專利名稱：一種核酸分析芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)領(lǐng)域中的一種核酸分析芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前用于檢測(cè)感染性疾病病原的方法中，對(duì)導(dǎo)致感染性疾病的細(xì)菌的檢測(cè)通常是采用細(xì)胞培養(yǎng)法，對(duì)導(dǎo)致感染性疾病的病毒的檢測(cè)方法則往往采用血清學(xué)方法。基于核酸的檢測(cè)方法以其所具有的快速，靈敏的特點(diǎn)，能夠縮短甚至消除傳統(tǒng)的基于細(xì)胞培養(yǎng)和血清學(xué)分析的檢測(cè)方法的操作過(guò)程中的等待時(shí)間。
傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法，尤其是用于感染性病原臨床檢測(cè)的核酸檢測(cè)方法，一般包括三個(gè)步驟。第一步是樣品制備，例如，處理樣品包括血清，全血，唾液，尿樣以及糞便來(lái)制備DNA或RNA，但從上述樣品中通常只能分離或制備得到少量目的核酸。為了更靈敏地檢測(cè)目的核酸，一般需要對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，常用的擴(kuò)增方法包括多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，鏈置換擴(kuò)增(SDA)以及滾環(huán)復(fù)制(RCA)等(Andras et al.，Mol.Biotechnol.，1929-44(2001))。第二步是核酸雜交。用于核酸分析的常規(guī)的凝膠電泳缺乏足夠的特異性，所以在臨床檢測(cè)中一般要求采用核酸雜交來(lái)進(jìn)行核酸的檢測(cè)。常規(guī)的核酸雜交方法有很多，包括Northern印跡，斑點(diǎn)雜交以及狹縫雜交。分析中的第三步是雜交信號(hào)的檢測(cè)。這一步通常是通過(guò)對(duì)目標(biāo)核酸的標(biāo)記物的檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，標(biāo)記物可以在核酸的擴(kuò)增或者雜交過(guò)程中引入。采用何種方法來(lái)檢測(cè)雜交信號(hào)往往視核酸標(biāo)記物的不同而不同。例如，熒光檢測(cè)器被用于熒光標(biāo)記的檢測(cè)，放射自顯影則被用于放射性標(biāo)記的檢測(cè)。而對(duì)于其他的生物標(biāo)記的檢測(cè)，如生物素標(biāo)記和地高辛標(biāo)記等，則需要進(jìn)行進(jìn)一步的酶學(xué)信號(hào)放大。視對(duì)檢測(cè)靈敏度的要求可以采用不同的信號(hào)放大方法，例如，Tyramide signalamplification(TSA)(Karsten et.al.，Nucleic Acids Res.，E4.((2002))以及分枝DNA(Kricka Clin.Chem.，45453-8(1999))。
上述的三個(gè)關(guān)鍵步驟在傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法是相互分離的，在前后兩步之間需要引入手工操作。手工操作的引入會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、費(fèi)用高，還會(huì)引入試驗(yàn)誤差，并最終會(huì)降低檢測(cè)的重現(xiàn)性和一致性。手工操作還會(huì)增加交叉污染和殘留污染的可能性，它們是導(dǎo)致核酸檢測(cè)方法(尤其包含核酸擴(kuò)增步驟的核酸檢測(cè)方法)在臨床中不能獲得廣泛應(yīng)用的主要原因。
核酸芯片或者DNA微陣列能夠被用于大量核酸目標(biāo)的同步分析。(Debouck andGoodfellow，Nature Genetics，21(Suppl.)48-50(1999)；Duggan et al.，NatureGenetics，21(Suppl.)10-14(1999)；Gerhold et al.，Trends Biochem.Sci.，24168-173(1999)；and Alizadeh et al.，Nature，403503-5110)。在特定情況下的基因表達(dá)模式可以采用核酸芯片或DNA微陣列進(jìn)行快速分析。在長(zhǎng)度達(dá)到1Kb的特定區(qū)域內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs)可以用核酸芯片在一次試驗(yàn)中進(jìn)行分析。(Guo et al.，Genome Res.，12447-57(2002)).
生化反應(yīng)和分析通常包括三個(gè)步驟樣品制備，生化反應(yīng)，信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。在芯片上對(duì)其中的一個(gè)步驟或幾個(gè)步驟進(jìn)行微型化和集成會(huì)形成一些特殊的生物芯片，例如，用于樣品制備的細(xì)胞分離芯片和介電電泳芯片，用于遺傳突變分析和基因表達(dá)分析的微型DNA芯片以及用于高通量藥物篩選的微型反應(yīng)芯片等。如果將生物化學(xué)反應(yīng)中的各個(gè)步驟集成到一張芯片，這樣的系統(tǒng)被稱之為微型全分析系統(tǒng)或芯片實(shí)驗(yàn)室。采用這樣的系統(tǒng)就有可能將從樣品制備到分析結(jié)果獲取的整個(gè)分析過(guò)程在一個(gè)封閉的體系快速的完成。
現(xiàn)行的生物芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的缺點(diǎn)是需要復(fù)雜的微加工。已有的芯片實(shí)驗(yàn)室方面的報(bào)道絕大多數(shù)都是對(duì)一個(gè)特定步驟的微型化，例如樣品制備芯片(Wilding et al.，Anal.Biochem.，25795-100(1998))，細(xì)胞分離芯片(Wang et al.，J.Phys.DAppl.Phys.，261278-1285(1993))以及PCR芯片(Cheng et al.，Nucleic AcidsRes.，24380-385(1996)).程京等報(bào)道了世界上第一例將樣品制備，生化反應(yīng)和結(jié)果檢測(cè)集成的芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)(Cheng et al.，Nat.Biotechnol.，16541-546(1998))，但是這一系統(tǒng)至今并未被商業(yè)化?，F(xiàn)有的商業(yè)化的芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，例如納米基因公司的微電子芯片，僅僅只實(shí)現(xiàn)了雜交和檢測(cè)兩步的集成和自動(dòng)化。使用時(shí)，需要配套一套復(fù)雜的儀器系統(tǒng)和分析軟件，屬于耗材的微電子芯片本身的成本亦很高。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可將樣品制備、核酸雜交以及結(jié)果檢測(cè)整合、集成化的核酸分析芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)。
