鄰硝基苯甲醛降解酶、其編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于酶基因工程及酶工程領(lǐng)域，涉及一種鄰硝基苯甲醛降解酶、其編碼基因及其應(yīng)用。一種鄰硝基苯甲醛降解酶(NbaA酶)，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。所述的鄰硝基苯甲醛降解酶的編碼基因(基因nbaA)，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本發(fā)明通過(guò)克隆Pseudomonas?sp.ONBA-17中負(fù)責(zé)ONBA降解的脫氫酶基因并表達(dá)，獲得了ONBA降解酶，為ONBA的降解提供有效的生物降解手段，對(duì)于ONBA污染環(huán)境的修復(fù)具有重要意義。本發(fā)明得到的NbaA酶對(duì)ONBA的酶活力為2442U／mg，分別是NahF酶活力(552U／mg)和NahV酶活力(245U／mg)的442.4％和996.7％，顯著強(qiáng)于二者。而nbaA同nahF和nabV的序列同源性分別為62％和89％。由上可知，基因序列的不同引發(fā)了酶的空間構(gòu)象的差異，并最終致使酶作用能力產(chǎn)生差異。
【專利說(shuō)明】鄰硝基苯甲醛降解酶、其編碼基因及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶基因工程及酶工程領(lǐng)域，涉及一種鄰硝基苯甲醛降解酶、其編碼基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程的加快，有機(jī)工業(yè)合成廢水的排放量越來(lái)越大。有機(jī)工業(yè)合成廢水是指在生產(chǎn)過(guò)程中排放的含有對(duì)生物體有毒的工業(yè)廢水，這類廢水不僅含大量有機(jī)物，且存在大量對(duì)生物體有毒害作用的物質(zhì)，已對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，威脅到人類生命健康。參照急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，鄰硝基苯甲醛(o-nitoobenzaldehyde，0NBA)為中等毒性化合物。ONBA是重要的精細(xì)有機(jī)化工中間體，廣泛用于醫(yī)藥、染料和有機(jī)合成，如用于合成抗心絞痛藥物硝基吡啶(心痛定)、鄰硝基苯乙烯類及鄰硝基肉桂酸類系列產(chǎn)品等。將其硝基還原成氨基后，所得到的鄰氨基苯甲醛還可用于喹啉類化合物的合成，其工業(yè)需求量十分大。但由于其生產(chǎn)過(guò)程伴隨著大量污染物質(zhì)的產(chǎn)生，發(fā)達(dá)國(guó)家已將其生產(chǎn)線轉(zhuǎn)移到發(fā)展中國(guó)家(污染轉(zhuǎn)移)，這一點(diǎn)在我國(guó)東南部地區(qū)尤為明顯。具不完全統(tǒng)計(jì)，東南地區(qū)年產(chǎn)鄰硝基苯甲醛在70萬(wàn)噸以上，且絕大多數(shù)生產(chǎn)廢水未經(jīng)處理就直接排放，對(duì)周邊環(huán)境造成了極大的損害。在一定程度上，可以說(shuō)這一點(diǎn)源污染已成為面源污染。[0003]目前，關(guān)于ONBA降解酶編碼基因及其應(yīng)用的報(bào)道極為有限。在趙化冰等人的研究中(趙化冰，李永君，陳威，蔡寶立.惡臭假單胞菌ND6菌株中與萘降解相關(guān)的新型水楊醛脫氫酶NahV.科學(xué)通報(bào)，2007，52:1257-1262)，他們獲得了與ONBA降解相關(guān)的新型水楊醛脫氫酶NahV及其編碼基因，并將其同NahF進(jìn)行了比較。然而，無(wú)論是nahV基因，還是nahF基因，其編碼蛋白酶活力均較為有限，且NahV酶活力在較高溫度(如:50°C )會(huì)很快喪失。因而，尋找能夠編碼更高ONBA代謝酶活力并具備熱穩(wěn)定性蛋白的功能基因就顯得十分必要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鄰硝基苯甲醛降解酶(NbaA酶)。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供該鄰硝基苯甲醛降解酶的編碼基因(基因nbaA)。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:
[0007]一種鄰硝基苯甲醛降解酶(NbaA酶)，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述的鄰硝基苯甲醛降解酶的編碼基因(基因nbaA)，其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0009]所述的鄰硝基苯甲醛降解酶在降解鄰硝基苯甲醛中的應(yīng)用。
