一種昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法

專利名稱：一種昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及領(lǐng)域包括昆蟲資源利用、生物技術(shù)和醫(yī)藥與獸藥研制，可適合各種昆蟲的 篩選。
背景技術(shù)：
作為地球上種類最多的生物，昆蟲具有繁殖快、適應(yīng)性廣的特點，除海洋外，所有生 態(tài)環(huán)境都有昆蟲的分布。自19世紀(jì)起，昆蟲就被作為免疫防衛(wèi)系統(tǒng)的研究對象，研究表明 抗菌蛋白在昆蟲體液免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用(Boman， 2003; Kimbrell， 2001; Hoffmann 等，1992; Hiiltmark, 1993)。尚存于地球上的現(xiàn)有昆蟲都是經(jīng)受劇烈的生存競爭獲勝而 生存下來的，它們在長期進化的過程中增強了抵抗各種病原菌侵染的能力，這就為我們篩 選具有抗菌作用的昆蟲抗菌蛋白/肽及其目的基因提供了豐富的基因資源庫。抗菌蛋白/肽 因其獨特的生物活性以及不同于傳統(tǒng)抗生素的特殊作用機理，已引起人們極大的研究興 趣。它抗菌譜廣，對細(xì)菌、病毒、某些原蟲、真菌及腫瘤細(xì)胞等具有選擇性殺傷作用(Boman， 2000)且本身無毒、無害(Giacometti等，2000)。目前，從昆蟲體內(nèi)獲得約有170種抗菌 肽(Bulet等，1999)。自1980年瑞典斯德哥爾摩大學(xué)Boman研究小組，首次由大腸桿菌注射誘導(dǎo)處理的惜古 比天蠶蛾滯育蛹血淋巴中提純得抗菌肽以來，國內(nèi)外許多學(xué)者就昆蟲源的抗菌蛋白/肽已做 了大量的篩選、活性測定、基因克隆與表達等工作，且明確昆蟲抗菌蛋白/肽可分成天蠶素 (cecropins)、防衛(wèi)素(defensins)、富含月甫氛酸的抗菌月太(prolin-rich antibacterial peptides) 和富含甘氨酸的抗菌肽(glycine-rich antibacterial peptides)，計四大類(Brey等，1998)。 盡管如此，在篩選方法及相應(yīng)的基因克隆技術(shù)方面還是存在效率偏低，新抗菌蛋白/肽及其基因難以發(fā)現(xiàn)等問題。如圖1所示，傳統(tǒng)的研究中所采取的技術(shù)途徑不外乎2種途徑1(1)先用外源因子如常用注射大腸桿菌，誘導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生抗菌蛋白/肽；(2) 以抗生素(青霉素)為對照，用紙片法進行抑菌圈測定，以評價抗菌效果；(3)再分離 純化蟲體勻漿液或血淋巴中的抗菌蛋白/肽，作進一步活性驗證；(4)測定純抗菌蛋白/ 肽的N端氨基酸序列，設(shè)計兼并引物，采用PCR法擴增基因，再進行表達，及表達產(chǎn)物活性的驗證 (Lehrer，R丄，ROSENMAN, m" Harwig， S.S" Jackson, R. and Eisenhauer, P. Ultrasensiteve assays for endogenous antimicrobial polypiptides丄Immunol. Methods, 1991,137: 167-173; Cole， A.M., Wu, M., Kim, Y.H. and Ganz, T. Microanalysis of antimicrobial proerties of human fluids.丄Microbiol. Methods, 2000, 41: 135-143; Barreteau, H., Mandoukou, L., Adt, I" Gaillard, I., Courtois, B. and Courtois, J. A rapid method for determing the antimicrobial activity of novel natrual molecules. J. Food Prot， 2004,67: 1961-1964 )。該研究途徑的主要局限 一是需要對一個一個組分進行逐一分析，工作量大，效率低； 二是對蛋白/肽純化技術(shù)及設(shè)備要求高，正因為這樣，有時即使發(fā)現(xiàn)了有很強抗菌活性的組 分，也因純化不過關(guān)而難以獲得其相應(yīng)的基因，使得采用基因工程手段規(guī)?；a(chǎn)該強活 性組分不能實現(xiàn)。途徑2(1)根據(jù)已有報道的抗菌蛋白/肽基因設(shè)計相應(yīng)引物；(2)以某種昆蟲或 不同昆蟲為材料，提取mRNA，采用PCR方法擴增相似目的基因；(3)表達獲得的目的基 因；以抗生素(如青霉素)為對照，用紙片法進行抑菌圈測定，以評價抗菌效果。