專利名稱：一株具有熒蒽降解能力的耐鹽堿產(chǎn)吲哚乙酸菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物，說涉及一株具有熒蒽降解能力的耐鹽堿產(chǎn)吲哚乙酸菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在土壤中許多微生物能夠溶解難溶態(tài)磷，促進(jìn)植物對(duì)磷的吸收，增加作物產(chǎn)量和改善作物品質(zhì)，將解磷微生物作為生物肥料，不但可以提高土壤中磷的利用效率，節(jié)肥增產(chǎn)，而且可改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量。植物促生菌(Plant Growth PromotingBacteria,簡(jiǎn)稱PGPB)被界定為在一定條件下有利于植物生長(zhǎng)的自由生活在土壤、根際、根表、葉際的細(xì)菌。這些細(xì)菌能夠固氮、溶磷、溶鐵，并產(chǎn)生植物激素，如生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素和乙烯。此外，它們還能提高植物的抗逆性，包括干旱、高鹽堿、重金屬和有機(jī)污染物毒害。但現(xiàn)在大部分植物促生菌還未被馴化成能有效提高植物各種抗逆性的菌株，因此從植物根際土中分離得到能有效提高植物各種抗逆性的植物促生菌成為熱點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種蠟狀芽孢桿菌，能高效產(chǎn)吲哚乙酸并能在高鹽堿條件生長(zhǎng)且能利用難溶性磷酸鹽為磷源進(jìn)行生長(zhǎng)，并對(duì)多環(huán)芳烴熒蒽具有一定的降解效果。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)；
本發(fā)明的一種蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus ZZ13)，于2013年3月15日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，分類名為蠟狀芽孢桿菌(BacillusCereus)，保藏號(hào) CGMCC N0.7322。所述蠟狀芽孢桿菌菌落較小為淡黃色、隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，不透明，不規(guī)則桿狀排列，產(chǎn)芽孢。所述蠟狀芽孢桿菌的生理生化特性是:革蘭氏陽性，嚴(yán)格好氧，化能異養(yǎng)，接觸酶陽性，M.R和VP試驗(yàn)陰性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，硝酸鹽還原陽性，檸檬酸鹽利用陰性。本發(fā)明所述的蠟狀芽孢桿菌培養(yǎng)時(shí)使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、谷氨酸；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖；使用的無機(jī)組分包括但不限于氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸三鈣、二水氯化鈣、七水合硫酸鎂、七水合硫酸亞鐵。本發(fā)明的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵可在20 35°C，pH6 10的環(huán)境下進(jìn)行。本發(fā)明所述的蠟狀芽孢桿菌分泌吲哚乙酸(IAA)的能力強(qiáng)，在30°C、180r/min搖床培養(yǎng)條件下24h其轉(zhuǎn)化IAA能力達(dá)46.67 μ g.ml/1。吲哚乙酸是植物激素的一種，能夠促進(jìn)根的發(fā)育。產(chǎn)吲哚乙酸的菌種，往往附著在植物根系或葉表面，利用植物代謝產(chǎn)生分泌物的同時(shí)產(chǎn)生IAA和少量GA3等植物激素來影響植物的生理過程和形態(tài)變化。表現(xiàn)為直接促進(jìn)根的伸長(zhǎng)，從而增大了與土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸的機(jī)會(huì)；可提高植物體內(nèi)源IAA的含量；誘導(dǎo)植物防衛(wèi)基因的表達(dá)，提高植物體抗病，抗旱等抗逆性。作為本發(fā)明的優(yōu)化方案，所述蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵在溫度為28°C、pH6 10下進(jìn)行，該環(huán)境下產(chǎn)IAA量最高。作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，所述蠟狀芽孢桿菌采用的碳源為甘露醇，采用的氮源為酵母粉或蛋白胨或兩者的組合。利用上述碳源和氮源制得的培養(yǎng)基，培育出的蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)IAA的量最高。