[0010]作為優(yōu)選，應(yīng)用所述鄰硝基苯甲醛降解酶降解鄰硝基苯甲醛時(shí)，溫度為18-40°C，pH 為 6.0-8.5。
[0011]擴(kuò)增所述的鄰硝基苯甲醛降解酶的編碼基因的引物，其核苷酸序列分別為SEQ IDN0.3 和 SEQ ID N0.4。[0012] 含有本發(fā)明所述基因的重組載體。
[0013]含有本發(fā)明所述基因的重組菌。
[0014]含有以上任一所述基因的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015]本發(fā)明通過(guò)克隆Pseudomonas sp.0NBA-17中負(fù)責(zé)ONBA降解的脫氫酶基因并表達(dá)，獲得了 ONBA降解酶，為ONBA的降解提供有效的生物降解手段，對(duì)于ONBA污染環(huán)境的修復(fù)具有重要意義。該菌是假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)的菌株0NBA-17,于2013年9月2日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCC N0.8095。保藏單位的地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所，該菌的分類命名為假單胞菌 Pseudomonas sp.。
[0016]本發(fā)明得到的NbaA酶對(duì)ONBA的酶活力為2442U / mg,分別是NahF酶活力(552U / mg)和 NahV 酶活力(245U / mg)的 442.4%和 996.7%，顯著強(qiáng)于二者。而 nbaA同nahF和nahV的序列同源性分別為62%和89%。由上可知，基因序列的不同引發(fā)了酶的空間構(gòu)象的差異，并最終致使酶作用能力產(chǎn)生差異。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1 是 Pseudomonas sp.0NBA-17 總 DNA(Genomic DNA)電泳檢測(cè)圖。
[0018]圖2是不同處理土壤樣品中ONBA含量變化曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0020]在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本行業(yè)常用的。
[0021]實(shí)施例1Pseudomonas sp.0NBA-17 總 DNA (Genomic DNA)的提取
[0022]1.1Pseudomonas sp.0NBA-17 的擴(kuò)大培養(yǎng)
[0023]在無(wú)菌操作環(huán)境下，將_70°C保存的Pseudomonas sp.0NBA-17以接種針挑取小塊，放置、涂布于Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基之上。28°C，靜置培養(yǎng)3d。挑選單菌落，經(jīng)2次轉(zhuǎn)接，觀察發(fā)現(xiàn)平板上菌落形態(tài)一致(無(wú)雜菌)。這里所述的“平板”和Luria-Bertani (LB)固體/液體培養(yǎng)基等均為微生物研究/生產(chǎn)領(lǐng)域常見術(shù)語(yǔ)、培養(yǎng)基、技術(shù)和方法，具體參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克，等著.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)[M].黃培堂，等譯.北京:科學(xué)出版社，2008)。下文中如無(wú)特別備注或說(shuō)明，均為微生物研究常用技術(shù)、方法、培養(yǎng)基、試劑和藥品，且均在《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中有所記錄。
[0024]1.2Pseudomonas sp.0NBA-17 總 DNA 的提取
[0025]菌體總DNA的提取采用SDS高鹽沉淀法。挑取LB平板上的單菌落，接至IOOmL的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至穩(wěn)定期。離心收集菌體，加等體積的TEN溶液[IOmM Tris-Cl (pH8.0)，I mnM EDTA(pH8.0),0.1M NaCl]洗滌菌體，離心收集菌體，懸浮于IOmL TE[IOmMTris-Cl (pH8.0), ImM EDTA (pH8.0)]溶液中，加入 100 y L 溶菌酶(IOOmg / mL)，37°C水浴lh，加入 40ii L 蛋白酶 K(20mg / mL)，再加入 300 y L20% (w / v% )的 SDS，37°C水浴過(guò)夜(約12h)。加入I / 2體積飽和NaCl劇烈振蕩，12000g離心20min，上清用等體積酚:氯仿抽提2次，12000g離心lOmin，收集上清，加入等體積TE溶液(稀釋調(diào)整NaCl濃度)，