最后， 評判哪些基因的表達產(chǎn)物具有理想的抗菌活性，具備應(yīng)用前景(Steinberg,D.A. and Lehrer, R.I. Designer assays for antimicrobial peptides. Disputing the "one-size-fits-all，' theory. Methods Mol. Biol" 1997， 189: 113-130; Tanchak, M., Schemthaner, J., Giband, M. and Altosaar I. Tryptophanins: isolation and molecular characterization of oat cDNA clones encoding proteins structurally related to puroindoline and wheat grain softness proteins. Plant Sci.，1998, 137: 173-184)。該研究途徑的主要局限 一是因根據(jù)現(xiàn)有抗菌蛋白/肽基因而設(shè)計引物，其結(jié)果使得獲 得的基因與現(xiàn)有的有較大的相似性，其有所不同的只是因供試?yán)ハx不同而已，這樣難以發(fā) 現(xiàn)新抗菌蛋白/肽及其基因；二是對所獲得的目的基因表達物要逐一進行活性測定與評價，效率欠高。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能大大提高篩選的針對性與效率的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因文庫的構(gòu)建及篩選方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種昆蟲源抗菌蛋白/肽基因文庫的構(gòu)建及篩選方法，包括以下步驟(1)昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的cDNA表達性文庫的構(gòu)建自昆蟲分離總RNA，提取poly (A)+RNA，克隆構(gòu)建得昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的cDNA表達性文庫；(2) cDNA表達性文庫的篩選a、 制備S0LR菌液；b、 將原噬菌體文庫轉(zhuǎn)化入制備好的SOLR菌液中并測定效價；c、 制備LB/Amp+濾膜平板；d、 取已轉(zhuǎn)化的S0LR菌液鋪板，先在0.45鵬的LB/Amp+微孔濾膜平板上涂板，37°C 倒置培養(yǎng)15小時左右至膜上有O. 1 0.5咖的菌落形成；再轉(zhuǎn)移至LB/Amp7lPTG+培養(yǎng)基， 37。C倒置培養(yǎng)3 4小時，至菌落生長到0. 9 1. 1毫米，轉(zhuǎn)至染色瓊脂培養(yǎng)基，染色10 15分鐘；同時與未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的作對照；挑取藍(lán)色菌落，于100微升含20%甘油的 LB/Amp+培養(yǎng)液中，一7(TC貯存，得昆蟲源抗菌蛋白/肽基因。作為本發(fā)明的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法的改進步驟(1)中總認(rèn)A 自昆蟲的整體或特定器官分離得到。作為本發(fā)明的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法的進一步改進步驟(1)采用純化mRNA試劑盒獲得poly (A)+RNA。作為本發(fā)明的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法的進一步改進步驟(1)采 用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA合成試劑盒和ZAP-c咖A Gigapack III克隆試劑盒構(gòu)建得cDNA表達性文庫。作為本發(fā)明的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法的進一步改進步驟(2) d 中的染色瓊脂培養(yǎng)基按照如下方法配制稱取0. 5g苔酚藍(lán)和0. 5g溴酚藍(lán)，分別溶解于9. 5 克水中，從而分別配成5%的苔酚藍(lán)母液和溴酚藍(lán)母液；另稱取4克瓊脂溶于1L水中，加 熱使其徹底溶解，再加入1毫升苔酚藍(lán)母液和1毫升溴酚藍(lán)母液，混勻后放置半小時使其 冷卻凝固即可。