本發(fā)明所述的蠟狀芽孢桿菌可以在高鹽堿度條件下進(jìn)行生長(zhǎng)并產(chǎn)IAA。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下，所述蠟狀芽孢桿菌可以在pH為10.5的條件下生長(zhǎng)且產(chǎn)IAA，并可以在LB培養(yǎng)基含鹽度為7%的條件下生長(zhǎng)，在含鹽度為4%時(shí)可產(chǎn)Ikk0本發(fā)明所述的蠟樣芽孢桿菌以難溶性磷酸鹽為磷源進(jìn)行生長(zhǎng)，并將其轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸鹽。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下，所述蠟狀芽孢桿菌對(duì)磷酸三鈣的轉(zhuǎn)化量達(dá)148.09mg.1/1。相對(duì)于空白對(duì)照的結(jié)果，所述蠟狀芽孢桿菌對(duì)磷酸三鈣的轉(zhuǎn)化量比空白對(duì)照高出
110.66mg.L_1o本發(fā)明所述的蠟樣芽孢桿菌多環(huán)芳烴熒蒽具有一定的降解效果。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下，所述蠟狀芽孢桿菌在熒蒽初始濃度為SOmg.!/1的無機(jī)鹽培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)7d后降解率為18.89%，有一定的降解效果。有益效果:本發(fā)明的一種蠟狀芽孢桿菌能能高產(chǎn)吲哚乙酸并能耐鹽堿生長(zhǎng)且能利用難溶性磷酸鹽為磷源進(jìn)行生長(zhǎng)，并對(duì)多環(huán)芳烴熒蒽具有一定的降解效果，可用于制備生物肥料。
·圖1是本發(fā)明菌株ZZ13的菌落2表示ZZ13菌株對(duì)難溶性磷的利用情況圖3表示不同裝液量對(duì)菌株ZZ13產(chǎn)IAA的影響圖4表示不同初始pH對(duì)ZZ13菌株產(chǎn)IAA的影響圖5表示不同碳源對(duì)菌株ZZ13產(chǎn)IAA的影響圖6表示不同氮源對(duì)ZZ13菌株產(chǎn)IAA的影響圖7表示不同含鹽度對(duì)ZZ13菌株產(chǎn)IAA的影響圖8表示ZZ13菌株對(duì)多環(huán)芳烴熒蒽的降解效果生物材料保藏信息蠟狀芽孢桿菌ZZ13，分類命名為蠟狀芽孢桿菌Bacillus Cereus，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2013年3月15日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)CGMCC N0.7322。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1首先準(zhǔn)備以下三種培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，ρΗ7.0 - 7.2，121°C滅菌，20min。LB液體培養(yǎng)基:不加瓊脂，其它條件同上。無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基(ΡΚ0培養(yǎng)基):磷酸三鈣5g，葡萄糖10g，硫酸銨0.5g，氯化鈉
0.3g，七水合硫酸鎂0.3g，氯化鉀0.3g，硫酸錳0.03g,七水合硫酸亞鐵0.03g, ρΗ7.0瓊脂20g，蒸餾水 1000ml, ρΗ7.0 7.2。121°C滅菌，20min。無機(jī)鹽培養(yǎng)基:硫酸銨2.0g ;磷酸二氫鈉0.5g ;磷酸氫二鉀0.5g ;七水硫酸鎂
0.2g ;二水氯化鈣 0.lg，蒸餾水 IOOOmL, ρΗ7.0,121°C滅菌，20min。將從南京紫金山腳采取的植物根際土挑根過篩后稱取IOg置于盛有IOOml滅菌水的250ml的三角瓶中，在搖床中，30°〇，1501'.1^11_1振蕩20min，靜置lOmin，得到土壤懸浮液。該土壤懸浮液中含有若干種促生菌，采用稀釋法稀釋后涂于LB培養(yǎng)基，將平板倒置，于300C，恒溫箱中培養(yǎng)24h后，挑取不同類型典型單個(gè)菌落，經(jīng)平板純化后，4°C保存在LB斜面待用。下面再通過定性測(cè)定和定量測(cè)定篩選出可分泌吲哚乙酸的細(xì)菌。定性測(cè)定:將分離純化后的細(xì)菌接種于含有L -色氨酸(200mg/L)的LB液體培養(yǎng)基，30°C，180r.min_1搖床培養(yǎng)Id。取50yL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時(shí)加50yLSalkowski 比色液(50mL35%HC104+lmL0.5M FeCl3)。將加入 50 μ L50mg/L 吲哚乙酸的比色液作為陽性對(duì)照。白色陶瓷板于室溫避光放置30min后觀察，顏色變紅者表示能夠分泌吲哚乙酸。