0.6倍體積異丙醇沉淀，12000g離心15min，70% (v / v% )乙醇洗滌沉淀，乙醇揮發(fā)后溶于 100μ L TE 中。
[0026]將提取到的菌體總DNA適當(dāng)稀釋后，經(jīng)0.75% (w / v% )瓊脂糖電泳檢測(cè)其質(zhì)量(如圖1所示)，發(fā)現(xiàn)所提取的總DNA大部分集中在23kb左右，基本上沒(méi)有RNA存在，純度較好，濃度較高。
[0027]實(shí)施例20NBA降解酶編碼基因nbaA的獲得
[0028]經(jīng)過(guò)大量的分析實(shí)驗(yàn)，從40對(duì)自行設(shè)計(jì)的引物中篩選出一對(duì)有效擴(kuò)增引物(分別記為 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4)。
[0029]nbaA-f，5’ -ACGACCATATGAAGGTACAACTGGTGAT-3?(下劃線為 NdeI 酶切位點(diǎn)，基因序列為 SEQ ID N0.3)；
[0030]nbaA-r，5’ -CATCAAAGCTTGAAGGGATAAGGCTGGCC-3’(下劃線為 HindIII 酶切位點(diǎn)，基因序列為SEQID N0.4)。
[0031]25 μ L 擴(kuò)增體系:10 X Taq DNA 聚合酶反應(yīng)緩沖液 2.5 μ L ;dNTP (25mM) 2 μ L ;引物(25pmol / μ L)各 0.5 μ L ；Mg2+ 緩沖液(25mM) 2.5 u L ;實(shí)施例1 中所得總 DNA0.5 y L (約IOOng) ;Taq 酶(5U / u L)0.3u L ；ddH2016.2 u L0 反應(yīng)參數(shù):95°C 預(yù)變性 5min，94°C 變性30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸25 個(gè)循環(huán)，最后 72°C終延伸 5min。
[0032]擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.75% (w / v%)瓊脂糖電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段與預(yù)期大小(1.4kb左右)相符。切取含有nbaA基因擴(kuò)增片段的凝膠，放入無(wú)菌1.5mL離心管中稱重，使用B10MIGA膠回收純化試劑盒進(jìn)行目的片段回收，4°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0033]參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，用Nde I和HindIII消化上述回收片段，再將片段插入到用上述同種內(nèi)切酶消化過(guò)的pET21b(+)載體中。挑取質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證插入片段后，挑取克隆子交上海生工測(cè)序。所得nbaA編碼基因序列如SEQ ID N0.2所示(由1446個(gè)核苷酸組成)，其相應(yīng)氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示(482個(gè)氨基酸組成)。基因序列比對(duì)先是登錄美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站，再經(jīng)BLAST搜索引擎搜尋GenBank完成。結(jié)果顯示，同nbaA編碼基因序列同源的功能基因最高序列同源性僅為90% (GQ848198.1)，且GQ848198.1指代基因未見其關(guān)于ONBA降解的報(bào)道。而同NbaA氨基酸序列同源的蛋白(水楊醛脫氫酶，YP_006536128.1)最高序列同源性不足90 %，且YP_006536128.1指代蛋白未見其關(guān)于ONBA降解的報(bào)道。
[0034]實(shí)施例3表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)與純化
[0035]用NdeI和HindIII消化上述實(shí)施例2中的nbaA基因擴(kuò)增產(chǎn)物，再將片段插入到用上述同種內(nèi)切酶消化過(guò)的pET21b(+)載體中。在重組質(zhì)粒中，nbaA基因由17啟動(dòng)子啟動(dòng)，表達(dá)產(chǎn)物C端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，氨芐青霉素為篩選標(biāo)記。聯(lián)入片段經(jīng)上海生工測(cè)序驗(yàn)證，以確保PCR過(guò)程中沒(méi)有引入突變。
