具有在至少兩個(gè)波長范圍之間的區(qū)分功能的高分辨率掃描顯微術(shù)的制作方法

本發(fā)明涉及一種用于對(duì)試樣進(jìn)行高分辨率掃描顯微成像的方法，其中，試樣利用照明輻射以如下方式受激發(fā)射熒光輻射，使得照明輻射集束到試樣中或試樣上的一點(diǎn)上，以形成受衍射限制的光斑，所述點(diǎn)受衍射限制地成像到對(duì)具有位置分辨能力的平面檢測器上的衍射圖中，其中，平面檢測器具有位置分辨能力，其對(duì)衍射圖的衍射結(jié)構(gòu)加以分辨，所述點(diǎn)相對(duì)于試樣以小于光斑直徑一半的步進(jìn)幅度推移到不同的掃描位置中，對(duì)平面檢測器進(jìn)行讀取，基于平面掃描器的數(shù)據(jù)以及基于對(duì)應(yīng)于上述數(shù)據(jù)的掃描位置產(chǎn)生試樣的圖像，所述圖像具有超出成像的分辨率極限地升高的分辨率。

本發(fā)明還涉及一種用于對(duì)試樣進(jìn)行高分辨率掃描顯微成像的顯微鏡，具有：用于容納試樣的試樣腔室，試樣能夠受激發(fā)射熒光輻射；具有處在試樣腔室中的焦平面和分辨率極限的光學(xué)器件；照明裝置，照明裝置具有用于輸送照明輻射的輸入端并且照明裝置借助于光學(xué)器件以如下方式以照明輻射照射試樣腔室，使得光學(xué)器件將照明輻射在焦平面內(nèi)的一個(gè)點(diǎn)上集束成受衍射限制的光斑；成像裝置，用于通過光學(xué)器件、受衍射限制地將焦平面內(nèi)的所述點(diǎn)成像到具有位置分辨能力的平面檢測器上的衍射圖中，具有位置分辨能力的平面檢測器處在與焦平面共軛的檢測器平面中，其中，平面檢測器具有對(duì)衍射圖的衍射結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的位置分辨率；用于將所述點(diǎn)以小于光斑直徑一半的步進(jìn)幅度推移到不同的掃描位置中的掃描裝置；用于讀取平面檢測器的評(píng)估裝置，用以基于平面掃描器的數(shù)據(jù)以及基于對(duì)應(yīng)上述數(shù)據(jù)的掃描位置來評(píng)估衍射圖的衍射結(jié)構(gòu)以及用以產(chǎn)生試樣的圖像，所述圖像具有超出分辨率極限地升高的分辨率。

背景技術(shù)：

用于研究生物樣品的光顯微術(shù)的傳統(tǒng)的應(yīng)用領(lǐng)域是照明顯微術(shù)。在此情況下，一定的染料(所謂的磷光劑或熒光劑)被用于特定標(biāo)記試樣，例如細(xì)胞部分。試樣利用代表激勵(lì)輻射的照明輻射照射，由此受激的發(fā)光輻射利用適當(dāng)?shù)臋z測器檢測得到。通過上述過程，可以在顯微鏡中顯示各個(gè)不同地染色的細(xì)胞部分。當(dāng)然也可以對(duì)樣品的多個(gè)部分同時(shí)利用不同的、特定地附著到樣品的不同結(jié)構(gòu)上的染料來染色。這種方法被稱為多重發(fā)光。也可以設(shè)置本身無需添加染料就能發(fā)光的試樣。

在這里，發(fā)光如通常所見那樣，被理解為磷光和熒光的上位概念，也就是檢測兩個(gè)過程。只要在這里提起熒光，這是以部分代表整體并且被理解為不受限制。

為了檢測試樣，同樣已知的是，應(yīng)用激光掃描顯微鏡(也簡稱LSM)，其借助于共焦檢測裝置(也被說成共焦LSM)或非線性的試樣相互作用(所謂的多光子顯微鏡)僅對(duì)處在物鏡的焦平面中的相應(yīng)平面成像。獲取光學(xué)切片，并且在試樣的不同深度中對(duì)多個(gè)光學(xué)切片進(jìn)行記錄，實(shí)現(xiàn)了：生成三維圖像，三維圖像由不同光學(xué)切片組合而成。由此，激光掃描顯微術(shù)適用于研究厚的樣品。當(dāng)然也可以應(yīng)用發(fā)光顯微術(shù)與激光掃描顯微術(shù)的組合方案，其中，借助于LSM在不同的深度平面中使發(fā)光試樣成像。

原則上，光學(xué)顯微鏡的光學(xué)分辨率(也就是LSM的分辨率)基于物理定律而受衍射限制。在這里，術(shù)語“高分辨率”被用于針對(duì)衍射極限的分辨率。

US5043570介紹了一種通過“過采樣(oversampling)”提供分辨率的試驗(yàn)。這種方案不能明顯改善顯微鏡衍射極限以下的分辨率。

借助于非線性的去布局()，能夠?qū)⒎直媛氏鄬?duì)于受衍射限制的共焦LSM提高至10倍。這種方法例如在US5866911中加以介紹。針對(duì)去布局，已知不同的方案，例如在DE4416558C2、US6633432或者DE10325460A1中加以介紹。

另一高分辨率的顯微成像方法在US5867604中提到，其中，物體被以周期性結(jié)構(gòu)掃描。類似的用于提高分辨率的方法在EP1157297B1中提到。結(jié)構(gòu)化的照明利用非線性的過程，例如熒光飽和。這種方案需要用于產(chǎn)生圖像的重構(gòu)算法并且將用于一個(gè)圖像的多幅照片進(jìn)行評(píng)估。