作為本發(fā)明的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法的進一步改進步驟(2) d 中的SOLR菌液是cDNA合成試劑盒中自帶SOLR菌液。作為本發(fā)明的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法的進一步改進步驟(2)的 原噬菌體文庫即步驟(1)中所構(gòu)建的cDNA表達性文庫；LB/A卿+濾膜平板的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物 5克、蒸餾水l升；均勻混合后，120'C高溫高壓滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫克/6毫升的氨芐青霉素母液1毫升；搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面放上 高溫滅菌過的孔徑為0. 45微米的微孔濾膜，即得LB/A卿+濾膜平板； LB/Amp7lPTG+培養(yǎng)基的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物 5克、蒸餾水1升；均勻混合后，12(TC高溫高壓滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫克/ 毫升的氨芐青霉素母液1毫升，0.5摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷母液l毫升，搖勻后倒 于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后，即得18^1^+/1 1&+培養(yǎng)基。本發(fā)明是針對傳統(tǒng)昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的克隆與篩選技術(shù)耗時、費錢，效率較低， 對蛋白/肽純化要求高，以及難以發(fā)現(xiàn)新抗菌蛋白/肽等的技術(shù)問題，解決并建立基于cDNA 表達性文庫而無須任何相關(guān)基因研究背景就能篩選出具有抗菌活性的蛋白/肽及其基因的 高效克隆篩選技術(shù)。該技術(shù)鑒于潛在抗菌蛋白/肽目的表達物能致死本身宿主菌的特點，將 潛在抗菌蛋白M太的昆蟲源目的基因的表達與表達物抗菌活性初步測定緊密相合，進行篩 選。當(dāng)篩選到表達物能使宿主菌死亡的克隆時，也就獲得了相應(yīng)的源于昆蟲的插入之文庫 中的目的基因。這就大大提高了篩選的針對性與效率。本發(fā)明的方法具體如下1 、 cDNA表達性文庫的構(gòu)建自昆蟲(種類可選擇)的整體或特定器官(組織)分離總RNA，以純化mRNA試劑 盒獲得poly(A)+RNA。再采用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA 合成試劑盒和 ZAP-cDNA Gigapack III克隆試劑盒，參照試劑盒操作說明進行各步操作，即構(gòu)建得cDNA 表達性文庫。2、 cDNA文庫的篩選(1) 制備SOLR菌液；(2) 將原噬菌體文庫轉(zhuǎn)化入制備好的SOLR菌液中并測定效價；(3) 制備LB/Amp+濾膜平板；(4) 取已轉(zhuǎn)化的SOLR菌液鋪板，先在LB/Amp+微孔濾膜(①0.45 mra)平板上涂板，37°C 倒置培養(yǎng)15h左右至膜上有較小的菌落形成。再轉(zhuǎn)移至LB/Amp"IPTG+培養(yǎng)基，37。C倒置 培養(yǎng)3 4h，至菌落生長到正常大小，轉(zhuǎn)至染色瓊脂培養(yǎng)基(苔酚藍(lán)0.0005%，溴酚藍(lán)0.0005 %，瓊脂0.4%)，染色10min左右，染色。同時與未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的作對照(菌落都 為白色)。用滅菌牙簽挑取藍(lán)色菌落(之所以呈藍(lán)色是因為該菌落中昆蟲源基因表達的蛋白/肽能使SOLR菌死亡，死亡的細(xì)胞被苔酚蘭染色成藍(lán)色，否則為白色)，于100 pi的 LB/Amp+ (含20%甘油)培養(yǎng)液中，一7(TC貯存。 具體關(guān)鍵技術(shù)方案如圖2所示具有抗菌作用基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入SOLR菌后，在誘導(dǎo)劑IPTG的誘導(dǎo)下基因表達后產(chǎn) 生抗菌的蛋白/肽，致使菌體的細(xì)胞膜收到破壞，從而允許染料分子進入細(xì)菌細(xì)胞，發(fā)生顯 色反應(yīng)，即觀察發(fā)現(xiàn)藍(lán)色的克隆。所以，這些被染成藍(lán)色的克隆就是含有抗菌基因的克隆。 