本發(fā)明提供的核酸分析芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，包括一個(gè)由具有生物相容性材料在基質(zhì)上構(gòu)建的可控腔體；所述基質(zhì)上固定有一種或多種與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的核酸探針。
所述目標(biāo)核酸可以處于或者不處于基質(zhì)的表面。
該實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)還包括一套試劑，這套試劑適合于從樣品中制備所述的目標(biāo)核酸，適合于所述的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增，適合于所述的目標(biāo)核酸與所述的探針之間的雜交；同時(shí)還可以包括用于檢測(cè)所述的目標(biāo)核酸和所述的核酸探針之間的雜交結(jié)果的方法。因此在往本發(fā)明所述的可控的封閉腔體中加入帶有所述的目標(biāo)核酸的樣品后，可以在合適的條件下進(jìn)行下述的連續(xù)的操作從樣品制備或擴(kuò)增所述的目標(biāo)核酸，在所述的目標(biāo)核酸和所述的核酸探針之間進(jìn)行核酸雜交，需要的話還可以從所述的可控的封閉腔體中直接檢測(cè)雜交信號(hào)，在這一連續(xù)的操作過(guò)程中，所述的可控的封閉腔體和外界的環(huán)境之間沒(méi)有任何的物質(zhì)交換。
任何合適的材料均可被用于本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的構(gòu)建。在更合適的情況下，合適的材料是一種氣密性材料，例如，MJ Research公司的自封閉腔體(MJ Research selfseal chamber)和自封閉膠(self seal gel)，或者是封閉的塑料內(nèi)腔以及其它類似的材料。同時(shí)，在本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)中也可以采用放水材料。
合適的材料可以采用任何合適的方法而與基質(zhì)連接從而形成可控的封閉腔體。舉例來(lái)說(shuō)，合適的材料可以被膠合到基質(zhì)上而形成可控的封閉腔體；合適的材料也可以通過(guò)微加工的方式而構(gòu)造在基質(zhì)的表面而形成可控的封閉腔體。
任何合適的材料均可被用于本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的構(gòu)建。舉例來(lái)說(shuō)，合適的材料包括硅，塑料，玻璃，石英玻璃，陶瓷，橡膠，金屬，多聚物以及它們的任何組合。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)可以在基質(zhì)上固定一個(gè)核苷酸探針也可以在基質(zhì)上固定大量的核酸探針，這些核酸探針可以被用于同時(shí)分析大量的目標(biāo)核酸。
單鏈或雙鏈探針均可被用于本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)。探針可以是寡核苷酸探針或者是其它類型的核酸，例如長(zhǎng)鏈的PCR產(chǎn)物。應(yīng)用于本芯片實(shí)驗(yàn)室的核酸探針可以具有任何合適的長(zhǎng)度。如果使用的是單鏈探針，則其合適的長(zhǎng)度范圍是5到100堿基。如果使用的是雙鏈的探針，則其合適的長(zhǎng)度范圍是5到100堿基對(duì)。用于本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的探針可以是標(biāo)記的核酸探針?？梢圆捎萌魏魏线m的標(biāo)記方式。這些標(biāo)記方式包括，放射標(biāo)記，熒光標(biāo)記，化學(xué)標(biāo)記，酶學(xué)標(biāo)記，發(fā)光標(biāo)記，熒光共振能量轉(zhuǎn)移以及分子信標(biāo)。
探針可以被修飾而使其有利于與基質(zhì)相連接。核酸探針可以通過(guò)任何合適的方式而與基質(zhì)相連接。舉例來(lái)說(shuō)，核酸探針可以通過(guò)功能基團(tuán)而與基片相連接，例如-CHO，-NH2，-SH or-S-S-；探針與基質(zhì)的連接也可以通過(guò)特定的結(jié)合配對(duì)而介導(dǎo)，例如，生物素和親和素的配對(duì)，生物素與鏈霉親和素的配對(duì)。探針與基質(zhì)的連接可以通過(guò)多種方式而實(shí)現(xiàn)，例如，紫外線激活的交聯(lián)，熱激活的交聯(lián)，NH2和-CHO之間的反應(yīng)，-SH和-SH之間的反應(yīng)，生物素和親和素之間的結(jié)合，生物素與鏈霉親和素之間的結(jié)合。
核酸探針可以是特異性也可以是兼并性探針。核酸探針可以是DNA、RNA、PNA、LNA或者它們的組合。核酸探針可以充分或者完全與目標(biāo)核酸配對(duì)。
在本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的一個(gè)具體的實(shí)現(xiàn)方式中，對(duì)于一個(gè)特定的檢測(cè)位點(diǎn)，包含兩個(gè)核酸探針，第一條探針被固定在芯片基片的表面，并且?guī)в械谝环NFRET標(biāo)記，第二條探針處于液相環(huán)境中并帶有第二種FRET標(biāo)記，當(dāng)兩條探針均與目標(biāo)核酸雜交后，兩條探針由于目標(biāo)探針的存在而在空間上處于臨近的位置，從而在兩條探針之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生可以檢測(cè)的信號(hào)。可以采用任何合適的FRET標(biāo)記。一般優(yōu)選下列FRET標(biāo)記的組合，F(xiàn)luroscein和TAMRA，TAMRA和Cy5，ROX和Cy5，IAEDNS和Fluroscein，或者Fluroscein和QSY-7。
在本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的另外一種實(shí)施方式中，在一個(gè)特定的檢測(cè)位點(diǎn)上，其中第一條探針固定于芯片基質(zhì)的表面，而第二條探針則處于液相環(huán)境中，兩條探針之間互補(bǔ)，并且第一條探針與目標(biāo)核酸互補(bǔ)，第一條探針與第二條探針之間形成的雜交體的Tm值比第一條探針和目標(biāo)核酸之間的雜交體的Tm低5℃到30℃，第一條探針上帶有熒光標(biāo)記，第二條探針上則帶有與第一條探針上的熒光分子所對(duì)應(yīng)的淬滅分子。在不存在目標(biāo)核酸的情況下，上述的兩條探針之間可以雜交，熒光分子的熒光被淬滅分子所淬滅；在檢測(cè)體系中存在目標(biāo)核酸的情況下，目標(biāo)核酸更容易與固定的探針雜交，從而使得固定的探針上的熒光標(biāo)記不再被淬滅，在合適的激發(fā)光下產(chǎn)生可以檢測(cè)的信號(hào)。可以采用任何合適的熒光標(biāo)記，例如，6-FAM，TET，HEX，Cy3，Cy5，Texas Red，ROX，F(xiàn)luroscein or TAMRA，同時(shí)也可以采用任何合適的熒光淬滅標(biāo)記，例如，Dacyl，Black Hole-1，Black Hole-2或者直徑從0.1nm到10nm的膠體金顆粒。