在寬場中實(shí)現(xiàn)高分辨率的方法由WO2006127692和DE102006021317已知。以PALM簡稱的方法(光激活光學(xué)顯微術(shù)(Photo Activated LightMicroscopy))使用標(biāo)記物質(zhì)，標(biāo)記物質(zhì)能夠借助于光學(xué)激活信號(hào)激活。僅在激活的狀態(tài)下，標(biāo)記物質(zhì)能夠利用激發(fā)輻射受激發(fā)出一定的熒光輻射。激活以如下方式執(zhí)行，至少一定子集的被激活的標(biāo)記分子與相鄰的被激活的分子以如下方式間隔，這些標(biāo)記分子以顯微術(shù)的光學(xué)分辨率測量的方式被區(qū)分開或者可以事后區(qū)分。在吸收發(fā)光輻射之后，針對(duì)分離的分子能夠獲得其以受分辨率限制為條件的輻射分布的中心，并且由此以相比于原來實(shí)現(xiàn)的光學(xué)成像更高的精度計(jì)算確定分子的位置。為了對(duì)整個(gè)試樣成像，通過引入激發(fā)輻射將子集的標(biāo)記分子加以區(qū)分、后續(xù)的激發(fā)和熒光輻射成像以如下時(shí)長重復(fù)，直至使盡可能所有標(biāo)記分子一次性在一個(gè)子集中獲得并且被分離。

其他高分辨率的方法在Hell的“Far-Field Optical Nanoscopy(遠(yuǎn)場光學(xué)顯微術(shù))”Science 316，1153-1158，2007中有所介紹。

這種方法和顯微鏡由EP2317362A1已知。涉及這種類型的文獻(xiàn)在其中圖5所示而且介紹的實(shí)施方式中，將對(duì)試樣受衍射限制的照明與平面檢測器相組合，其中，掃描裝置以如下方式設(shè)計(jì)，利用光斑照明的點(diǎn)的衍射圖以平面檢測器為基礎(chǔ)。這種結(jié)構(gòu)被稱為所謂的“共聚焦(de-scanned)”檢測結(jié)構(gòu)。這種檢測器結(jié)構(gòu)通常以如下方式實(shí)現(xiàn)，在照明裝置和成像裝置與試樣之間布置有掃描裝置，掃描裝置使光路轉(zhuǎn)向。這樣，這種掃描裝置作用于照明光斑，也作用于以照明光斑照亮的點(diǎn)的受衍射限制的成像，使得在成像裝置中，在掃描裝置之后，光路固定不動(dòng)。針對(duì)這種掃描裝置的可替換方案是能夠運(yùn)動(dòng)的試樣臺(tái)的應(yīng)用，試樣臺(tái)移動(dòng)試樣。這樣，衍射圖像靜止于平面檢測裝置上。在EP2317362A1的方案中，平面檢測器設(shè)有如下的位置分辨率，其與成像比例相關(guān)地實(shí)現(xiàn)衍射圖的過采樣，并且允許：對(duì)衍射圖的衍射結(jié)構(gòu)進(jìn)行采樣或者說解析。

EP2317362A1設(shè)置如下的實(shí)施方式，其中，可以進(jìn)行顏色分析。為此，設(shè)置有多個(gè)檢測器，所述檢測器處在相應(yīng)的光譜波道中，所述光譜波道由二色性分色器形成。這種方案對(duì)于激光掃描顯微術(shù)長期以來已經(jīng)已知。但這種方案具有缺陷，針對(duì)每個(gè)色彩波道需要設(shè)置具有相應(yīng)檢測器的相應(yīng)的分色器。在常規(guī)的激光掃描顯微術(shù)(其使用了在共焦孔板(所謂的小孔)后方的不具有位置分辨能力的檢測器)中，這種要求基本上沒有問題，在應(yīng)用根據(jù)EP2317362A1的過采樣的平面檢測器中，則明顯產(chǎn)生耗費(fèi)，這時(shí)，這種平面檢測器昂貴。此外，按照EP2317362A1的過采樣原理，多個(gè)平面檢測器必須彼此在亞像素水平上精確地校準(zhǔn)，因?yàn)榉駝t在各個(gè)色彩波道所產(chǎn)生的圖像之間顏色偏差，這種顏色偏差的原因在于，對(duì)于高分辨率的圖像，平面檢測器的數(shù)據(jù)被移動(dòng)到以小于光斑直徑的步進(jìn)量移動(dòng)的掃描位置中。僅當(dāng)平面檢測器在所有色彩波道中相對(duì)于光軸以亞像素水平的精度調(diào)校時(shí)，各個(gè)色彩波道的圖像才彼此匹配。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明的目的在于，以如下方式改進(jìn)開頭所述類型的方法或顯微鏡，使得能夠獲得顏色信息，同時(shí)針對(duì)多個(gè)色彩波道的調(diào)校耗費(fèi)被降低或者甚至省去。

按照本發(fā)明，所述目的利用一種用于對(duì)試樣進(jìn)行高分辨率掃描顯微成像的方法來實(shí)現(xiàn)，其中，試樣利用照明輻射以如下方式受激發(fā)射熒光輻射，使得照明輻射集束到試樣中或上的一點(diǎn)上，以形成受衍射限制的光斑，所述點(diǎn)受衍射限制地成像到對(duì)具有位置分辨能力的平面檢測器上的衍射圖中，其中，平面檢測器具有其對(duì)衍射圖的衍射結(jié)構(gòu)加以分辨的位置分辨能力，所述點(diǎn)相對(duì)于試樣以小于光斑直徑一半的步進(jìn)幅度推移到不同的掃描位置中，對(duì)平面檢測器進(jìn)行讀取，基于平面掃描器的數(shù)據(jù)以及基于對(duì)應(yīng)于上述數(shù)據(jù)的掃描位置產(chǎn)生試樣的圖像，所述圖像具有超出成像的分辨率極限的分辨率，為了對(duì)試樣的熒光輻射中的至少兩個(gè)預(yù)先確定的波長范圍加以區(qū)分，借助于光譜選擇性的元件在平面檢測器上針對(duì)至少兩個(gè)預(yù)先確定的波長范圍，產(chǎn)生相應(yīng)數(shù)量的衍射艾里斑，其沿側(cè)向彼此錯(cuò)開，使得衍射圖由彼此錯(cuò)開的衍射艾里斑構(gòu)成，衍射艾里斑完全處在平面檢測器上，在產(chǎn)生試樣圖像時(shí)，對(duì)衍射艾里斑加以評(píng)估。