將它們挑出后測序，就可得到相應(yīng)的基因序列。該發(fā)明一方面可免除傳統(tǒng)方法(途徑1)大量復(fù)雜的昆蟲材料中抗菌物質(zhì)的制備與純 化，及抗菌活性的逐一驗證；另方面，可避免傳統(tǒng)方法(途徑2)限于已有抗菌蛋白/肽基 因而設(shè)計引物進行基因擴增、克隆與表達的局限性，即僅挖掘一些相關(guān)的基因，而難發(fā)現(xiàn) 新抗菌蛋白/肽基因。相比之下，本技術(shù)不僅能夠直接、快速、有效地篩選昆蟲體內(nèi)的具抗 菌活性的蛋白/肽，而且即可知道其對應(yīng)的基因，為通過基因工程手段規(guī)范化大量表達目的 基因奠定了良好的技術(shù)關(guān)鍵。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細(xì)說明。 圖l是抗菌蛋白/肽及其基因篩選克隆的傳統(tǒng)途徑示意圖；圖2是本發(fā)明的基于cDNA表達性文庫的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的高效克隆篩選技術(shù) 方案示意圖；圖3是本發(fā)明的篩選時濾膜上的S0LR菌菌落圖； 此圖中在大量白色菌落中有形狀較小的藍(lán)色菌落，即是包含具潛在抗菌活性的目的 基因；圖4是本發(fā)明的具有抗菌作用的基因表達產(chǎn)物(蛋白/肽)對SOLR菌的抑制效果圖； 此圖中S0LR菌對照細(xì)菌生長快，菌液混濁；含抗菌蛋白/肽基因的S0LR菌細(xì)菌生長受抑制，菌液相對透明；圖5是用紙片法測試抗菌蛋白/肽基因表達物對S0LR菌的抑制效果圖；此圖中"1"代表卡那霉素陽性對照(濃度lmg); "2"代表克隆1表達物；"3"代表 克隆2表達物；"4"代表克隆3表達物；"5"代表克隆4表達物；"6"代表克隆5表達物;"7"代表克隆6表達物。
具體實施方式
實施例l、 一種昆蟲源抗菌蛋白/肽基因文庫的構(gòu)建及篩選方法，依次進行以下步驟1. cDNA表達性文庫的構(gòu)建在提取昆蟲mRNA的基礎(chǔ)上，根據(jù)相應(yīng)試劑盒的操作指南所規(guī)定的步驟進行。 自昆蟲(種類可選擇)的整體或特定器官(組織)分離總RNA，以純化mRNA試劑 盒獲得poly(A)+RNA。再采用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA 合成試劑盒和 ZAP-cDNA Gigapack III克隆試劑盒，參照試劑盒操作說明進行各步操作，即構(gòu)建得cDNA 表達性文庫。(試劑盒可從各生物公司購得)2. cDNA文庫的篩選(1) SOLR菌液準(zhǔn)備接菌環(huán)在酒精燈上灼燒至紅，冷卻后蘸取少量大腸桿菌SOLR甘油菌于含Kan+的LB 平板上劃線，37。C倒置培養(yǎng)12h。挑取單菌落于50ml的LB豐富培養(yǎng)基(LB營養(yǎng)瓊脂) 中，37°C， 200rpm培養(yǎng)12h左右。轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，1000g ， 4"C離心10min。去 上清液，再用10mM的MgSO4懸浮沉淀，調(diào)解OD,值為1.0。(2) LB/Amp+濾膜平板的準(zhǔn)備制備含100 pg/ml的Amp+的LB平板若干。LB/Amp+濾膜平板的制備方法如下 按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水1升；均勻混合后，12(TC高溫高壓(0.4Mpa)滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素母液1毫升；搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面放上高溫滅菌過的孔徑為0.45微米的微孔濾膜，即得LB/Amp+濾膜平板；即取已滅菌的濾膜(孔徑0.45pm)鋪于LB/Amp+平板上，注意膜與平板之間無氣泡。(3) 轉(zhuǎn)化將原噬茵體文庫(即步驟l所構(gòu)建的cDNA表達性文庫)加雙蒸水稀釋50倍，分別取 稀釋過的菌液1 pl于上述步驟(1)所得的200 plSOLR菌液中，37'C溫育15 min;取100 W在LB/Amp+濾膜平板上涂板，用三角棒(在酒精燈上灼燒并冷卻)涂幵，正面向上放置 20 min后37"C倒置培養(yǎng)12 h。査看細(xì)菌生長情況，從而決定轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中原噬粒文庫的稀釋倍數(shù)，由于稀釋50 倍及100倍后轉(zhuǎn)化效果不好，從而不稀釋。取100pl的PP噬粒(原噬菌體文庫)于上述步驟(1)所得的2ml的S0LR菌液中， 37。