需要的話，可以采用任何合適的方法來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)核酸，例如，多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，鏈置換擴(kuò)增(SDA)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的擴(kuò)增(TMA)以及滾環(huán)復(fù)制(RCA)。為了適合于擴(kuò)增，本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)可以包括至少一套適合于一種擴(kuò)增方法的反應(yīng)緩沖液和其它試劑。
在一種特殊的實(shí)現(xiàn)方式中，本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)包括一套同時(shí)進(jìn)行核酸擴(kuò)增和核酸探針與目標(biāo)核酸之間雜交的試劑。本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)包括一套能夠從樣品中制備目標(biāo)核酸，擴(kuò)增目標(biāo)核酸并且進(jìn)行核酸探針和目標(biāo)核酸之間雜交的試劑。
本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括一套溫度控制設(shè)備，例如商用的PCR儀以及水浴。本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括一套信號(hào)檢測(cè)設(shè)備，例如熒光成像設(shè)備。
本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)可以被用于任何適合的目的。舉例來(lái)說(shuō)，在封閉的腔體中實(shí)現(xiàn)連續(xù)的以獲得目標(biāo)核酸為目的的樣品制備以及核酸探針和目標(biāo)核酸之間的雜交。另一個(gè)例子是本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)可以被用于在在封閉的腔體中連續(xù)地實(shí)現(xiàn)核酸探針與目標(biāo)核酸之間的雜交以及雜交信號(hào)的檢測(cè)和分析。
本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括采用本系統(tǒng)進(jìn)行樣品制備，核酸擴(kuò)增或雜交的說(shuō)明。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種核酸分析方法。
本發(fā)明提供的核酸分析方法包括1)往上述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的可控封閉腔體中加入可能帶有目標(biāo)核酸的樣品；2)在封閉腔體中連續(xù)的從所述的樣品中制備所述的目標(biāo)核酸，或者擴(kuò)增所述的目標(biāo)核酸，在所述的目標(biāo)核酸和所述的核酸探針之間進(jìn)行雜交；3)進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)分析。
可采用本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)和核酸分析方法來(lái)進(jìn)行分析或定量的核苷酸序列包括DNA，RNA或者其它的自然狀態(tài)下存在的或者合成的核酸樣品。用于檢測(cè)的樣品包括體液例如尿液，血液，精液，腦脊液，膿液，羊水，眼淚；半固體或液體的滲出液例如痰液，唾液，肺抽出液，陰道或尿道滲出液；以及糞便或固體組織樣品例如活組織切片和活茸毛膜樣品。用于檢測(cè)的樣品還包括從皮膚，生殖器或喉嚨收集來(lái)的拭子樣品?？梢圆捎萌魏纬Ｓ玫姆绞絹?lái)從待測(cè)樣品中分離核酸。
本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)和核酸分析方法可以在一次試驗(yàn)中用一種探針來(lái)分析一種樣品，也可以是一種高通量的形式如用一種探針來(lái)同步分析大量的樣品，或者用大量的探針來(lái)同步分析一種樣品。更佳的方式是用大量的探針來(lái)同步分析大量的樣品。
可以采用本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)和核酸分析方法來(lái)分析任何合適的目標(biāo)核酸。目標(biāo)核酸包括DNA，例如A-，B-或者Z-形DNA，或者RNA例如mRNA，tRNA和rRNA。核酸可以是單鏈，雙鏈或者三鏈的形式。進(jìn)一步，可以分析編碼蛋白質(zhì)或者多肽的核酸。其中，蛋白質(zhì)和多肽包括酶，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如離子通道或離子泵)，營(yíng)養(yǎng)或存儲(chǔ)蛋白，收縮或運(yùn)動(dòng)蛋白(例如肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白)，結(jié)構(gòu)蛋白，防御蛋白或調(diào)節(jié)蛋白(例如抗體，激素或者生長(zhǎng)因子)。
可以采用本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)和核酸分析方法來(lái)分析任何合適的樣品。通常來(lái)分析生物樣品如來(lái)源于植物，動(dòng)物，人類，真菌，細(xì)菌或病毒的生物樣品。如果分析的樣品來(lái)源于哺乳動(dòng)物或者人類，則樣品可以是來(lái)源于特定的組織或器官。組織包括結(jié)締組織，上皮組織，肌肉組織或者神經(jīng)組織。器官則包括眼睛，環(huán)節(jié)螺旋器官，聽(tīng)覺(jué)器官，切維茨器官，環(huán)繞心室器官，科爾蒂器官，關(guān)鍵器官，指甲，末梢，女性外生殖器官，男性外生殖器官，移動(dòng)器官，魯菲尼器官，生殖器官，高爾基肌腱器官，味覺(jué)器官，聽(tīng)覺(jué)器官，女性內(nèi)生殖器，男性內(nèi)生殖器，輸送器官，雅各布森器官，神經(jīng)體液器官，神經(jīng)腱器官，嗅覺(jué)器官，耳石器，下垂器官，羅森米勒器，感覺(jué)器官，螺旋器官，皮下連合器官，皮下穹隆器官，額外器官，觸覺(jué)器官，靶器官，觸摸器官，泌尿器官，動(dòng)脈薄板末端器官，前庭器官，耳蝸前庭器官，退化器官，視覺(jué)器官，梨鼻器，游動(dòng)器官，韋伯器官以及祖克坎德耳體。樣品可以來(lái)源于哺乳動(dòng)物的內(nèi)部器官，例如腦，肺，肝，胰腺，骨髓，胸腺，心臟，淋巴，血液，骨頭，軟骨，胰腺，腎臟，膽囊，胃，腸，睪丸，卵巢，子宮，神經(jīng)系統(tǒng)，腺體，血管等。