[0036]重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Esoherichia coli BL21 (DE3)，隨后挑取含有重組質(zhì)粒的菌株(編號(hào)為K-7)，經(jīng)上海生工測(cè)序驗(yàn)證外源基因?qū)肭闆r，證實(shí)外源基因?qū)氤晒Α?br>
[0037]K-7用LB培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)，待A6tltlnm值為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度1mM，隨后于20°C過(guò)夜表達(dá)，以避免包涵體產(chǎn)生。離心收集細(xì)胞，重懸于80mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.5)，在冰水浴中超聲(功率為400W)破碎細(xì)胞——超聲波破碎5s，暫停15s，共進(jìn)行60個(gè)循環(huán)。隨后，于4°C，10000g離心30min去除細(xì)胞碎片。上清液即為粗酶提取液，低溫保存。該步驟實(shí)驗(yàn)進(jìn)行同時(shí)，設(shè)置未轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的E.coli BL2KDE3)作為對(duì)照，并同樣進(jìn)行誘導(dǎo)、離心、破碎和收集粗酶提取液等步驟。
[0038]使用一站式組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(N1-NTA Spin Kit，QIAGEN)對(duì)上述粗酶提取液進(jìn)行純化，獲得純化酶液樣本(其中鄰硝基苯甲醛降解酶的純酶含量為3.5mg /mL)，所有操作均在低溫環(huán)境下進(jìn)行。
[0039]實(shí)施例4NbaA蛋白對(duì)ONBA的作用效果
[0040]參照趙化冰等人研究(趙化冰，李永君，陳威，蔡寶立.惡臭假單胞菌ND6菌株中與萘降解相關(guān)的新型水楊醛脫氫酶NahV.科學(xué)通報(bào)，2007，52:1257-1262)，采用上述實(shí)施例3中的純化酶液樣本，向0.5mL的反應(yīng)體系(含80mM的磷酸鈉緩沖液，200 y M的NAD+，pH7.5，25°C)中加入終濃度為200iiM的ONBA作為反應(yīng)底物，并測(cè)定NbaA酶活力。一個(gè)酶活力單位(U)定義為:25°C條件下，每分鐘還原Iumol NAD+所需的酶量。比活力表示為每毫克蛋白的酶活力單位。蛋白濃度以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)參照，通過(guò)Bradf ord法測(cè)定。ONBA含量測(cè)定參照Yu等人報(bào)道進(jìn)行(Yu Fang-Bo, Shen Biao, Li Shun-Peng.1solation and characterization of Pseudomonas sp.strain 0NBA-17degradingo-nitriobenzaldehyde.Current Microbiology，2006，53:457-461)。
[0041]結(jié)果顯示，上述純化酶液樣本對(duì)ONBA的酶活力為2442U / mg (該值為5次實(shí)驗(yàn)重復(fù)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.6U / mg)，對(duì)照(實(shí)施例3中提到的未轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒E.coliBL21的粗酶提取純化物)無(wú)ONBA降解能力，這也進(jìn)一步證實(shí)了實(shí)施例2中所得基因片段的功能作用。較已有報(bào)道，本發(fā)明得`到的NbaA酶活力分別是NahF酶活力(552U / mg)(該值為5次實(shí)驗(yàn)重復(fù)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2U / mg)和NahV酶活力(245U / mg)(該值為5次實(shí)驗(yàn)重復(fù)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6U / mg)的442.4%和996.7%，顯著強(qiáng)于二者。而nbaA同nahF和nahV的序列同源性分別為62 %和89 %。由上可知，基因序列的不同引發(fā)了酶的空間構(gòu)象的差異，并最終致使酶作用能力產(chǎn)生差異。