C溫育15 min，取100 pl在LB/Amp+濾膜平板上涂板，用三角棒(在酒精燈上灼燒并冷卻)涂開，正面向上放置20min后37'C倒置培養(yǎng)12h，査看結(jié)合效果。將上步所得的PP 噬粒與SOLR的結(jié)合產(chǎn)物2ml置于LB培養(yǎng)液50ml中，37°C， 200 rpm振蕩培養(yǎng)4~5 h， 至稠，再取100pl在LB/Amp+濾膜平板上涂板，37'C倒置培養(yǎng)12h，測定效價。將上述轉(zhuǎn)化所得的50ml菌液按20X的體積比例加入甘油，搖勻后分裝成lml/管，于 一7(TC貯存?zhèn)溆?。?00倍、1000倍和10000倍的比例稀釋上述菌液后，各取100 (xl在LB/Amp+濾膜 平板上涂板，正面向上放置20 min后37'C倒置培養(yǎng)12 h。觀察膜上菌落生長情況以找出 最佳倍數(shù)。通過測定效價和最佳稀釋倍數(shù)。找出最佳反應(yīng)菌液體積，即100^1/板，培養(yǎng)后每塊LB 濾膜平板上有幾千個菌落。(4) 鋪板、染色取一70。C貯存的已轉(zhuǎn)化的SOLR菌液100 pi在LB/Amp+濾膜平板上涂板，正面向上放 置20 min后，于37。C倒置培養(yǎng)15 h左右至膜上有較小(一般為0.1 0.5mm)的菌落形成。 再轉(zhuǎn)移至13^\1!^+/^10+培養(yǎng)基，37'C倒置培養(yǎng)3~4 h，至菌落生長到正常大小(一般為 0.9 1.1mm)，轉(zhuǎn)至染色瓊脂培養(yǎng)基，染色10min左右，仔細(xì)觀察后用滅菌牙簽挑取藍(lán)色 菌落(見圖3)于100 pl的LB/Amp+ (含20%甘油)培養(yǎng)液中，并記錄挑取的菌落大小及 染色深淺情況，渦旋振蕩混勻后分別分成兩管，在兩管上標(biāo)上相同的號碼，如PPla， 一70'C 貯存。上述染色瓊脂培養(yǎng)基的制作方法如下稱取0.5g苔酚藍(lán)和0.5g溴酚藍(lán)，分別溶解于 9.5克水中，從而分別配成5%的苔酚藍(lán)母液和溴酚藍(lán)母液；另稱取4克瓊脂溶于1L水中， 加熱使其徹底溶解，再加入1毫升苔酚藍(lán)母液和1毫升溴酚藍(lán)母液，混勻后放置半小時使 其冷卻凝固即可。即所得染色瓊脂培養(yǎng)基為苔酚藍(lán)0.0005%，溴酚藍(lán)0.0005%，瓊脂0.4%。上述LB/Amp7lPTG+培養(yǎng)基的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物 5克、蒸餾水l升；均勻混合后，120。C高溫高壓滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫克/ 毫升的氨芐青霉素母液1毫升，0.5摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷母液1毫升，搖勻后倒 于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后，即得1^^1^+/:^10+培養(yǎng)基。(5) 涂板法驗證取第一次挑出的菌液樣品(步驟(4)中鋪板染色后挑出的藍(lán)色克隆樣品)，置于冰上。吸取5 nl涂于LB/Amp+ZIPTG—及LB/Amp+ZIPTG+濾膜平板，正面向上放置10 min后37°C倒置培養(yǎng)12 h。LB/Amp7lPTG—濾膜平板的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物 5克、蒸餾水l升；均勻混合后，120'C高溫0.4Mpa滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫 克/毫升的氨芐青霉素母液1毫升；搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面 放上高溫滅菌過的孔徑為0. 45微米的微孔濾膜，即得LB/Amp7lPTG-濾膜平板。LB/Amp7lPTG+濾膜平板的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物 5克、蒸餾水l升；均勻混合后，120'C高溫高壓滅菌后冷卻至5CrC左右，加入100毫克/ 毫升的氨芐青霉素母液1毫升，0. 5摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷母液1毫升，搖勻后倒 于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面放上高溫滅菌過的孔徑為0.45微米的微孔濾 膜，即得LB/Amp7lPTG+濾膜平板。