本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)和核酸分析方法可以用于與不同疾病，失調(diào)或者感染相關(guān)的病理樣品的分析。其中，疾病或者失調(diào)包括腫瘤、癌癥、免疫系統(tǒng)疾病、代謝疾病、肌肉或者骨組織疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、信號(hào)傳導(dǎo)疾病或運(yùn)輸疾??；感染包括真菌，細(xì)菌以及病毒感染。
圖1為核酸分析芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意2為核酸探針與目標(biāo)分子的雜交結(jié)構(gòu)示意3為組合核酸探針與目標(biāo)分子的雜交位置關(guān)系示意4為組合核酸探針與目標(biāo)分子的雜交位置關(guān)系示意圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、核酸分析芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)如圖1所示，本發(fā)明的核酸分析芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)由核酸擴(kuò)增及雜交反應(yīng)腔1、核酸擴(kuò)增及雜交反應(yīng)體系2、固定在基片上的探針3、固相基片4、溫度控制器5及熒光掃描儀6組成。
核酸擴(kuò)增及雜交反應(yīng)腔1的腔體具有很好的氣密性，能夠長(zhǎng)時(shí)間耐95攝氏度以上的高溫。構(gòu)成腔體的材料具有良好的導(dǎo)熱性以及很好的生物相容性，對(duì)擴(kuò)增及雜交反應(yīng)沒(méi)有抑止作用?？梢赃x用MJ Research(MJ Research，Inc.MA，USA)的該類產(chǎn)品。
核酸擴(kuò)增及雜交反應(yīng)體系2包括引物和待檢測(cè)的模板以及優(yōu)化過(guò)的緩沖液體系，在該體系下可以順利地進(jìn)行核酸擴(kuò)增和雜交。
固定在基片上的探針3通過(guò)特定的共價(jià)方式固定在經(jīng)過(guò)特定化學(xué)修飾的芯片表面，通過(guò)與目標(biāo)序列的互補(bǔ)結(jié)合而實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)。
固相基片4具有很好的導(dǎo)熱性、強(qiáng)度以及生物相容性，對(duì)核酸擴(kuò)增及雜交沒(méi)有抑止作用?；牧先菀撰@得并且廉價(jià)?？捎玫墓滔嗖牧习ㄆ胀úＡ?，石英玻璃片，硅片，陶瓷以及塑料等。
用于PCR及雜交溫度控制的溫度控制器具有很好的控溫性能如升降溫速度快，控溫精度高。溫度控制器可以采用商用的PCR儀以及原位PCR儀以及微型的控溫設(shè)備，從而實(shí)現(xiàn)整套系統(tǒng)的小型化。
用于結(jié)果檢測(cè)的熒光掃描儀6?？梢圆捎蒙逃玫臒晒鈷呙鑳x和小型的熒光掃描儀。
實(shí)施例2、核酸探針與目標(biāo)分子的雜交結(jié)構(gòu)一種可實(shí)現(xiàn)雜交和檢測(cè)整合的探針未與目標(biāo)分子雜交時(shí)的結(jié)構(gòu)如圖2a所示，它包括基片4；具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針?lè)肿?。分子G1和分子G2為一對(duì)熒光分子和熒光淬滅分子的組合，兩者的位置可以互換；化學(xué)基團(tuán)G4為經(jīng)過(guò)特定化學(xué)處理后的后芯片基片上所暴露的基團(tuán)，化學(xué)基團(tuán)G3為探針?lè)肿幽┒嗽诤铣蓵r(shí)修飾上的基團(tuán)?；瘜W(xué)基團(tuán)G3和化學(xué)基團(tuán)G4之間在特定的條件下可以發(fā)生牢固的共價(jià)或非共價(jià)的結(jié)合，從而將探針固定在芯片的表面。
探針?lè)肿?具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。此時(shí)由于莖兩端的熒光分子和熒光淬滅分子距離很近，熒光分子在特定的激發(fā)光激發(fā)下所發(fā)射的熒光被熒光淬滅分子所淬滅，此時(shí)檢測(cè)不到信號(hào)。
一種可實(shí)現(xiàn)雜交和檢測(cè)整合的探針與目標(biāo)分子雜交后的結(jié)構(gòu)如圖2b所示，它包括基片4；具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針?lè)肿?；目標(biāo)分子7。分子G1和分子G2為一對(duì)熒光分子和熒光淬滅分子的組合，兩者的位置可以互換；化學(xué)基團(tuán)G4為經(jīng)過(guò)特定化學(xué)處理后的后芯片基片上所暴露的基團(tuán)，化學(xué)基團(tuán)G3為探針?lè)肿幽┒嗽诤铣蓵r(shí)修飾上的基團(tuán)?；瘜W(xué)基團(tuán)G3和化學(xué)基團(tuán)G4之間在特定的條件下可以發(fā)生牢固的共價(jià)或非共價(jià)的結(jié)合，從而將探針固定在芯片的表面。
此時(shí)由于雜交體的剛性而將圖2a中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，莖兩端的熒光分子和淬滅分子的距離拉大，熒光分子在特定的激發(fā)光下發(fā)射的熒光不被熒光淬滅分子淬滅，此時(shí)可以檢測(cè)到雜交信號(hào)。
實(shí)施例3、組合核酸探針與目標(biāo)分子的雜交位置關(guān)系一種可實(shí)現(xiàn)雜交和檢測(cè)整合的組合探針在與目標(biāo)分子雜交前的位置關(guān)系如圖3a所示，它包括基片4；固定在基片上的探針?lè)肿?；游離的探針?lè)肿?。分子G1和分子G2為一對(duì)可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的熒光分子?；瘜W(xué)基團(tuán)G4為經(jīng)過(guò)特定化學(xué)處理后的芯片基片上所暴露的基團(tuán)，化學(xué)基團(tuán)G3為探針?lè)肿幽┒嗽诤铣蓵r(shí)修飾上的基團(tuán)，化學(xué)基團(tuán)G3和化學(xué)基團(tuán)G4之間在特定的條件下可以發(fā)生牢固的共價(jià)或非共價(jià)的結(jié)合，從而將探針固定在芯片的表面。
在這種組合中有兩條探針。其中一條探針的一端可以通過(guò)特定的方式與經(jīng)過(guò)特定化學(xué)修飾的芯片表面共價(jià)結(jié)合，游離的另一末端修飾上了一種特定的熒光素。另一條探針則在反應(yīng)體系中游離，與第一條探針標(biāo)記熒光素的一端相對(duì)應(yīng)的一端標(biāo)記了另一種熒光素，在兩種熒光素之間可以實(shí)現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移。兩條探針均與目標(biāo)分子互補(bǔ)。
