專利名稱：一種降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境污染生物修復(fù)領(lǐng)域，涉及一種降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氰氟草酯(cyhalofop-butyl)是一種芳氧苯氧羧酸酯類除草劑，由美國(guó)陶氏公司(Dow Elanw Co. Ltd) 1987年首先開發(fā),化學(xué)名稱為(R) _2_[4 (4-氰基-2-氟苯氧基)苯氧基]-丙酸丁酯，分子式為C2tlH2tlFNCV氰氟草酯在極低劑量即對(duì)雜草呈很高活性和選擇性，尤其對(duì)稗草、千金子、看麥娘、小康草等有卓越的效果，具有較好的發(fā)展前景，在我國(guó)的應(yīng)用日益廣泛。但是，隨著該類除草劑的長(zhǎng)期大量使用，其在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化和分解等環(huán)境行為正受到日益關(guān)注。 氰氟草酯在我國(guó)得到廣泛應(yīng)用的同時(shí)，其在土壤和水體中的殘留導(dǎo)致的環(huán)境污染問題也日趨嚴(yán)重，有以下幾方面的危害(I)氰氟草酯隨生產(chǎn)廢水、農(nóng)業(yè)灌溉水和雨水縱向和橫向擴(kuò)散，造成地表水和地下水污染；(2)氰氟草酯及其芳烴代謝產(chǎn)物對(duì)哺乳動(dòng)物和人體健康具有較大的危害；(3) 土壤中氰氟草酯殘留對(duì)下茬作物產(chǎn)生藥害，使下茬作物死亡或減產(chǎn)，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失；(4)氰氟草酯對(duì)一些水生生物毒性較高，水體中的氰氟草酯殘留會(huì)導(dǎo)致土壤和水體生物多樣性降低，危及水生生物安全。微生物降解修復(fù)技術(shù)是近幾十年才興起的一種新型的環(huán)境污染修復(fù)技術(shù)。該技術(shù)和物理化學(xué)方法相比，具有很多無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，如處理效果好，適合有毒有害有機(jī)污染物大面積面源污染的降解修復(fù)，修復(fù)費(fèi)用較低(僅為傳統(tǒng)化學(xué)、物理修復(fù)經(jīng)費(fèi)的10%左右)，不產(chǎn)生二次污染等。在國(guó)內(nèi)外，生物修復(fù)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于石油、化工和農(nóng)藥殘留有機(jī)污染的清除。但到目前為止還未見氰氟草酯殘留污染生物修復(fù)技術(shù)專利的研究和應(yīng)用報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一株降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌。本發(fā)明的另一目的是提供含有該細(xì)菌的菌劑。本發(fā)明的又一目的是提供該細(xì)菌的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌Aquamicrobium lusatiense JW_1,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號(hào)為=CCTCC NO M 2012297，保藏日期為2012年7月20日。該菌的主要生物學(xué)特性為G_，菌體為短桿狀，大小為O. 5-1. 0X1. 0-1. 5 μ m ;菌落表面光滑，有光澤，邊緣整齊，隆起，呈淡黃色。氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、檸檬酸利用反應(yīng)為陽性；甲基紅試驗(yàn)、脂酶反應(yīng)、V. P.反應(yīng)、M. R反應(yīng)、吲哚反應(yīng)為陰性；不能水解淀粉。一種含有所述的菌種保藏號(hào)為CCTCC NO M 2012297的降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I的降解菌劑。該菌劑可通過試管斜面種一搖瓶種一種子罐一生產(chǎn)罐一產(chǎn)品(包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑)的生產(chǎn)工藝制備得到。所述的菌種保藏號(hào)為CCTCC NO M 2012297的降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I在降解水體和/或土壤中的除草劑氰氟草酯殘留的應(yīng)用。所述的含有菌種保藏號(hào)為CCTCC NO M 2012297的降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I的菌劑在降解水體和/或土壤中的除草劑氰氟草酯殘留的應(yīng)用。
有益效果本發(fā)明提供了一株降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I (CCTCC NO M 2012297)，由該細(xì)菌制備的菌劑對(duì)氰氟草酯降解效率高達(dá)到95%以上，降解速度快，消除農(nóng)產(chǎn)品中除草劑氰氟草酯殘留，可用于降解土壤和水體中除草劑氰氟草酯殘留，解決除草劑氰氟草酯對(duì)對(duì)土壤水體環(huán)境的危害問題。