所述目的還利用一種用于高分辨率掃描顯微成像的顯微鏡來實(shí)現(xiàn)，其具有：用于容納試樣的試樣腔室，試樣能夠受激發(fā)射熒光輻射；具有處在試樣腔室中的焦平面和分辨率極限的光學(xué)器件；照明裝置，照明裝置具有用于輸送照明輻射的輸入端并且照明裝置借助于光學(xué)器件以如下方式以照明輻射照射試樣腔室，使得光學(xué)器件將照明輻射在焦平面內(nèi)的一個(gè)點(diǎn)上集束成受衍射限制的光斑；成像裝置，用于通過光學(xué)器件、受衍射限制地將焦平面內(nèi)的所述點(diǎn)成像到具有位置分辨能力的平面檢測器上的衍射圖中，具有位置分辨能力的平面檢測器處在與焦平面共軛的檢測器平面中，其中，平面檢測器具有對(duì)衍射圖的衍射結(jié)構(gòu)進(jìn)行分辨的位置分辨能力或者說進(jìn)行解析的位置分辨率；用于將所述點(diǎn)以小于光斑直徑一半的步進(jìn)幅度推移到不同的掃描位置中的掃描裝置；用于讀取平面檢測器的評(píng)估裝置，用以基于平面掃描器的數(shù)據(jù)以及基于對(duì)應(yīng)上述數(shù)據(jù)的掃描位置來評(píng)估衍射圖的衍射結(jié)構(gòu)以及用以產(chǎn)生試樣的圖像，所述圖像具有超出分辨率極限的分辨率，顯微鏡為了區(qū)分試樣的熒光輻射中的至少兩個(gè)預(yù)先確定的波長范圍而具有光譜選擇性的元件，所述光譜選擇性的元件在平面檢測器上針對(duì)至少兩個(gè)預(yù)先確定的波長范圍產(chǎn)生相應(yīng)數(shù)量的衍射艾里斑，其沿側(cè)向彼此錯(cuò)開，使得衍射圖由彼此錯(cuò)開的衍射艾里斑構(gòu)成，平面檢測器和光譜選擇性的元件以如下方式設(shè)計(jì)，使得衍射艾里斑完全處在平面檢測器上，并且評(píng)估單元在產(chǎn)生試樣圖像時(shí)，對(duì)衍射艾里斑加以評(píng)估。

本發(fā)明僅利用一個(gè)平面檢測器同時(shí)實(shí)現(xiàn)了分辨率提升以及光譜圖像信息，方式為：衍射圖像在檢測器上被分為至少兩個(gè)彼此相互移位的衍射艾里斑。為此，使用光譜選擇性的元件。每個(gè)衍射艾里斑對(duì)應(yīng)一個(gè)波長范圍(也稱為色彩波道)。

由此，所述方法和所述顯微鏡實(shí)現(xiàn)了：區(qū)分至少兩個(gè)波長范圍。試樣的圖像以LSM常見的方式通過以所述點(diǎn)位對(duì)樣品加以采樣拍攝多幅分圖，這些分圖分別對(duì)應(yīng)其他采樣點(diǎn)、也就是其他采樣位置。

衍射艾里斑當(dāng)光束在圓形遮光邊上發(fā)生衍射時(shí)產(chǎn)生。衍射艾里斑顯現(xiàn)出中心，衍射艾里斑被輻射強(qiáng)度逐漸降低的環(huán)包圍。根據(jù)幾何光學(xué)器件的定律完美的顯微鏡本身(也就是無成像差錯(cuò))可以將一個(gè)點(diǎn)不精確地成像到一點(diǎn)上，而是通過光在孔徑上的衍射，僅成像為不明晰的光斑。這稱為受衍射限制的成像。相同的情況對(duì)于點(diǎn)的受衍射限制的照明適用。兩個(gè)點(diǎn)可以在傳統(tǒng)的輻射光學(xué)器件中根據(jù)所謂的瑞利判據(jù)來區(qū)分，這時(shí)，其在衍射圖中的成像最大值至少圍繞衍射艾里斑的半徑r彼此分離而置。光斑的形狀互反地依賴于孔徑的形狀，特別是其尺寸反過來與孔徑的尺寸成正比。衍射艾里斑的尺寸由第一類型貝塞爾函數(shù)的第一零位置得出，其零位置大致處于r＝0.6098處。衍射艾里斑(也就是中央衍射斑)根據(jù)英國天文學(xué)家喬治·比德爾·艾里(George Biddell Airy)的名字也稱為艾里斑。在掃描顯微術(shù)中，在照明時(shí)以及在成像時(shí)，由對(duì)光學(xué)器件的圓形輪廓所得的孔徑是圓形的。因?yàn)檠苌浒锇叩某叽邕€依賴于波長，所以艾里斑的尺寸在用來激發(fā)的、受衍射限制的照明中小于在發(fā)生斯托克斯移位的、也就是波長較長的熒光發(fā)光的情況中的尺寸。

術(shù)語“受衍射限制”應(yīng)當(dāng)在這里不限于根據(jù)阿貝理論的衍射極限，而是也可以涉及如下情況，其中，基于真實(shí)的缺陷或限制，理論上的最大值推薦約為20％。這樣，分圖也具有如下結(jié)構(gòu)，其在這里稱為衍射結(jié)構(gòu)。衍射結(jié)構(gòu)被過采樣。

為了能夠利用盡可能成本低廉的檢測器來工作，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中足夠的是，衍射艾里斑彼此相疊，但是并沒有完全重疊。在此，重疊區(qū)域應(yīng)當(dāng)優(yōu)選以如下方式設(shè)置，每個(gè)衍射艾里斑的中心處在其他衍射艾里斑之外。也就是說，對(duì)于兩個(gè)衍射艾里斑而言，其中心在平面檢測器上處于不被其他衍射艾里斑遮蓋的區(qū)域中。對(duì)于多個(gè)衍射艾里斑，這一點(diǎn)同樣適用。這種要求對(duì)于最多四個(gè)衍射艾里斑的情況而言，能夠很容易滿足。