[0042]將純化酶液樣本在50°C水浴30min后，再通過(guò)上述方法測(cè)定酶活力。結(jié)果表明，在較高溫度下NbaA比NahF和NahV更穩(wěn)定。在50°C保溫30min后，NbaA仍保持了 88.4%的酶活力(該值為4次實(shí)驗(yàn)重復(fù)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6% )，而NahF和NahV僅保存了
71.4% (該值為4次實(shí)驗(yàn)重復(fù)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7% )和11.2% (該值為4次實(shí)驗(yàn)重復(fù)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%)的酶活力，差異顯著。
[0043]實(shí)施例5鄰硝基苯甲醛降解酶在降解鄰硝基苯甲醛中的應(yīng)用
[0044]在體積為IL的80mM磷酸鈉緩沖液(pH值7.5)中加入實(shí)施例3中制備的純化酶液樣本20mL，并添加氯化鎂，使其終濃度達(dá)0.2mM,制成酶制劑。
[0045]采集ONBA生產(chǎn)廠家周邊有ONBA污染史的土壤，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)勻化等步驟后，測(cè)定其中的ONBA殘留量。結(jié)果顯示，所采土壤樣品中ONBA殘留量為48.5mg / kg。將所采樣品，均分成3份，每份3個(gè)處理。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:I號(hào)處理。僅為采集土樣，噴施等量清水并攪拌均勻，土樣終含水率控制在60% ;2號(hào)處理。向所采集土樣中噴施如上所述的酶制劑，并攪拌均勻，土樣終含水率控制在60% ;3號(hào)處理。向所采集土樣中噴施未添加氯化鎂的上述酶制劑，并攪拌均勻，土樣終含水率控制在60%。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，按照固定時(shí)間間隔(6h)采樣，并分析土壤中ONBA的殘留情況。結(jié)果如圖2所示，添加酶制劑處理(2和3號(hào)處理)較對(duì)照處理(I號(hào)處理)土樣中ONBA去除速率提升顯著。而2號(hào)同3號(hào)處理相比，其ONBA去除速率又顯著提升。2號(hào)處理土樣中的0NBA，在添加酶制劑后30h實(shí)現(xiàn)了對(duì)ONBA的完全去除(低于檢測(cè)限)，而同時(shí)期I和3號(hào)處理ONBA殘留分別為47.2和18.2mg / kg,差異達(dá)顯著水平。
[0046]應(yīng)用所述鄰硝基苯甲醛降解酶降解鄰硝基苯甲醛時(shí)，反應(yīng)溫度為18-40°C，pH為
6.0-8.5，可實(shí)現(xiàn)對(duì)鄰硝基苯甲醛的有效降解。
[0047]以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所 記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
【權(quán)利要求】
1.一種鄰硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的鄰硝基苯甲醛降解酶的編碼基因，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
3.權(quán)利要求1所述的鄰硝基苯甲醛降解酶在降解鄰硝基苯甲醛中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用權(quán)利要求1所述鄰硝基苯甲醛降解酶降解鄰硝基苯甲醛時(shí)，溫度為18-40°C，pH為6.0-8.5。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求2所述的鄰硝基苯甲醛降解酶的編碼基因的引物，其核苷酸序列分別為 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4。
6.含有權(quán)利要求2所述基因的重組載體。
7.含有權(quán)利要求2所述 基因的重組菌。
【文檔編號(hào)】A62D101/28GK103484437SQ201310454252
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】虞方伯, 單勝道, 管莉菠, 駱林平, 葉正錢 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)