一種可實(shí)現(xiàn)雜交和檢測(cè)整合的組合探針在與目標(biāo)分子雜交后的位置關(guān)系如圖3b所示，它包括基片4；固定在基片上的探針?lè)肿?；游離的探針?lè)肿?；目標(biāo)分子7。分子G1和分子G2為一對(duì)可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的熒光分子。化學(xué)基團(tuán)G4為經(jīng)過(guò)特定化學(xué)處理后的芯片基片上所暴露的基團(tuán)，化學(xué)基團(tuán)G3為探針?lè)肿幽┒嗽诤铣蓵r(shí)修飾上的基團(tuán)，化學(xué)基團(tuán)G3和化學(xué)基團(tuán)G4之間在特定的條件下可以發(fā)生牢固的共價(jià)或非共價(jià)的結(jié)合，從而將探針固定在芯片的表面。
兩條探針在與目標(biāo)分子雜交后，位置上處于一種接近的關(guān)系，兩個(gè)熒光素的距離在產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移所要求的有效距離即Frster半徑之內(nèi)。此時(shí)用前一個(gè)熒光素的激發(fā)波長(zhǎng)來(lái)激發(fā)，而用后一個(gè)熒光素的發(fā)射波長(zhǎng)來(lái)接受，即可檢測(cè)到雜交信號(hào)。
實(shí)施例4、組合核酸探針與目標(biāo)分子的雜交位置關(guān)系一種可實(shí)現(xiàn)雜交和檢測(cè)整合的組合探針在與目標(biāo)分子雜交前的位置關(guān)系如圖4a所示，它包括基片4；固定在基片上的探針?lè)肿?；可與固定的探針?lè)肿咏Y(jié)合的探針?lè)肿?。分子G1和分子G2為一對(duì)可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的熒光分子或者分子G1為熒光分子，分子G2為淬滅分子。化學(xué)基團(tuán)G4為經(jīng)過(guò)特定化學(xué)處理后的后芯片基片上所暴露的基團(tuán)，化學(xué)基團(tuán)G3為探針?lè)肿幽┒嗽诤铣蓵r(shí)修飾上的基團(tuán)，化學(xué)基團(tuán)G3和化學(xué)基團(tuán)G4之間在特定的條件下可以發(fā)生牢固的共價(jià)或非共價(jià)的結(jié)合，從而將探針固定在芯片的表面。
這種組合有兩條探針。其中一條探針的一端可以通過(guò)特定的方式與經(jīng)過(guò)特定化學(xué)修飾的芯片表面共價(jià)結(jié)合，游離的另一末端修飾上了一種特定的熒光素。另一條探針則在反應(yīng)體系中游離，與第一條探針標(biāo)記熒光素的一端相對(duì)應(yīng)的一端標(biāo)記了一種熒光分子或者熒光淬滅分子。第二條探針與第一條探針互補(bǔ)，如果體系中無(wú)待檢測(cè)的目標(biāo)核酸分子，則熒光素分子所發(fā)射的熒光被熒光淬滅物質(zhì)所淬滅，或者的一條探針上的熒光素處于激發(fā)態(tài)時(shí)的能量通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移而轉(zhuǎn)移給互補(bǔ)探針上的熒光素分子，此時(shí)檢測(cè)不到雜交信號(hào)。
一種可實(shí)現(xiàn)雜交和檢測(cè)整合的組合探針在與目標(biāo)分子雜交后的位置關(guān)系如圖4b所示，它包括基片4；固定在基片上的探針?lè)肿?；可與固定的探針?lè)肿咏Y(jié)合的探針?lè)肿?；目標(biāo)分子7。分子G1和分子G2為一對(duì)可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的熒光分子或者分子G1為熒光分子，分子G2為淬滅分子?；瘜W(xué)基團(tuán)G4為經(jīng)過(guò)特定化學(xué)處理后的后芯片基片上所暴露的基團(tuán)，化學(xué)基團(tuán)G3為探針?lè)肿幽┒嗽诤铣蓵r(shí)修飾上的基團(tuán)，化學(xué)基團(tuán)G3和化學(xué)基團(tuán)G4之間在特定的條件下可以發(fā)生牢固的共價(jià)或非共價(jià)的結(jié)合，從而將探針固定在芯片的表面。
這種組合有兩條探針。其中一條探針的一端可以通過(guò)特定的方式與經(jīng)過(guò)特定化學(xué)修飾的芯片表面共價(jià)結(jié)合，游離的另一末端修飾上了一種特定的熒光素。另一條探針則在反應(yīng)體系中游離，與第一條探針標(biāo)記熒光素的一端相對(duì)應(yīng)的一端標(biāo)記了一種熒光淬滅物質(zhì)。如果體系中有待檢測(cè)的目標(biāo)核酸分子，則第二條探針與第一條探針的結(jié)合被目標(biāo)分子與第一條探針的結(jié)合所取代，淬滅作用被消除，即可檢測(cè)到雜交信號(hào)。
實(shí)施例5、基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的整合系統(tǒng)用于乙型肝炎病毒的檢測(cè)A.醛基化芯片的制備將玻片浸泡于洗液中，室溫過(guò)夜。洗凈玻片上的酸液。離心甩干玻片。110℃，15分鐘，徹底干燥玻片。將玻片浸入1％APTES(異丙胺基-三乙氧基硅烷)的95％乙醇中。在室溫下用脫色搖床輕搖1小時(shí)。用95％乙醇清洗處理過(guò)的玻片。將洗凈的玻片放入真空干燥箱，抽真空至最大刻度(-0.08Mpa到-0.1Mpa)，關(guān)閉通氣閥，開始升溫，110℃，20分鐘。將涼至室溫的玻片浸泡于12.5％的戊二醛溶液(400ml 12.5％戊二醛溶液100ml 50％的戊二醛，300ml磷酸鹽緩沖液(1M NaH2PO4 30ml，2.628gNaCl)，調(diào)PH值到7.0))。室溫放置4小時(shí)，輕輕搖動(dòng)。將玻片從戊二醛溶液中取出，3×SSC漂洗一次，去離子水沖洗兩次，離心甩干，室溫干燥。
B.引物和探針的合成探針一amino-5’-polyT(15nt)GCATGGACATCGACCCTTATAAAG-3’-TAMRA探針二Cy5-5’-GGAGCTACTGTGGAGTTACTC CTGG-3’上游引物gTTCAAgCCTCCAAgCTgTg下游引物TCAgAAggCAAAAAAgAgAgTAACT引物和探針均在上海博亞生物技術(shù)公司合成。
C.陣列的制作探針一溶于50％的DMSO中，終濃度為10μM。采用Cartesian的點(diǎn)樣儀(Cartesian Technologies，Inc.CA，USA)按照預(yù)先設(shè)定好的樣式點(diǎn)樣。將點(diǎn)好的玻片置于玻片盒中室溫放置過(guò)夜以干燥玻片。室溫下將玻片在0.2％的SDS中浸泡兩次，每次2分鐘，振動(dòng)。去離子水沖洗兩次，去離子水漂洗一次，離心甩干。把玻片轉(zhuǎn)移到NaBH4溶液(1.0g NaBH4溶于300ml 1×PBS中，再加入100無(wú)水乙醇)，室溫?fù)u床輕搖5分鐘。去離子水沖洗一次，去離子水漂洗兩次，每次1分鐘。離心甩干。
D.反應(yīng)腔的制作采用MJ Research(MJ Research，Inc.MA，USA)的自封閉腔(self seal chamber)來(lái)構(gòu)建反應(yīng)腔，具體的構(gòu)建過(guò)程按照產(chǎn)品的使用說(shuō)明，反應(yīng)腔覆蓋的芯片區(qū)域含有探針的點(diǎn)陣。