檢測器尺寸可以保持得盡可能小，這時(shí)，光譜選擇性的元件在色譜上以如下方式設(shè)計(jì)，彼此相對(duì)錯(cuò)開的衍射艾里斑具有相同尺寸。這如上所述那樣，基于衍射艾里斑的與波長相關(guān)的尺寸僅以如下方式實(shí)現(xiàn)，光譜選擇性的元件執(zhí)行相應(yīng)的尺寸修正，尺寸修正將較長波長的波長范圍的衍射艾里斑相對(duì)于較短波長的衍射艾里斑縮小。當(dāng)這種色譜修正不成功時(shí)，對(duì)應(yīng)不同波長范圍的衍射艾里斑大小不同，這通過衍射艾里斑彼此并排沿側(cè)向移位優(yōu)選得到補(bǔ)償，以便將衍射艾里斑的中心分開，也就是所述中心不處在其他衍射艾里斑內(nèi)部。

對(duì)應(yīng)波長范圍的衍射艾里斑的產(chǎn)生可以按照不同方式實(shí)現(xiàn)。在第一變型中，光譜選擇性的元件或光譜分離在平面檢測器前面并且光路的照明輻射所經(jīng)過的部分中進(jìn)行。這樣，成像輻射通過直至光譜選擇性的元件的光路，在光譜選擇性的元件上，衍射圖被分成各個(gè)波長范圍衍射艾里斑。在第二變型中，光譜分離在照明或照明裝置中進(jìn)行，方式為：成像不涉及光譜分離。按照這種方式，試樣中的光斑已經(jīng)按照多個(gè)沿側(cè)向彼此錯(cuò)開的衍射艾里斑的形式產(chǎn)生。

在第一個(gè)提到的變型中，光譜分離僅影響到試樣的熒光反饋。在第二變型中，僅影響到試樣的熒光激發(fā)。由此，第一變型區(qū)分出以不同顏色發(fā)熒光的試樣的色彩波道。相反，第二變型分辨出試樣的在不同波長范圍中能夠被激發(fā)的組成部分。兩個(gè)變型意味著：光譜選擇性的元件處在一部分僅被成像裝置或照明裝置照射的光路中，而不是由二者一起照射。與此不同地，也可以考慮布置在光路的共同部分中的方案。

本發(fā)明的核心在于，波長范圍在空間上就衍射艾里斑在平面檢測器上的位置方面得到區(qū)分。因?yàn)樵谄矫鏅z測器上存在靜止圖像(所謂的解析結(jié)構(gòu))，所以與相應(yīng)的波長范圍(也稱為色彩波道)相對(duì)應(yīng)的衍射艾里斑的位置是已知的，當(dāng)產(chǎn)生圖像時(shí)，可能將同時(shí)拍攝的波長范圍混淆。按照這種方式，對(duì)多個(gè)色彩波道的同時(shí)拍攝利用唯一的平面檢測器就能實(shí)現(xiàn)。

因?yàn)樵诟鶕?jù)EP2317362A1的重構(gòu)方法中，基于以小于光斑尺寸的步進(jìn)幅度進(jìn)行掃描移位，針對(duì)試樣中的各個(gè)點(diǎn)存在多次測量，所以獲得了在需要列出而且解答的方程組中獲得超定的解，使得不僅針對(duì)各個(gè)點(diǎn)的位置表達(dá)和強(qiáng)度能夠以高分辨率給出，而且也能夠?qū)ΣㄩL范圍(也就是顏色)加以表達(dá)。

在本發(fā)明的特別有利的改進(jìn)方案中，彼此相對(duì)移位的衍射艾里斑的位置在所對(duì)應(yīng)的波長范圍方面能夠通過可調(diào)設(shè)計(jì)的光譜選擇性的元件來匹配。按照這種方式，色彩波道能夠以如下方式調(diào)整，使得所希望的波長范圍得以區(qū)分。

按照本發(fā)明的方案也可以按照并行的形式針對(duì)多個(gè)光斑同時(shí)執(zhí)行，這正如針對(duì)激光掃描顯微術(shù)已知那樣。這樣，試樣上的多個(gè)點(diǎn)位被掃描采樣，并且多個(gè)點(diǎn)位的分圖彼此并排靜止處在檢測平面中。后面的說明示例性集中在對(duì)單個(gè)點(diǎn)狀光斑的采樣。但這不應(yīng)理解為是限制，所闡釋的特征和原則在意義上也適用于并行采樣多個(gè)點(diǎn)狀光斑，正如針對(duì)線狀光斑所用那樣。后面的方案當(dāng)然僅橫向于線延伸受到衍射限制，使得說明的相關(guān)特征僅沿一個(gè)方向(橫向于線延伸)地適用。

試樣的所希望的區(qū)域的成像如在常見的LSM中那樣以掃描的方式實(shí)現(xiàn)。因?yàn)檎彰骱统上窕蛳鄳?yīng)的裝置具有共同的光學(xué)掃描裝置，所述光學(xué)掃描裝置將光斑導(dǎo)引通過試樣，同時(shí)再次與檢測器相關(guān)地解析與光斑重合的、在其上對(duì)試樣成像的點(diǎn)，所以可以將對(duì)焦光學(xué)器件設(shè)置在照明和成像裝置的共同部分中。對(duì)焦光學(xué)器件實(shí)現(xiàn)了：將衍射圖與平面檢測器的尺寸相匹配，并且附加地將能夠提供的照明輻射在無邊緣損耗的情況下完全耦合輸入到能夠通過選擇物鏡來改變的物鏡光瞳中。

分圖的衍射結(jié)構(gòu)的分辨率附加地實(shí)現(xiàn)了：獲知光斑的運(yùn)動(dòng)方向，沿著所述方向在采樣試樣期間移動(dòng)。運(yùn)動(dòng)方向雖然原則上由掃描裝置的結(jié)構(gòu)(例如掃描鏡或能夠運(yùn)動(dòng)的試樣臺(tái))已知，但是在這里獲得以機(jī)械為條件的殘余不精確性。這可以通過借助于互相關(guān)對(duì)檢測器陣列的各個(gè)像素信號(hào)加以評(píng)估來消除。在此，利用的是，被照明的點(diǎn)與彼此并排而置的圖像像素相關(guān)地在試樣中基于受衍射限制的成像按照一定程度相疊，但其中心不挨著設(shè)置。當(dāng)這種圖像像素的信號(hào)經(jīng)過互相關(guān)時(shí)，能夠降低或完全消除由于掃描機(jī)構(gòu)的不可避免的公差而存在的不精確度。