將膜取下置于染色瓊脂培養(yǎng)基上染色，比較膜上同一樣品菌落生長的大小、密度、著 色度及在1^/八11^+/1 丁0+濾膜平板上的菌落是否呈現(xiàn)統(tǒng)一顏色的情況，將詳細(xì)情況進行記 錄。根據(jù)染色的不同情況，作出不同的處理；將新挑出的菌落保存于的LB/Amp+ (含 20%甘油)培養(yǎng)液中，渦旋振蕩混勻后分別分成兩管，在兩管上標(biāo)上與原樣品相同的號碼， 如PPlb(b表示是涂板法驗證后重新挑取的菌液樣品)，一70。C貯存。①如果兩張膜上的菌落均不被染成藍(lán)色，則說明此樣品不含殺菌作用的基因，可丟 棄該樣品。② 如果菌落在1^/八11^+/1 10+濾膜上被部分染成藍(lán)色，而在1^^!1^+/1 丁0-上不染 色，說明挑取的樣品具有殺菌作用的基因，但此樣品混合了其他不含殺菌作用基因的克隆， 則挑取1^/八11^+/1 丁0+濾膜上被染成藍(lán)色的單菌落于100 ^的1^/八11^+ (含20%甘油) 培養(yǎng)液中，渦旋振蕩混勻后分成兩管，在兩管上標(biāo)上與原樣品相同的號碼，如PPlb(b表示 是劃線法驗證后重新挑取的菌液樣品)，一70'C貯存。③ 如果菌落在LB/AmpVlPTG+濾膜上被全部染成藍(lán)色，而在LB/Amp+ZIPTff上不染 色，說明挑取的樣品具有殺菌作用的基因，且此樣品只含有該種克隆，則挑取 !^/紐 +/1 丁0—上的無色單菌落于100的^LB/Amp+ (含20%甘油)培養(yǎng)液中，渦旋振蕩混勻后分成兩管，在兩管上標(biāo)上與原樣品相同的號碼，如PP2b， 一70。C貯存。 如果菌落在1^^^1^+/1 10+濾膜上被部分染成藍(lán)色，而在LB/Amp+ZIPTff膜上也有 部分被染成藍(lán)色，說明挑取的樣品含有殺菌作用的基因，且該基因在沒有IPTG誘導(dǎo)的情 況下也能表達從而產(chǎn)生殺菌效果；但此樣品混合了其他不含殺菌作用基因的克隆，處理方 法同②。⑤如果菌落在LB/Amp+/IPTG+及1^/八11^+/1 丁&兩張濾膜上全部被染成藍(lán)色，說明 挑取的樣品含有殺菌作用的基因，且該基因在沒有IPTG誘導(dǎo)的情況下也能表達從而產(chǎn)生 殺菌效果，且此樣品只含有該種克隆，因此只需保存原先保存的樣品，不用再挑取新的菌 落。對于還沒有純化的樣品如情況②和④還需進行再次涂板，直至在LB/Amp+ZIPTG+濾膜 平板上呈現(xiàn)統(tǒng)一的藍(lán)色為止。 3.抗菌活性驗證 (1)液體抑菌實驗①取保存的菌液樣品(經(jīng)步驟(5)驗證后保存的菌液)涂于LB/Amp"7lPTG-及 1^/八11^+朋丁0+濾膜平板，培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)至染色瓊脂培養(yǎng)基染色，如果+IPTG板上的克隆 全部染色，則挑取-ITPG板上白克隆5-10個;如果+IPTG板上的克隆不是全部染色的話，說 明菌樣在保存后經(jīng)過多次操作，可能已經(jīng)不純，則挑取+IPTG板上的染色克隆5-10個。② 將挑取的克隆接入5mlLB/Amp+培養(yǎng)液，37°C、 200卬m震蕩培養(yǎng)10小時左右，使 細(xì)菌的OD600達到1.0左右。③ 取上述步驟②的菌液(即OD,達到1.0左右的菌液)30pJ于3ml的LB/Amp+培 養(yǎng)液(AMP新鮮加入)中，(每個樣品接4管,2管+ITPG,2管-ITPG)。分別培養(yǎng)2,3,4小 時后測OD,(經(jīng)常觀察，當(dāng)一IPTG的菌液的OD600值大致在0.5左右時測其值)。測 定前目測觀察細(xì)菌培養(yǎng)液，注意是否有沉淀狀物出現(xiàn)。(2)抑菌圈實驗 ①抗菌蛋白的制備1.取保存的樣品甘油菌(即經(jīng)步驟(5)驗證后保存的菌液)涂于LB/Amp+/IPTGtl 膜平板，37t正面向上放置lOmi.n后，倒置培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)于LB/AMP+/IPTG+平板再培養(yǎng)3 小時。2. 取膜于染色瓊脂培養(yǎng)基上染色，挑取藍(lán)色單菌落懸浮于50(^1 LB/ Amp+培養(yǎng)液，分別取200nl上述菌液涂布于兩塊LB/Amp7IPTG—濾膜平板(直徑15厘米)，37'C正面向上 放置10min后，倒置培養(yǎng)過夜，至有菌落生成。3. 將其中一塊LB/Amp7IPTG—濾膜平板上的膜轉(zhuǎn)于LB/AMP7IPTG+平板，另一塊保持 原樣，兩塊平板37T:倒置繼續(xù)培養(yǎng)3 4h。4. 