E.核酸擴(kuò)增和雜交PCR反應(yīng)體系的組成如下10mmol/L Tris-HCl(pH8.3 at 24℃)，50mmol/LKCl，1.5mmol/L MgCl2；0.5μmol/L的上游引物以及下游引物；1單位的Taq DNA聚合酶；200μmol/L的dNTPs(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)，0.1％的BSA，0.1％的吐溫20以及終濃度為2μmol/L的探針二；反應(yīng)的總體積為25μl.將配置好的體系加入D中所構(gòu)建的反應(yīng)腔中，用所料蓋片密封。PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)熱循環(huán)儀上進(jìn)行。采用如下的熱循環(huán)程序。預(yù)變性94℃，1minutes；主循環(huán)94℃，30秒鐘，55℃，30秒鐘，72℃，1分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃，10分鐘。PCR結(jié)束后，在同一PCR儀上，52℃，4小時(shí)進(jìn)行雜交反應(yīng)。
F.結(jié)果檢測(cè)最終的結(jié)果采用ScanArray 4000熒光掃描儀(GSI Lumonics，MA，USA)來(lái)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為543nm，選用激光器3，信號(hào)的檢測(cè)選用濾光片7，激光器和光電倍增管的功能的均選定80％，掃描的焦距根據(jù)不同玻片做適當(dāng)調(diào)整。檢測(cè)的程序遵照儀器的使用說(shuō)明。結(jié)果顯示芯片點(diǎn)陣上有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，同一點(diǎn)陣上的陰性對(duì)照探針?biāo)诘奈恢脛t只有較弱的熒光信號(hào)，同時(shí)未加入待測(cè)樣品的芯片亦只有較弱的熒光信號(hào)，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有乙型肝炎病毒的核酸。
實(shí)施例6、基于分子信標(biāo)的整合系統(tǒng)用于乙型肝炎病毒的檢測(cè)A.醛基化的芯片的制備將玻片浸泡于洗液中，室溫過(guò)夜。用自來(lái)水沖洗以洗凈玻片上的酸液，蒸餾水沖洗三次，去離子水漂洗一次，再用去離子水沖洗一次。離心甩干玻片。110℃，15分鐘，徹底干燥玻片。將玻片浸入1％APTES(異丙胺基-三乙氧基硅烷)的95％乙醇中。在室溫下用脫色搖床輕搖1小時(shí)。用95％乙醇清洗處理過(guò)的玻片。先沖洗一次，再漂洗一次。將洗凈的玻片放入真空干燥箱，抽真空至最大刻度(-0.08Mpa到-0.1Mpa)，關(guān)閉通氣閥，開始升溫，110℃，20分鐘。將涼至室溫的玻片浸泡于12.5％的戊二醛溶液(400ml 12.5％戊二醛溶液100ml 50％的戊二醛，300ml磷酸鹽緩沖液(1MNaH2PO4 30ml，2.628g NaCl)，調(diào)PH值到7.0))。室溫放置4小時(shí)，輕輕搖動(dòng)。將玻片從戊二醛溶液中取出，3×SSC漂洗一次，去離子水沖洗兩次，離心甩干，室溫干燥。
B.引物和探針的合成分子信標(biāo)探針5’-amino-TTTTT TTTTT TTTT CGTGC-GTTCAAGCCTCCAAGCTGTG-GCACG A-3’-TAMRA， 處標(biāo)記有熒光淬滅分子Dabcyl。
上游引物5’-GTTCAAGCCTCCAAGCTGTG-3’
下游引物5’-TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT-3’引物和探針均在上海博亞生物技術(shù)公司合成。
C.陣列的制作分子信標(biāo)探針溶于50％的DMSO中，終濃度為10μM。采用Cartesin的點(diǎn)樣儀(Cartesian Technologies，Inc.CA，USA)按照預(yù)先設(shè)定好的樣式點(diǎn)樣。將點(diǎn)好的玻片置于玻片盒中室溫放置過(guò)夜以干燥玻片。室溫下將玻片在0.2％的SDS中浸泡兩次，每次2分鐘，振動(dòng)。去離子水沖洗兩次，去離子水漂洗一次，離心甩干。把玻片轉(zhuǎn)移到NaBH4溶液(1.0g NaBH4溶于300ml 1×PBS中，再加入100無(wú)水乙醇)，室溫?fù)u床輕搖5分鐘。去離子水沖洗一次，去離子水漂洗兩次，每次1分鐘。離心甩干。
D.反應(yīng)腔的制作采用MJ Research(MJ Research，Inc.MA，USA)來(lái)構(gòu)建反應(yīng)腔，具體的構(gòu)建過(guò)程按照產(chǎn)品的使用說(shuō)明，反應(yīng)腔覆蓋的芯片區(qū)域含有探針的點(diǎn)陣。
E.核酸擴(kuò)增和雜交PCR反應(yīng)體系的組成如下10mmol/L Tris-HCl(pH8.3 at 24℃)，50mmol/LKCl，1.5mmol/L MgCl2；0.5μmol/L的上游引物以及下游引物；1單位的Taq DNA聚合酶；200μmol/L的dNTPs(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)，0.1％的BSA，0.1％的吐溫20；反應(yīng)的總體積為25μl。將配置好的體系加入D中所構(gòu)建的反應(yīng)腔中，用所料蓋片密封。PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)熱循環(huán)儀上進(jìn)行。采用如下的熱循環(huán)程序。預(yù)變性94℃，1minutes；主循環(huán)94℃，30秒鐘，55℃，30秒鐘，72℃，1分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃，10分鐘。PCR結(jié)束后，在同一PCR儀上，52℃，4小時(shí)進(jìn)行雜交反應(yīng)。
F.結(jié)果檢測(cè)最終的結(jié)果采用ScanArray 4000(GSI Lumonics，MA，USA)來(lái)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為543nm，選用激光器3，信號(hào)的檢測(cè)選用濾光片7，激光器和光電倍增管的功能的均選定80％，掃描的焦距根據(jù)不同玻片做適當(dāng)調(diào)整。檢測(cè)的程序遵照儀器的使用說(shuō)明。結(jié)果顯示芯片點(diǎn)陣上有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，同一點(diǎn)陣上的陰性對(duì)照探針?biāo)诘奈恢脛t只有較弱的熒光信號(hào)，同時(shí)未加入待測(cè)樣品的芯片亦只有較弱的熒光信號(hào)，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有乙型肝炎病毒的核酸。