只要在這里介紹一種方法，控制裝置就在顯微鏡工作時(shí)實(shí)現(xiàn)方法步驟。

不言而喻的是，前面提到的而且后面還有闡釋的特征不僅用在所給出的組合中，而且也能夠以其他組合或者單獨(dú)使用，而不離開本發(fā)明的范圍。

附圖說明

下面，例如借助于也公開了對(duì)于本發(fā)明關(guān)鍵的特征的附圖詳細(xì)闡釋本發(fā)明。其中：

圖1示出用于高分辨率顯微成像的激光掃描顯微鏡的示意圖；

圖2示出在圖1的顯微鏡中所使用的平面檢測器的放大圖；

圖3至圖6示出衍射圖的圖示，衍射圖在圖1的顯微鏡工作時(shí)以不同的實(shí)施方式出現(xiàn)在平面檢測器上，以及

圖7示出照明衍射圖的圖示，其在照明試樣時(shí)能夠以圖1的顯微鏡的實(shí)施方式出現(xiàn)。

具體實(shí)施方式

圖1示意示出激光掃描顯微鏡1，激光掃描顯微鏡被設(shè)計(jì)用于對(duì)試樣2進(jìn)行顯微成像。激光掃描顯微鏡(在下面簡稱為LSM)由控制裝置C控制，并且包括照明光路3以及成像光路4。照明光路照亮試驗(yàn)2中的一個(gè)點(diǎn)位，成像光路4受衍射限制地對(duì)所述點(diǎn)位進(jìn)行成像，用以檢測。照明光路3和成像光路4共用一個(gè)光學(xué)器件。

試樣2的照明在LSM1中借助于所提供的激光光束5來實(shí)現(xiàn)，激光光束借助于未進(jìn)一步在功能上需要的轉(zhuǎn)向鏡6和透鏡7耦合輸入到鏡8上。鏡8負(fù)責(zé)將激光光束5以反射角透射到耦合輸入元件上，例如發(fā)射濾片9上。為了概覽圖示表達(dá)，針對(duì)激光光束5僅繪出其主軸。

當(dāng)在發(fā)射濾片9上發(fā)射之后，激光光束5借助于掃描裝置10雙軸偏轉(zhuǎn)，并且借助于透鏡11和12通過物鏡13作為受衍射限制的光斑14聚焦到試樣2中的焦平面29中。在此，光斑在圖1的圖示中呈點(diǎn)狀，但也可以是線狀的光斑。當(dāng)在成像裝置中又存在靜止的光束之后，在光斑14的位置(例如點(diǎn))上激發(fā)出的熒光輻射從焦平面29經(jīng)物鏡13、透鏡11和12再次導(dǎo)引至掃描裝置10。靜止的光束穿過發(fā)射濾片9投射，反射濾片在這里附加地具有如下功能，使光斑14中的熒光輻射在其波長方面得到選擇，激光光束5的例如能夠用作激發(fā)輻射的照明輻射被阻擋。透鏡16負(fù)責(zé)用于總體上將光斑14的位置成像到受衍射限制的衍射圖17中，所述衍射圖處在檢測平面18中。檢測平面18是焦平面29的共軛平面，在其中存在試樣2中的光斑14。

光斑14的衍射圖17在檢測平面18中由平面檢測器19拍攝，平面檢測器的示例實(shí)施方案在下面借助于圖2詳細(xì)闡釋。在這里重要的是，平面檢測器19在空間上對(duì)檢測平面18中的點(diǎn)位14的受衍射限制的圖像17進(jìn)行解析，也就是實(shí)現(xiàn)過采樣()。

控制裝置C控制LSM1的所有部件，特別是掃描裝置10和平面檢測器19?？刂蒲b置針對(duì)不同的掃描位置采集各個(gè)圖像17的數(shù)據(jù)，分析其衍射結(jié)構(gòu)并且產(chǎn)生試樣2的高分辨率的總圖。

圖1的LSM針對(duì)在試樣上采樣的唯一的光斑14示例示出。但也可以用于根據(jù)線形光斑進(jìn)行采樣，線形光斑例如垂直于圖1的圖頁平面延伸。同樣可行的是，圖1的LSM1以如下方式實(shí)施，多個(gè)彼此并排的點(diǎn)狀光斑在試樣中得到采樣。其相應(yīng)的衍射圖17則同樣彼此并排地處在檢測平面18中。平面檢測器19則相應(yīng)設(shè)計(jì)用于對(duì)檢測平面18中彼此并排的衍射圖17加以檢測。

平面檢測器19放大地在圖2中示出。平面檢測器由光導(dǎo)纖維束20構(gòu)成，光導(dǎo)纖維束對(duì)檢測器陣列24饋給。光導(dǎo)纖維束20由單光導(dǎo)纖維21構(gòu)成。光導(dǎo)纖維21的端部形成光導(dǎo)纖維束輸入端22，其處在檢測平面18中。光導(dǎo)纖維21的各個(gè)端部由此代表由其拍攝光斑14的衍射圖17的像素。因?yàn)楣獍?4在圖1的實(shí)施方式中例如為點(diǎn)狀點(diǎn)位，衍射圖17是艾里斑，艾里斑的伸展處在圖1和圖2中圖示出的檢測平面18的圓形內(nèi)部。需要指出的是，圖1在此方面獲得簡化。光導(dǎo)顯微術(shù)輸入端22的伸展如此大，使得由此遮蓋衍射圖的伸展。光導(dǎo)顯微術(shù)20中的各個(gè)光導(dǎo)纖維21在其輸出端上被設(shè)置為不同于光導(dǎo)纖維束輸入端22上的幾何布置方案，也就是呈縱向延伸的插頭23的形式，光導(dǎo)纖維21的輸出端方面的端部彼此并排地處在這種插頭中。插頭23與檢測器行24的幾何結(jié)構(gòu)相匹配地設(shè)計(jì)，也就是光導(dǎo)纖維21的每個(gè)輸出端方面的端部恰好處在檢測器行24的像素25前方。