從上述兩塊LB/AMP7IPTG+濾膜平板及LB/Amp7IPTff濾膜平板上的膜切下l 2cm2的小塊于染色瓊脂培養(yǎng)基上染色，如LB/Amp7IPTG—濾膜上的菌落呈現(xiàn)一致的無色(有 少數(shù)樣品可能也會呈現(xiàn)一致的藍(lán)色)而LB/AMP7IPTG+濾膜上的菌落呈現(xiàn)一致的藍(lán)色，說 明染色反應(yīng)正常，可進行抗菌蛋白的提取。5. 取兩個已經(jīng)滅菌的1.5ml離心管，寫上編號(以PP7號樣品為例)7a、 7b，將如 LB/Amp7IPTGtl膜平板上的菌落用滅菌的刀片刮到7a管中，而LB/AMP7IPTG+濾膜平板 上的菌落用滅菌的刀片刮到7b管中，記錄菌的體積并保存于-2(TC。6. 用相同的操作方法收集所有菌液。7. 取搜集的菌落樣品加相同體積的裂解液(20mM HEPES, pH7.6, 500mM NaCl, 10% glycerol, lmM EDTA, lmM PMSF, 5ug/ml leupeptine, 1% v/v Aprotinin, 0.1% NP40)，渦旋混勻后將樣品置于液氮中冷卻，3"水浴解凍，重復(fù)上述操作5次，使細(xì)胞完全破碎， 4"C12000rpm離心10min后取上清至1.5ml離心管，編上相同編號，記錄上清液的體積并 于-2(TC貯存，這就是粗提的待測的"抗菌"蛋白。8. 為了得到較多量的"抗菌"蛋白，可在步驟2中增加培養(yǎng)基的數(shù)量，操作方法相 同，只需將同以樣品的菌體刮在同一離心管中，使得最終得到的菌量達到500nl左右。② 試驗菌液的制備為了排除抑菌作用由AMP引起的可能性，應(yīng)使用帶質(zhì)粒的SOLR菌；將菌液培養(yǎng)到 OD值為0.5左右時放置于4。C保存。③ 濾紙片的制備取新華l號定性濾紙，用打孔機打成6mm的小紙片，滅菌烘干備用。
等所有東西準(zhǔn)備完之后，按照配方(瓊脂l%w/v，蛋白胴l%w/v，酵母提取物0.5% w/v，氯化鈉0.05% w/v)配置瓊脂糖培養(yǎng)基，將pH調(diào)至7.0后滅菌，倒板等其冷卻后， 取用LB液體培養(yǎng)基稀釋100倍的上述試驗菌液200nl均勻涂板，等菌液吸收10min鐘后 將三層濾紙片放置于培養(yǎng)基上(放三層紙片是為了增大加樣量)。然后將提取的蛋白20^1加在濾紙片上，用卡那霉素做陽性對照，正面向上吸收完全后倒置培養(yǎng)過夜。觀察抑菌圈， 測其大小。4測序篩選所得并經(jīng)過驗證的含抗菌蛋白/肽的質(zhì)粒的菌液樣品送至測序公司進行測序；測序 結(jié)果用 Genebank ( http:ASvww.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST ) 禾B AMP 數(shù)據(jù)庫 (http:〃aps.unmc.edu/AP/main.php; http:〃reseach.izr.astar.edu.sg/Templar/DB/ANTIMIC)進行相似物和同源物的檢索。通過序列比對判斷所篩選的基因是否系新基因。為了證明本發(fā)明的優(yōu)點，發(fā)明人作了以下的對比實驗 對比實驗l、將家蠶、家蠅、天蠶按照實施例l所示的方法和途徑1所示的方法， 進行抗菌蛋白/肽基因文庫的構(gòu)建及篩選，篩選得到的克隆經(jīng)測序公司測序后所得的結(jié)果 與已經(jīng)報道的己知抗菌肽的序列(GENEBANK公布)完全一致。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明 不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直 接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1、一種昆蟲源抗菌蛋白/肽基因文庫的構(gòu)建及篩選方法，其特征在于包括以下步驟(1)昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的cDNA表達性文庫的構(gòu)建自昆蟲分離總RNA，提取poly(A)+RNA，克隆構(gòu)建得昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的cDNA表達性文庫；(2)cDNA表達性文庫的篩選a、制備SOLR菌液；b、將原噬菌體文庫轉(zhuǎn)化入制備好的SOLR菌液中并測定效價；c、制備LB/Amp+濾膜平板；d、取已轉(zhuǎn)化的SOLR菌液鋪板，先在0.45mm的LB/Amp+微孔濾膜平板上涂板，37℃倒置培養(yǎng)15小時左右至膜上有0.1～0.5mm的菌落形成；再轉(zhuǎn)移至LB/Amp+/IPTG+培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)3～4小時，至菌落生長到0.9～1.1毫米，轉(zhuǎn)至染色瓊脂培養(yǎng)基，染色10～15分鐘；同時與未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的作對照；挑取藍(lán)色菌落，于100微升含20％甘油的LB/Amp+培養(yǎng)液中，-70℃貯存，得昆蟲源抗菌蛋白/肽基因。