圖I菌株JW-I在含氰氟草酯的LB平板上形態(tài)。圖2菌株JW-I的透射電鏡照片。圖3菌株JW-I以氰氟草酯為唯一碳源生長(zhǎng)及對(duì)氰氟草酯的降解情況菌種保藏信息細(xì)菌JW-1,分類命名為Aquamicrobium lusatiense JW-1,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，菌種保藏號(hào)為=CCTCC NO M 2012297,保藏日期為2012年7月20日。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I菌種分離純化和鑒定取3g生產(chǎn)氰氟草酯的農(nóng)藥廠生化污泥于IOOmL含50mg/L氰氟草酯基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，震蕩搖勻，30°C、180rpm搖床培養(yǎng)，每隔7d以5%接種量轉(zhuǎn)接至新的含氰氟草酯的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，按同樣的培養(yǎng)富集方式轉(zhuǎn)接5代，氰氟草酯的濃度每次轉(zhuǎn)接提高10mg/L，逐漸提高到100mg/L。富集培養(yǎng)液經(jīng)紫外檢測(cè)有降解效果后，對(duì)富集液進(jìn)行稀釋，并分別在含100mg/L的氰氟草酯基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基平板上接入0. IOmL稀釋富集液涂布，30°C烘箱培養(yǎng).待平板上出現(xiàn)菌落后，挑取有透明圈的菌落劃線3次進(jìn)行純化，純化后取單菌于LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接至含氰氟草酯100mg/L的基礎(chǔ)鹽液體中，30°C、180rpm搖床培養(yǎng)，驗(yàn)證純菌的降解效果。經(jīng)過富集分離純化，從生產(chǎn)氰氟草酯的農(nóng)藥廠生化污泥中分離獲得I株氰氟草酯降解菌，命名為JW-I，該菌能在含氰氟草酯100mg/L的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中降解氰氟草酯，降解率約為99. 5%。同時(shí)，菌株JW-I可在含氰氟草酯的LB平板上因?qū)⑺苄缘偷那璺蒗ソ到鉃樗苄愿叩慕到猱a(chǎn)物而形成透明圈(圖I)。以菌株JW-I的基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rRNA通用引物(27f和1452r)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為1400bp的16S rRNA基因序列。在RDP數(shù)據(jù)庫(https://rdp.cme. msu. edu/)中進(jìn)行 Blast,結(jié)果表明菌株 JW-I 與 Aquamicrobium lusatiense 屬菌株的同源性最近，同源性大于99%。菌株JW-I在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)Id后，菌落表面光滑，有光澤，邊緣整齊，隆起，呈淡黃色，經(jīng)過負(fù)染，在透射電子顯微鏡下該菌呈桿狀，單極生鞭毛，無莢膜，不形成芽孢(圖2)。G_，菌體為短桿狀，大小為O. 5-1. OX I. 0-1. 5 μ m。氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、檸檬酸利用反應(yīng)為陽性；甲基紅試驗(yàn)、脂酶反應(yīng)、V. P.反應(yīng)、M. R反應(yīng)、吲哚反應(yīng)為陰性；不能水解淀粉、尿素和TW80。菌株JW-I的形態(tài)和生理生化特征和Bergey’ smanual of systematic bacteriology 上對(duì) Aquamicrobium lusatiense 的描述是一致的。結(jié)合形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA同源性分析,將菌株JW-I鑒定為Aquamicrobiumlusatiense。本實(shí)施例中所涉及的培養(yǎng)基配方如下LB培養(yǎng)基蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，NaCl 10. Og/L，去離子水加至lOOOmL。固體LB培養(yǎng)基加入I. 5%的瓊脂粉。基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(MM)=NH4NO3 I. Og/L, K2HPO4 I. 5g/L, KH2PO4 O. 5g/L, NaCl O. 5g/L,MgSO4O. 2g/L，去離子水加至 lOOOmL，pH=7. 0。
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固體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基加入I. 5%的瓊脂粉。富集選擇培養(yǎng)基在IOOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入一定量的氰氟草酯原藥作為唯一碳源進(jìn)行選擇培養(yǎng)。富集基質(zhì)采用江蘇揚(yáng)州某生產(chǎn)氰氟草酯的農(nóng)藥廠生化污泥。氰氟草酯原藥購(gòu)自江蘇揚(yáng)州某農(nóng)藥廠(純度為99%)，按所需濃度添加到培養(yǎng)基中。甲醇(色譜純)購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司。其它化學(xué)試劑為分析純，購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑有限公司。實(shí)施例2氰氟草酯降解菌劑的制備I.將菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)試管種接種于肉湯蛋白胨培養(yǎng)基搖瓶中，200rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；2.將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐培養(yǎng)基的10%接種量(v/v)接入500升種子罐，種子罐裝液量為400升，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方(質(zhì)量百分比)葡萄糖 I. 0%, NH4NO3 0. 