需要指出的是，根據(jù)圖2的平面檢測器19的實(shí)施方案是純示例性的。原則上對(duì)于顯微鏡1足夠的是如下的平面顯微鏡19，這種平面顯微鏡在檢測器平面18中執(zhí)行對(duì)衍射圖17的過采樣，衍射圖在焦平面29中產(chǎn)生以照明點(diǎn)位14照明的點(diǎn)受衍射限制的成像。特別是可以在平面檢測器19中也指的是檢測平面18中矩形的檢測器平面，正如其在下面介紹的圖4至圖6中的情況那樣。

在顯微鏡1的說明中，迄今未提到元件15。其指的是光譜選擇性的元件，其布置在成像裝置4中或照明裝置3中。光譜選擇性的元件15在圖1的圖示中針對(duì)照明裝置3中的結(jié)構(gòu)僅虛線示出。在下面，首先對(duì)成型裝置4中光譜選擇性的元件15的作用和結(jié)構(gòu)加以闡釋。

在沒有光譜選擇性的元件15的情況下，在對(duì)利用光斑14照亮的點(diǎn)在焦平面29中受衍射限制地成像時(shí)，在所對(duì)應(yīng)的共軛檢測平面18中產(chǎn)生衍射圖17，衍射圖基于物鏡13的圓形的孔徑而是衍射艾里斑。這種衍射艾里斑的產(chǎn)生一般性地在說明書中已經(jīng)介紹。對(duì)于顯微術(shù)，如其在EP2317362A1中介紹那樣，通過的衍射圖17過采樣，對(duì)其結(jié)構(gòu)加以分析，在結(jié)合具有小于光斑14的最小尺寸的步進(jìn)幅度的掃描位置下，可以實(shí)現(xiàn)超越受衍射限制的成像的分辨率極限的結(jié)構(gòu)解析度。為了闡釋可以考慮對(duì)兩個(gè)在焦平面29中以受衍射限制的分辨率不能檢測到的緊密程度并排而置的部位進(jìn)行觀察。在利用小于(在理想實(shí)驗(yàn)中為圓形的)光斑的直徑的步進(jìn)幅度掃描光斑14時(shí)，首先兩個(gè)部位中的一個(gè)達(dá)到光斑14。該第一部位進(jìn)入光斑14越多，衍射圖17中的輻射強(qiáng)度就越大。光斑14基于其受衍射限制的特性而朝向中心強(qiáng)度增大。由此，衍射圖14中的輻射強(qiáng)度隨著所觀察的第一部位逐漸移入光斑14的中心而增大。當(dāng)光斑14的中心移位超出所觀察的部位時(shí)，該第一部位的輻射強(qiáng)度再次降低。當(dāng)理想設(shè)定的第二部位不相鄰時(shí)，衍射圖17中的輻射強(qiáng)度再度逐漸消失，其中，衍射圖17中輻射強(qiáng)度的升高和降低與光斑14的照明強(qiáng)度的分布(在考慮到步進(jìn)幅度和第一部位的熒光敏感性的情況下)具有精確的相關(guān)性。但因?yàn)檫@時(shí)第二部位緊密相鄰的存在，所以第二部位同樣有助于對(duì)衍射圖17的熒光輻射，具體來講，光斑14的中心距第二部位越近，輻射強(qiáng)度就越大。其他方面，針對(duì)第二部位恰適用針對(duì)第一部位的相同方案。這樣，針對(duì)步進(jìn)位置，在衍射圖17中的照明強(qiáng)度獲得不同于存在單獨(dú)的發(fā)熒光的部位的情況。通過評(píng)估平面檢測器19的數(shù)據(jù)以及顧及到當(dāng)前的掃描位置，則能夠以數(shù)學(xué)方法獲得：焦平面29中的兩個(gè)部位發(fā)熒光以及以多大間距發(fā)熒光，盡管這兩個(gè)利用受衍射限制的分辨率本身不能得到單獨(dú)分辨。在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方案中，為了評(píng)估平面檢測器19的數(shù)據(jù)，針對(duì)每個(gè)掃描位置列出包含多個(gè)未知數(shù)的方程，特別是包含焦平面29中的部位的強(qiáng)度和間距。通過多個(gè)掃描位置，獲得方程組，方程組是超定的并且允許：獲知輻射強(qiáng)度和間距，也就是由此也獲知發(fā)熒光的部位的位置。這在下面還要詳細(xì)闡釋。

高分辨率顯微成像的原理利用顯微鏡1在這里進(jìn)行如下展開：光譜選擇性的元件15在相對(duì)于焦平面29共軛的檢測平面18中以如下方式改變衍射圖17：針對(duì)兩個(gè)波長范圍(色彩波道)產(chǎn)生兩個(gè)彼此相對(duì)移位的衍射艾里斑。由此，作為衍射圖代表的是圖3中所示的情況。在示例標(biāo)繪為像素22的方形陣列的平面檢測器19上，兩個(gè)衍射艾里斑30、31彼此相對(duì)移位地設(shè)置，其中，其中一個(gè)衍射艾里斑30對(duì)應(yīng)于第一色彩波道，第二衍射艾里斑31對(duì)應(yīng)于第二色彩波道。色彩波道的波長極限通過光譜選擇性的元件來限定，光譜選擇性的元件因此在一個(gè)實(shí)施方式中與預(yù)先確定的色彩波道(波長范圍)相匹配地選定。衍射艾里斑30、31在一種實(shí)施方案中彼此相對(duì)以如下方式錯(cuò)位，使得其中心(通過大圓點(diǎn)標(biāo)示)處在相應(yīng)其他衍射艾里斑的相疊區(qū)域之外。