定量測(cè)定:對(duì)初篩獲得的分泌IAA的細(xì)菌進(jìn)行定量測(cè)定，培養(yǎng)條件同上。首先用分光光度法測(cè)定菌懸液的0D_值 ，然后將菌懸液以IOOOOr.HiirT1離心IOmin取上清液加入等體積Salkowski比色液，避光靜置30min，測(cè)定其OD53tl值。計(jì)算菌濃度OD6tltl值為I時(shí)，單位體積發(fā)酵液中吲哚乙酸的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用分析純的吲哚乙酸梯度稀釋制備。把得到的產(chǎn)IAA菌進(jìn)行溶磷情況的篩選測(cè)定，將供試菌株接種于盛有30mL無機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基的150mL三角瓶，30°C，180r.mirT1培養(yǎng)4d后，將培養(yǎng)液裝入離心管4°C下IOOOOr.mirT1離心，15min。取上清液用鑰藍(lán)比色法測(cè)定有效磷含量。通過以上測(cè)定即篩選出一株高產(chǎn)吲哚乙酸且溶磷能力強(qiáng)的菌株，如圖1所示，該菌株形成的菌落為較小淡黃色、隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，不透明，不規(guī)則桿狀排列，產(chǎn)芽孢，株型命名為ZZ13。該菌株在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下，所述蠟狀芽孢桿菌對(duì)磷酸三鈣的轉(zhuǎn)化量達(dá)148.09mg-L^10相對(duì)于空白對(duì)照的結(jié)果，所述蠟狀芽孢桿菌對(duì)磷酸三鈣的轉(zhuǎn)化量比空白對(duì)照高出110.66mg.1/1 (圖2)。將上述方法篩選分離出的菌株，經(jīng)上海英俊生物工程有限公司測(cè)序，根據(jù)16SrDNA的測(cè)序結(jié)果，在http://www.ncb1.nlm.nih.gov在線查詢分析,利用Blast軟件在GenBank中與其它的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，選擇相近的序列與ZZ13的序列用MEGAversion3軟件構(gòu)建ZZ13的16SrDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)該菌株的生理生化特征，鑒定為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus)，同源性為99%。將該菌株于2013年3月15日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC N0.7322。實(shí)施例2好氧性試驗(yàn)把滅過菌的LB培養(yǎng)基倒入3個(gè)已滅菌的試管中，大約在2/3處，在無菌操作臺(tái)上，用接種針挑取斜面培養(yǎng)的菌ZZ13(CGMCC N0.7322)，穿刺接種到上述培養(yǎng)基中(必須穿刺到管底)。30°C培養(yǎng)，分別在3天至7天觀察結(jié)果。在瓊脂柱表面上生長(zhǎng)者為好氧菌，如沿穿刺線生長(zhǎng)者為厭氧菌或兼性厭氧菌。過氧化氫酶的測(cè)定在干凈載玻片上滴I滴3%H202，取18 24h的LB斜面培養(yǎng)物I環(huán)，在H2O2中涂抹，若有氣泡產(chǎn)生則為陽性，否則為陰性。甲基紅試驗(yàn)(M.R試驗(yàn))a.培養(yǎng)基及試劑:蛋白胨5g,葡萄糖5g,氯化鈉5g,蒸懼水IOOOmL,調(diào)節(jié)pH7.0
7.2，分裝試管，每管裝4 5mL，121°C滅菌20min。試劑:甲基紅0.1g, 95%酒精300mL，蒸餾水200mL。b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察接種菌株于上述培養(yǎng)液中，30°C培養(yǎng)I 2天。在培養(yǎng)液中加入幾滴甲基紅試劑，如培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色，為甲基紅陽性，黃色為陰性(甲基紅變色范圍
4.4紅色 6.0黃色)。乙酞甲基甲醇試驗(yàn)(VP試驗(yàn))a.培養(yǎng)基培養(yǎng)基同甲基紅試驗(yàn)。b.菌種 培養(yǎng)及結(jié)果觀察接種與培養(yǎng)同甲基紅試驗(yàn)。做VP試驗(yàn)時(shí)，取培養(yǎng)液(約2mL)和等量的40%Na0H相混合，加少量肌酸，充分振蕩2 5min后，如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為VP陽性。淀粉水解試驗(yàn)a.培養(yǎng)基及試劑在肉湯蛋白胨瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝三角瓶，121°C滅菌20min備用。路哥氏碘液:碘片lg，碘化鉀2g，先用少量(3 5mL)蒸餾水溶解碘化鉀，現(xiàn)加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀釋至300mL。