)生的葡 萄糖酸，即加入250ul溶液一和25ul溶液二，反應(yīng)15min，再加入125ul溶液三，反應(yīng)5min， 測(cè)505nm處的吸收。葡萄糖氧化酶(10ul，lmg/ml) +不同pH的緩沖液(稀釋10倍至濃度為IOOmM) (90ul)，再加入IM葡萄糖40ul，反應(yīng)30min后，檢測(cè)產(chǎn)生的葡萄糖酸，即加入250ul溶液一 和25ul溶液二，反應(yīng)15min，再加入125ul溶液三，反應(yīng)5min，測(cè)505nm處的吸收。由此實(shí)施例結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖氧化酶在不同pH下的活性也呈現(xiàn)“鐘罩型”特征，即 PH過(guò)高或過(guò)低，其活性都受到影響，其最適反應(yīng)pH為4. 0-6. 0。而對(duì)于納米金，在不同的反 應(yīng)PH條件下都能正常進(jìn)行反應(yīng)，在葡萄糖氧化酶不能起催化作用時(shí)，納米金仍具有很高的 活性，說(shuō)明納米金對(duì)反應(yīng)PH沒(méi)有特殊要求，能在較寬的反應(yīng)pH條件(2. 0-9. 0)下正常氧化 葡萄糖，其中優(yōu)選PH2-4或pH7-9。5、整個(gè)反應(yīng)體系的穩(wěn)定性及保存將納米金、納米四氧化三鐵和傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶分別置于4°C 和室溫下放置12小時(shí)和放置24小時(shí)后，檢測(cè)生物酶和納米材料的催化活性，S卩(1)與葡萄 糖反應(yīng)30分鐘；(2)在上述溶液中加入納米四氧化三鐵及顯色物質(zhì)；(3) 10分鐘后觀察顯 色，測(cè)410nm處的吸光值。結(jié)果如圖5所示，其中第一組對(duì)照組為空白樣品，從第二、三組結(jié)果顯示，傳統(tǒng)的生物酶體系在4°C下保存，基本能維持活性，但是在37°C下放置12小時(shí)后，其吸光值基本 與對(duì)照一樣，說(shuō)明其活性已基本喪失活性，而納米材料體系能在4°C保存，也能在37°C下保 存，37°C下12h和24h后的吸光值與4°C下的吸光值相當(dāng)，仍能維持活性。納米材料在保存 上占有優(yōu)勢(shì)。由以上實(shí)施例的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物酶體系在反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH和保存上均受到很大的制約，而由于納米材料的特殊性質(zhì)，使得本說(shuō)明中的納米金的葡萄糖氧化酶活性和納米 四氧化三鐵的過(guò)氧化物酶活性對(duì)反應(yīng)條件沒(méi)有什么特殊的要求，由于納米材料的穩(wěn)定性， 使得納米金和納米四氧化三鐵均能在室溫下保存，并且仍能保持很高的活性，克服了傳統(tǒng) 的生物酶體系的種種劣勢(shì)，同時(shí)納米金有具有較高的葡萄糖氧化酶活性，而納米四氧化三 鐵也具有很高的過(guò)氧化物酶活性。本發(fā)明提供的檢測(cè)葡萄糖的方法也克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法在反應(yīng)條件苛刻、穩(wěn)定性 不好和不易保存上的劣勢(shì)，同時(shí)與昂貴的生物酶相比，納米材料制備方便、經(jīng)濟(jì)可行，且此 檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，保存方便。以上所述的，是根據(jù)本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的 上述實(shí)施例還可以做出各種變化。即凡是依據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的權(quán)利要求書(shū)及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作 的簡(jiǎn)單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明的權(quán)利要求保 護(hù)范圍。本發(fā)明未詳盡描述的技術(shù)內(nèi) 容為本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識(shí)。
權(quán)利要求
一種基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，包括下述步驟(1)將葡萄糖氧化酶與葡萄糖溶液反應(yīng)；(2)加入過(guò)氧化物酶及顯色物質(zhì)；(3)觀察顯色，并測(cè)量溶液的吸光值；其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶為粒徑為10-20nm的納米金，所述的過(guò)氧化物酶為納米四氧化三鐵。
2.如權(quán)利要求1所述的基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，其特征在于，所述的納米 金的粒徑為13nm。
3.如權(quán)利要求1或2所述的基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，其特征在于，所述納米 金的溶度為17nM。
4.如權(quán)利要求3所述的基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，其特征在于，所述的納米 金的制備方法包括取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為HAuC14溶液1. 7ml和48. 3ml的超純水混合并加熱攪拌；在完全沸騰后，加入5ml的11. 6mg/ml的檸檬酸三鈉；加熱20 30分鐘后停止，并繼續(xù)攪拌，冷卻；靜置后過(guò)濾得到納米金顆粒。
5.如權(quán)利要求1所述的基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，其特征在于，所述納米金 與葡萄糖反應(yīng)的溫度為0°C -70°C。
6.如權(quán)利要求5所述的基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，其特征在于，所述納米金 與葡萄糖反應(yīng)的溫度優(yōu)選為55°C -70°C。
7.如權(quán)利要求1所述的基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，其特征在于，所述納米金 與葡萄糖反應(yīng)的酸堿度為PH2. 0-9. 0。
8.如權(quán)利要求7所述的基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，其特征在于，所述納米金 與葡萄糖反應(yīng)的酸堿度優(yōu)選為PH2-4或pH7-9。
9.如權(quán)利要求1所述的基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，其特征在于，所述納米四 氧化三鐵的制備方法包括取3. 25g六水合三氯化鐵溶于50ml去離子水，通氮?dú)?，攪拌；在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下緩慢滴加0. 08M亞硫酸鈉25ml ；快速加入20ml氨水后轉(zhuǎn)移至60°C油浴中反應(yīng)30分鐘，或室溫反應(yīng)2小時(shí)；磁分離，棄上清，洗滌，并加入鹽酸懸浮。
10.如權(quán)利要求9所述的基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，其特征在于，步驟(3)中 的氨水是在12ml濃氨水加入8ml的去離子水。
全文摘要
本發(fā)明所要解決的問(wèn)題在于克服傳統(tǒng)的生物酶在反應(yīng)條件及保存上的種種劣勢(shì)。本發(fā)明提供一種基于納米材料的檢測(cè)葡萄糖的方法，具體包括將納米金與葡萄糖反應(yīng)；在上述溶液中加入納米四氧化三鐵及顯色物質(zhì)；觀察顯色，測(cè)410nm處的吸光值。本發(fā)明中提供的納米金和納米四氧化三鐵與昂貴的生物酶相比，制備方便、經(jīng)濟(jì)可行，對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH沒(méi)有特殊的要求，且與傳統(tǒng)的生物酶相比，具有很高的穩(wěn)定性，能在室溫下保存。
文檔編號(hào)B22F9/24GK101832937SQ201010156048
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者李江, 李迪, 樊春海, 蘇邵, 駱偉潔, 黃慶 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所