衍射艾里斑30和31的組合構(gòu)成衍射圖17，也就是衍射艾里斑在顯微成像期間在空間上不移動(dòng)。在根據(jù)EP2317362的顯微鏡中原來作為唯一的衍射艾里斑存在的衍射圖17在這時(shí)被兩個(gè)衍射艾里斑30和31替代。

當(dāng)再次理想地觀察兩個(gè)處在焦平面29中的、間隔緊密的部位時(shí)，這兩個(gè)部位利用受衍射限制的成像方式基本不能被分辨出來，在顯微鏡1中基于光譜選擇性的元件15調(diào)整出如下的表現(xiàn)，當(dāng)假設(shè)第一色彩波道中的第一部位與衍射艾里斑30相對(duì)應(yīng)地，并且第二色彩波道中的第二部位對(duì)應(yīng)衍射艾里31地，發(fā)出熒光：一旦光斑14檢測到第一部位，在衍射圖17中第一衍射艾里斑30就被照亮。相反，第二衍射艾里斑31還是暗的，因?yàn)橹灰诙课灰矝]被光斑14照亮，就沒有輻射在第二色彩波道中到達(dá)。衍射艾里斑30中的強(qiáng)度一直升高，直到第一部位被光斑14的中心檢測到。這樣，第一色彩波道的衍射艾里斑30中的強(qiáng)度最大。類似的情況下適用于衍射艾里斑31和第二色彩波道以及第二部位。這樣，在光斑14經(jīng)過所述兩個(gè)部位時(shí)，實(shí)現(xiàn)了第一衍射艾里斑30的變亮和變暗，以及第二衍射艾里斑31在時(shí)間上稍遲出現(xiàn)的變亮和變暗。

對(duì)平面檢測器19的數(shù)據(jù)在與掃描位置相組合下進(jìn)行的評(píng)估實(shí)現(xiàn)了：針對(duì)每個(gè)掃描位置列出方程，其不僅包含兩個(gè)部位的位置和熒光強(qiáng)度，還包括對(duì)第一還是第二部位在第一或第二色彩波道中(前提是對(duì)應(yīng)關(guān)系當(dāng)然是未知的)被照亮給出預(yù)判。通過多個(gè)掃描位置獲得超定的方程組，這實(shí)現(xiàn)了：也獲知發(fā)光的部位與兩個(gè)色彩波道的附加對(duì)應(yīng)關(guān)系。

按照這種方式，顯微鏡1和所對(duì)應(yīng)的顯微成像方法在高分辨率的圖中的兩個(gè)波長范圍(色彩波道)之間進(jìn)行區(qū)分，并且在無附加檢測器的情況下獲得雙色圖像。

需要指出的是，衍射艾里斑30和31的間距在顯微成像時(shí)保持恒定，特別是間距不表示顏色信息。其僅用于使衍射艾里斑30和31在空間上不完全重疊而置，因?yàn)檫@樣衍射艾里斑就區(qū)分不開了。

當(dāng)然也能夠以如下方式區(qū)分衍射艾里斑不發(fā)生交疊。但這樣就需要相對(duì)較大的檢測器。

衍射艾里斑30和31在光譜選擇性的元件15的實(shí)施方式中，如其針對(duì)圖3所用那樣，具有相同的直徑。但在說明書的通用部分中提到的是，衍射艾里斑的尺寸與波長相關(guān)。因此，可以實(shí)際預(yù)計(jì)出：較短波長的衍射光斑(例如衍射艾里斑30)必須具有比較長波長的衍射艾里斑(例如衍射艾里斑31)更大的直徑。這種情況也存在于圖4中。在圖3中，沒有給出這種情況，因?yàn)楣庾V選擇性的元件15在輻射被分光時(shí)產(chǎn)生色譜補(bǔ)償，這使得衍射艾里斑30和31盡管其色彩波道不同，也是一樣大的。

所介紹的方案不僅限于兩個(gè)波長范圍(色彩波道)的應(yīng)用。圖5示出具有第三色彩波道31的結(jié)構(gòu)，在圖6中葉存在第四色彩波道33。開頭所述的內(nèi)容在這里同樣類似適用。因此，多個(gè)色彩波道是可行的，因?yàn)榛诙鄠€(gè)掃描位置，所獲得的方程組以如下方式超定，可以說還有存在用于其他呈色彩波道類型的未知量的位置。

在迄今的介紹中，出發(fā)點(diǎn)在于，光譜選擇性的元件15處在成像裝置4中并且在那里是光路的一部分，其僅用于成像。換言之，光譜選擇性的元件5在本實(shí)施方式中不被照明輻射穿過。由光譜選擇性的元件15通過衍射艾里斑彼此相對(duì)移位而產(chǎn)生的色彩波道由此是發(fā)射熒光的試樣的色彩波道。顯微鏡或顯微成像方法的這種實(shí)施方式將熒光輻射在其波長范圍(色彩波道方面)做出區(qū)分。

但是，光譜選擇性的元件15也可以布置在照明裝置3中。這種結(jié)構(gòu)在圖1中以虛線示出。這樣，光譜選擇性的元件處在光路的僅被照明輻射穿過的區(qū)域中，由此其不影響成像，而是僅影響照明。這樣，光譜選擇性的元件15將光斑14分成兩個(gè)照明衍射艾里斑34、35，正如在圖7的圖示中所示那樣。由此，照明光路中的光譜選擇性的元件15給出了照明色彩波道，相反，光譜選擇性的元件15在成像光路中的布置產(chǎn)生了檢測色彩波道。由此，試樣不再被一個(gè)例如衍射艾里斑照亮，而是被兩個(gè)彼此錯(cuò)開的照明衍射艾里斑34和35照亮。這樣，由此也在平面檢測器19上獲得了如圖3中的情況，其中，衍射艾里斑30和31在這時(shí)不再對(duì)應(yīng)于熒光輻射的不同色彩波道，也就是試樣2的熒光應(yīng)答，而是對(duì)應(yīng)于激發(fā)的不同色彩波道，也就是試樣2的熒光敏感度。在其他方面，借助于圖3至圖6針對(duì)光譜選擇性的元件15在成像裝置4中的布置闡釋的所有變型同樣也能夠用于光譜選擇性的元件15在照明裝置3中的可替換的布置。但基于其他幾何位置，一般光譜選擇性的元件15的設(shè)計(jì)在成像裝置4的結(jié)構(gòu)中看起來不同于在照明裝置3中的結(jié)構(gòu)。原則上，可以針對(duì)光譜選擇性的元件，考慮多個(gè)具有色譜效果的元件，例如楔、棱鏡、反射鏡或雙合透鏡。