b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察取菌種點(diǎn)接于平板上，30°C培養(yǎng)2 4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以鋪滿菌落周圍為度，平板呈藍(lán)色，而菌落周圍如有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已被水解。透明圈的大小一般說明水解淀粉能力的大小。明膠水解試驗(yàn)a.培養(yǎng)基及試劑蛋白胨5g，明膠120g，蒸餾水1000mL。調(diào)節(jié)ρΗ7.2 7.4，分裝試管，培養(yǎng)基高度約為4 5cm，121°C滅菌20min。b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察用穿刺法接種在試管中央。在30°C溫箱中培養(yǎng)一個(gè)月，觀察明膠是否液化。硝酸鹽還原試驗(yàn)a.培養(yǎng)基及試劑蛋白胨10g, KNO3Ig,蒸餾水IOOOmL, ρΗ7.0 7.4。格里斯氏(Gries)試劑:Α液:對(duì)氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10%左右)150mL ；B液:蔡胺0.lg，蒸餾水20mL，稀醋酸(10%左右)150mL。二苯胺試劑:二苯胺0.5g溶于IOOmL濃硫酸中，用2OmL蒸餾水稀釋。b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察將試驗(yàn)菌接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)1、3、5天。在白色瓷盤小孔中倒入少許培養(yǎng)液，然后在其中分別滴I滴試劑A和B液，當(dāng)培養(yǎng)液變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色、橙色或棕色等時(shí)，表示有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性，否則為陰性。
檸檬酸鹽的利用a.培養(yǎng)基及試劑檸檬酸鈉 2g，NaC15g, MgSO4.7H200.2g，(NH4) 2.HPO4Ig, 1% 澳百里香酚藍(lán)水溶液10mL，瓊脂20g，蒸餾水IOOOmL, ρΗ6.8 - 7.0,121°C滅菌20min。b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察取幼齡菌種接種于斜面上，30°C培養(yǎng)3 - 7天,培養(yǎng)基呈堿性(藍(lán)色)者為陽性反應(yīng)，不變者則為陰性。表I蠟狀芽孢桿菌ZZ13 (CGMCC N0.7322)生理生化特征
權(quán)利要求
1.一株具有突蒽降解能力的耐鹽堿臘狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus)ZZ13,于2013年3月15日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC N0.7322。
2.權(quán)利要求1所述的臘狀芽孢桿菌(BacillusCereus) ZZ13在降解多環(huán)芳烴突蒽中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌(BacillusCereus) ZZ13在制備生物肥料中的應(yīng)用 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株具有熒蒽降解能力的耐鹽堿產(chǎn)吲哚乙酸菌及其應(yīng)用，屬于微生物領(lǐng)域，該蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus ZZ13)，于2013年3月15日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，分類名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus Cereus)，保藏號(hào)CGMCC No.7322。該菌株能高產(chǎn)吲哚乙酸并能耐鹽堿生長(zhǎng)且能利用難溶性磷酸鹽為磷源進(jìn)行生長(zhǎng)，并對(duì)多環(huán)芳烴熒蒽具有一定的降解效果。
文檔編號(hào)A62D101/20GK103243055SQ201310200180
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月24日
發(fā)明者李輝信, 張振, 徐莉, 陳雄, 李偉明, 李方卉, 焦加國(guó), 劉滿強(qiáng), 陳小云, 胡鋒 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)