實(shí)施例7、基于熒光淬滅的整合系統(tǒng)用于乙型肝炎病毒的檢測(cè)A.醛基化的芯片的制備將玻片浸泡于洗液中，室溫過(guò)夜。用自來(lái)水沖洗以洗凈玻片上的酸液，蒸餾水沖洗三次，去離子水漂洗一次，再用去離子水沖洗一次。離心甩干玻片。110℃，15分鐘，徹底干燥玻片。將玻片浸入1％APTES(異丙胺基-三乙氧基硅烷)的95％乙醇中。在室溫下用脫色搖床輕搖1小時(shí)。用95％乙醇清洗處理過(guò)的玻片。先沖洗一次，再漂洗一次。將洗凈的玻片放入真空干燥箱，抽真空至最大刻度(-0.08Mpa到-0.1Mpa)，關(guān)閉通氣閥，開始升溫，110℃，20分鐘。將涼至室溫的玻片浸泡于12.5％的戊二醛溶液(400ml 12.5％戊二醛溶液100ml 50％的戊二醛，300ml磷酸鹽緩沖液(1MNaH2PO4 30ml，2.628g NaCl)，調(diào)PH值到7.0))。室溫放置4小時(shí)，輕輕搖動(dòng)。將玻片從戊二醛溶液中取出，3×SSC漂洗一次，去離子水沖洗兩次，離心甩干，室溫干燥。
B.引物和探針的合成探針一amino-5’-polyT(15nt)GCATGGACATCGACCCTTATAAAG-3’-TAMRA探針三5’- CTTTATAAGGGTCG cct-3’， 處標(biāo)記有熒光淬滅分子Dabcyl。
上游引物GTTCAAGCCTCCAAGCTGTG下游引物TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT引物和探針均在上海博亞生物技術(shù)公司合成。
C.陣列的制作探針一溶于50％的DMSO中，終濃度為10μM。采用Cartesin的點(diǎn)樣儀(CartesianTechnologies，Inc.CA，USA)按照預(yù)先設(shè)定好的樣式點(diǎn)樣。將點(diǎn)好的玻片置于玻片盒中室溫放置過(guò)夜以干燥玻片。室溫下將玻片在0.2％的SDS中浸泡兩次，每次2分鐘，振動(dòng)。去離子水沖洗兩次，去離子水漂洗一次，離心甩干。把玻片轉(zhuǎn)移到NaBH4溶液(1.0g NaBH4溶于300ml 1×PBS中，再加入100無(wú)水乙醇)，室溫?fù)u床輕搖5分鐘。去離子水沖洗一次，去離子水漂洗兩次，每次1分鐘。離心甩干。
D.反應(yīng)腔的制作采用MJ Research(MJ Research，Inc.MA，USA)的self sealchamber來(lái)構(gòu)建反應(yīng)腔，具體的構(gòu)建過(guò)程按照產(chǎn)品的使用說(shuō)明，反應(yīng)腔覆蓋的芯片區(qū)域含有探針的點(diǎn)陣。
E.核酸擴(kuò)增和雜交PCR反應(yīng)體系的組成如下10mmol/L Tris-HCl(pH8.3 at 24℃)，50mmol/LKCl，1.5mmol/L MgCl2；0.5μmol/L的上游引物以及下游引物；1單位的Taq DNA聚合酶；200μmol/L的dNTPs(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)，0.1％的BSA，0.1％的吐溫20以及終濃度為2μmol/L的探針三；反應(yīng)的總體積為25μl。將配置好的體系加入D中所構(gòu)建的反應(yīng)腔中，用所料蓋片密封。PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)熱循環(huán)儀上進(jìn)行。采用如下的熱循環(huán)程序。預(yù)變性94℃，1minutes；主循環(huán)94℃，30秒鐘，55℃，30秒鐘，72℃，1分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃，10分鐘。PCR結(jié)束后，在同一PCR儀上，52℃，4小時(shí)進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后再30℃，5分鐘以使探針三與為雜交的探針一結(jié)合。
F.結(jié)果檢測(cè)最終的結(jié)果采用ScanArray 4000(GSI Lumonics，MA，USA)來(lái)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為543nm，選用激光器3，信號(hào)的檢測(cè)選用濾光片7，激光器和光電倍增管的功能的均選定80％，掃描的焦距根據(jù)不同玻片做適當(dāng)調(diào)整。檢測(cè)的程序遵照儀器的使用說(shuō)明。結(jié)果顯示芯片點(diǎn)陣上有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，同一點(diǎn)陣上的陰性對(duì)照探針?biāo)诘奈恢脛t只有較弱的熒光信號(hào)，同時(shí)未加入待測(cè)樣品的芯片亦只有較弱的熒光信號(hào)，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有乙型肝炎病毒的核酸。
權(quán)利要求
1.一種核酸分析芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，包括一個(gè)由具有生物相容性材料在基質(zhì)上構(gòu)建的可控腔體；所述基質(zhì)上固定有一種或多種與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的核酸探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述生物相容性材料是氣密性材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述生物相容性材料是通過(guò)膠合的方式連接在基質(zhì)上形成可控的密閉腔體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述生物相容性材料是通過(guò)微加工的方式構(gòu)建在基質(zhì)上形成可控的密閉腔體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述生物相容性材料包括塑料，玻璃，石英玻璃，陶瓷，橡膠，金屬，多聚物以及它們的任何組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述核酸探針的長(zhǎng)度是從是5到100堿基或5到100堿基對(duì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述核酸探針是被標(biāo)記的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述核酸探針的標(biāo)記包括放射標(biāo)記，熒光標(biāo)記，化學(xué)標(biāo)記，酶學(xué)標(biāo)記，發(fā)光標(biāo)記，熒光共振能量轉(zhuǎn)移以及分子信標(biāo)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述核酸探針是被修飾的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述核酸探針是通過(guò)一定的功能基團(tuán)而與基質(zhì)相連接。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述功能基團(tuán)為-CHO，-NH2，-SH或-S-S-。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述核酸探針是通過(guò)一個(gè)結(jié)合對(duì)與基質(zhì)相連接。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述結(jié)合對(duì)是生物素和親和素或生物素和鏈霉親和素。