在針對(duì)上面提到的可替換方案的變型中，光譜選擇性的元件15可也可以設(shè)置在光路的在照明時(shí)以及在成像時(shí)都經(jīng)過的部分中，或者使用兩個(gè)光譜選擇性的元件15。按照這種方式可以在以一個(gè)波長同時(shí)激發(fā)兩種顏色時(shí)，抑制發(fā)生串道。附加地，獲得了針對(duì)校準(zhǔn)測量的可行方案。

在將光譜選擇性的元件15布置在照明裝置3中時(shí)，可以出現(xiàn)如下情況，在利用兩個(gè)或更多個(gè)色彩波道照明時(shí)，較短的照明波長在較長波長的照明所產(chǎn)生的熒光的波長范圍中產(chǎn)生熒光信號(hào)。結(jié)果是，其中一個(gè)結(jié)構(gòu)作為移位的陰影像再次出現(xiàn)。借助于適當(dāng)?shù)南嚓P(guān)計(jì)算，可以確定并去除陰影像部分。

根據(jù)圖3和圖4的實(shí)施方式示出：優(yōu)選的是，衍射艾里斑的移位沿著平面檢測器19的對(duì)角線進(jìn)行。因?yàn)檫@樣平面檢測器的面積能夠得到最大程度利用。

在使用具有如在圖2中示意示出的光導(dǎo)纖維的平面檢測器19時(shí)，優(yōu)選的是，以如下方式敷設(shè)纖維，使得兩個(gè)衍射艾里斑的不交疊的區(qū)域引導(dǎo)到彼此盡可能相鄰設(shè)置的檢測器元件上，也就是衍射艾里斑30的不相疊的區(qū)域被引導(dǎo)到第一組檢測器元件上，衍射艾里斑31的不相疊的區(qū)域被引導(dǎo)到第二組檢測器元件上，其中，這兩個(gè)組盡可能不相互交叉干擾。

為了更精確地闡釋方程組列出的數(shù)學(xué)分析，為了導(dǎo)入，首先考慮如下情況，僅出現(xiàn)一種顏色，也就是缺少光譜選擇性的元件15。當(dāng)人們以O(shè)(r)標(biāo)示物體，以E(r)標(biāo)示激發(fā)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)，以H(r)標(biāo)示檢測的PSF時(shí)，作為針對(duì)每個(gè)像點(diǎn)的信號(hào)D(r，p)獲得了下列方程式，其中r表示與光斑的位置p的間距：

關(guān)于位置p的傅里葉變換D(r，p)給出：

D(r，ω)＝O(ω)FT_r′{E(r′)H(r′+r)} (2)

實(shí)域中的乘積給出傅里葉域中卷積：

當(dāng)導(dǎo)入位置r上的支撐函數(shù)時(shí)：

EH(r，ω)＝FT_r′{E(r′)H(r′+r)} (4)

獲得方程(2)

D(r，ω)＝O(ω)EH(r，ω) (5)

平面檢測器上的不同的位置r借助于維納濾波器組合

其中，<|O(ω)|²>和<|n(ω)|²>是信號(hào)(“O”)和噪聲(n)信號(hào)的相應(yīng)的功率密度。已經(jīng)事先給出的是，針對(duì)多個(gè)在平面檢測器19的每個(gè)像素上混合的色彩波道，通過PSF給定的加權(quán)如下：

在該方程中，C是色彩波道技術(shù)下標(biāo)，方程(7)作為矩陣獲得：

[D(r，ω)]_r＝[O_c(ω)]_c[EH_c(r，ω)]_c，r (8)

當(dāng)顧及到附加的噪聲時(shí)，方程(8)設(shè)定為下式：

對(duì)象[O_c(ω)]_c可以借助于算符[G_c(r，ω)]_r，c獲得，該算符將頻率濾光與色彩波道分離組合起來：

如在對(duì)推導(dǎo)維納濾波器時(shí)，在這時(shí)必須將針對(duì)每個(gè)頻率和每個(gè)色彩波道重構(gòu)的和有效的對(duì)象之間的二次間距最小化：

由此，在應(yīng)用方程(9)的情況下獲得：

E|{[O_c(ω)]_c[EH_c(r，ω)]_c，r+[N(r，ω)]_r}[G_c(r，ω)]_r，c-[O_c(ω)]_c|²＝min (12)

在應(yīng)用與推導(dǎo)維納過濾器時(shí)相同的規(guī)則(本領(lǐng)域技術(shù)人員例如可以從http://en.wikipedia.org/wiki/Wiener_deconvolution獲得)的情況下，獲得：

其中，[I]_c和[σ²]_r是針對(duì)每個(gè)色彩波道和噪聲的信號(hào)的光譜功率密度：

[I]_c＝E|[O_c(ω)]_c|²；[σ²]_r＝E|[N(r，ω)]_r|² (14)

當(dāng)熒光發(fā)射光譜疊加時(shí)，可行的是，在一個(gè)色彩波道中，物體的陰影從另一色彩波道中出現(xiàn)。這種陰影圖被以與原本的色彩波道中的主圖相同的檢測PSF產(chǎn)生失真。由此，在波道c，O_c(ω)中檢測到的圖是與分配給不同的色彩波道的對(duì)象相對(duì)應(yīng)的圖的疊加：

在此，[M]_c是分離矩陣。對(duì)于例如兩種顏色，獲得的是：

當(dāng)真圖的混合矩陣[M]_c已知時(shí)，獲得真圖是容易的。如果不是這樣的話，真圖可以通過將所產(chǎn)生的圖的互相關(guān)最小化來獲得，也就是矩陣以如下方式確定：其數(shù)值針對(duì)最佳分離的對(duì)象確保最低程度的互相關(guān)。