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法，其特征在于所 述步驟(1)中總RNA自昆蟲的整體或特定器官分離得到。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法，其特征在于 所述步驟(1)采用純化mRNA試劑盒獲得poly(A)+RNA。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法，其特征在于所 述步驟(1)采用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA合成試劑盒和ZAP-cDNA Gigapack III克隆試劑 盒構(gòu)建得cDNA表達性文庫。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法，其特征在于所 述步驟(2) d中的染色瓊脂培養(yǎng)基按照如下方法配制稱取0. 5g苔酚藍(lán)和0. 5g溴酚藍(lán)，分 別溶解于9. 5克水中，從而分別配成5%的苔酚藍(lán)母液和溴酚藍(lán)母液；另稱取4克瓊脂溶于 1L水中，加熱使其徹底溶解，再加入1毫升苔酚藍(lán)母液和1毫升溴酚藍(lán)母液，混勻后放置半 小時使其冷卻凝固即可。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法，其特征在于所 述步驟(2) d中的SOLR菌液是cDNA合成試劑盒中自帶SOLR菌液。
7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及篩選方法，其特征在于所 述步驟(2)的原噬笛體文庫即步驟(1)中所構(gòu)建的cDNA表達性文庫； LB/Amp+濾膜平板的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5 克、蒸餾水l升；均勻混合后，12(TC高溫高壓滅菌后冷卻至50'C左右，加入100毫克/毫升 的氨芐青霉素母液1毫升；搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面放上高溫滅 菌過的孔徑為0. 45微米的微孔濾膜，即得LB/Amp+濾膜平板；1^#1^+/1 10+培養(yǎng)基的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5 克、蒸餾水l升；均勻混合后，120'C高溫高壓滅菌后冷卻至50'C左右，加入100毫克/毫升 的氨節(jié)青霉素母液1毫升，0. 5摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷母液1毫升，搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后，即得1^〃1!^+/1 16+培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種昆蟲源抗菌蛋白/肽基因文庫的構(gòu)建及篩選方法，包括以下步驟(1)昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的cDNA表達性文庫的構(gòu)建；(2)cDNA表達性文庫的篩選a.制備SOLR菌液；b.將原噬菌體文庫轉(zhuǎn)化入制備好的SOLR菌液中并測定效價；c.制備LB/Amp⁺濾膜平板；d.取已轉(zhuǎn)化的SOLR菌液鋪板，經(jīng)培養(yǎng)直至菌落生長到0.9～1.1毫米，轉(zhuǎn)至染色瓊脂培養(yǎng)基，染色；同時與未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的作對照；挑取藍(lán)色菌落，于100微升含20％甘油的LB/Amp⁺培養(yǎng)液中，-70℃貯存，得昆蟲源抗菌蛋白/肽基因。采用本發(fā)明的方法構(gòu)建及篩選昆蟲源抗菌蛋白/肽基因文庫，能大大提高篩選的針對性與效率。
文檔編號C40B50/06GK101328616SQ20081012014
公開日2008年12月24日 申請日期2008年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月24日
發(fā)明者葉恭銀, 吳玨靖, 慎小晶, 成雄鷹 申請人:浙江大學(xué)