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述核酸探針是通過(guò)紫外線激活的交聯(lián)，熱激活的交聯(lián)，NH2和-CHO之間的反應(yīng)，-SH和-SH之間的反應(yīng)，生物素和親和素之間的結(jié)合，生物素與鏈霉親和素之間的結(jié)合而與芯片基質(zhì)相結(jié)合。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述核酸探針是特異性探針或兼并性探針。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述核酸探針是DNA、RNA、PNA、LNA或者它們的任意組合。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的檢測(cè)位點(diǎn)包含兩個(gè)核酸探針，第一條探針被固定在芯片的表面，并且?guī)в械谝环NFRET標(biāo)記，第二條探針處于液相環(huán)境中并帶有第二種FRET標(biāo)記。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述FRET標(biāo)記選自下列組合Fluroscein和TAMRA，TAMRA和Cy5，ROX和Cy5，IAEDNS和Fluroscein，或Fluroscein和QSY-7。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述兩條探針之間互補(bǔ)，并且第一條探針與目標(biāo)核酸互補(bǔ)，第一條探針與第二條探針之間形成的雜交體的Tm值比第一條探針和目標(biāo)核酸之間的雜交體的Tm低5℃到30℃，第一條探針上帶有熒光標(biāo)記，第二條探針上帶有與第一條探針上的熒光分子所對(duì)應(yīng)的淬滅分子。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述熒光標(biāo)記選自6-FAM、TET、HEX、Cy3、Cy5、Texas Red、ROX、Fluroscein或TAMRA；所述熒光淬滅標(biāo)記選自Dacyl、Black Hole-1、Black Hole-2或者直徑從0.1nm到10nm的膠體金顆粒。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)采用下列方式之一進(jìn)行核酸擴(kuò)增多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的擴(kuò)增(TMA)或滾環(huán)復(fù)制(RCA)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1或21所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)包括至少一套適合于一種擴(kuò)增方法的反應(yīng)緩沖液和其它試劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)包括一套核酸擴(kuò)增和核酸探針與目標(biāo)核酸之間雜交的試劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)包括一套從樣品中制備目標(biāo)核酸、擴(kuò)增目標(biāo)核酸并且進(jìn)行核酸探針和目標(biāo)核酸之間雜交的試劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)包括一套溫度控制設(shè)備。
26.根據(jù)權(quán)利要求1或25所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述溫度控制設(shè)備包括商用的PCR儀以及水浴。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)進(jìn)一步包括一套信號(hào)檢測(cè)設(shè)備。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述信號(hào)檢測(cè)設(shè)備是熒光成像系統(tǒng)。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，其特征在于所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)進(jìn)一步包括采用本系統(tǒng)進(jìn)行樣品制備，核酸擴(kuò)增或雜交的說(shuō)明。
30.一種核酸分析方法，包括1)往權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的可控封閉腔體中加入可能帶有目標(biāo)核酸的樣品；2)在封閉腔體中連續(xù)的從所述的樣品中制備所述的目標(biāo)核酸，或者擴(kuò)增所述的目標(biāo)核酸，在所述的目標(biāo)核酸和所述的核酸探針之間進(jìn)行雜交；3)進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種核酸分析芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)與應(yīng)用，目的是提供一種可將樣品制備、核酸雜交以及結(jié)果檢測(cè)整合、集成化的核酸分析芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)。本發(fā)明提供的核酸分析芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，包括一個(gè)由具有生物相容性材料在基質(zhì)上構(gòu)建的可控腔體；所述基質(zhì)上固定有一種或多種與目標(biāo)核酸互補(bǔ)的核酸探針。本發(fā)明還提供了一種的核酸分析方法，包括1)往權(quán)利要求1所述芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的可控封閉腔體中加入可能帶有目標(biāo)核酸的樣品；2)在封閉腔體中連續(xù)的從所述的樣品中制備所述的目標(biāo)核酸，或者擴(kuò)增所述的目標(biāo)核酸，在所述的目標(biāo)核酸和所述的核酸探針之間進(jìn)行雜交；3)進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)分析。本芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)和核酸分析方法可以用于與不同疾病，失調(diào)或者感染相關(guān)的病理樣品的分析。
文檔編號(hào)C40B40/06GK1526827SQ03105108
公開日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2003年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月3日
發(fā)明者陶生策, 程京, 馬雪梅, 張瓊, 周玉祥 申請(qǐng)人:清華大學(xué), 北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司