8%, K2HPO4 0. 3%, MgSO4 0. 05%, FeSO4 0. 01%, NaCl 0. 5%, CaCO3 0. 3%, W-母膏 0. 5%, pH 值 7. 2-7. 5 ；3.將種子液按生產(chǎn)罐培養(yǎng)基的10wt%接種量接入5噸的生產(chǎn)罐培養(yǎng)，裝液量為4噸，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣比為I :0. 5，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30°C，整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為36小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑，或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。實(shí)施例3氰氟草酯降解菌劑對(duì)氰氟草酯殘留的降解效果在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中加入終濃度為100mg/L的氰氟草酯，1%的接種量接入實(shí)施例2制備的菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)菌液，設(shè)接種滅活的菌株JW-1 (CCTCC NO M2012297)為對(duì)照。每隔Id定時(shí)取樣檢測(cè)菌株的生長(zhǎng)情況和氰氟草酯的降解情況，結(jié)果見圖
3。菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)在5d內(nèi)對(duì)氰氟草酯的降解率達(dá)到99. 2%。同時(shí)，在氰氟草酯的降解過程中，培養(yǎng)液的菌體量也隨著氰氟草酯的降解而增加，5d內(nèi)菌株量從接種時(shí) I. 5X IO6Cfumr1 增加到約 I. IXlO7Cfu mL_1 ;表明菌株 Jff-I (CCTCC NO M 2012297)在基本完全降解氰氟草酯的同時(shí)，能夠利用氰氟草酯作為碳源生長(zhǎng)。實(shí)施例4菌株JW-I對(duì)土壤中氰氟草酯殘留的降解效果
Jff-I (CCTCC NO M 2012297)對(duì)土壤中除草劑氰氟草酯殘留降解效果測(cè)定在IOOOg 土壤中加入氰氟草酯，使土壤中含藥濃度為10mg/kg，加入實(shí)施例2制備的JW-I菌液，混勻，置于30°C培養(yǎng)箱中黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定氰氟草酯在土壤中的殘留量，同時(shí)設(shè)置不接菌的對(duì)照。結(jié)果見表1，表I中數(shù)據(jù)表明在不接菌的對(duì)照土壤中，氰氟草酯殘留濃度在第一天下降了 21. 2%，可能是由于土壤吸附的原因，而非氰氟草酯被降解，在此后的十多天里下降十分緩慢。而接種了降解菌JW-I (CCTCC NO M 2012297)的土壤，氰氟草酯殘留濃度在第一天下降了 25. 1%，在此后的幾天下降非常迅速，到第15天氰氟草酯殘留濃度降解率達(dá)到95. 6%。表I菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)在土壤中對(duì)氰氟草酯殘留解效果
權(quán)利要求
1.一種降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌Aquamicrobium lusatiense JW_1,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號(hào)為=CCTCC NO M 2012297，保藏日期為2012年7月20日。
2.一種含有權(quán)利要求I所述的降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I的降解菌劑。
3.權(quán)利要求I所述的降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I在降解水體和/或土壤中的除草劑氰氟草酯殘留的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的含有降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I的菌劑在降解水體和/或土壤中的除草劑氰氟草酯殘留的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境污染生物修復(fù)領(lǐng)域，公開了一種降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌及其應(yīng)用。一種降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌Aquamicrobium lusatiense JW-1，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號(hào)為CCTCC NOM2012297，保藏日期為2012年7月20日。由該細(xì)菌制備的菌劑對(duì)氰氟草酯降解效率高達(dá)到95％以上，降解速度快，消除農(nóng)產(chǎn)品中除草劑氰氟草酯殘留，可用于降解土壤和水體中除草劑氰氟草酯殘留，解決除草劑氰氟草酯對(duì)對(duì)土壤水體環(huán)境的危害問題。
文檔編號(hào)A62D101/04GK102827799SQ20121034276
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者顧立鋒, 顧子衡, 蔣子才 申請(qǐng)人:江蘇碧諾環(huán)?？萍加邢薰?br>