專利名稱：利用鹿胎盤制備生物活性蛋白寡肽粉的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備一種生物活性蛋白寡肽粉的方法，特別涉及一種利用鹿胎盤制備生物活性蛋白寡肽粉的方法。
背景技術(shù)：
目前已有人以鱈魚肉、鰱魚、大豆、動(dòng)物皮等為原料，采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶及胰蛋白酶等水解蛋白酶制備了生物活性寡肽。在動(dòng)物原料中，水產(chǎn)生物較為多見，鹿源寡肽還未見報(bào)道，在寡肽的生物活性方面也多集中在清除自由基活性，ACE抑制活性寡肽還未見報(bào)道。鹿胎盤有補(bǔ)腎益精、延緩衰老的作用。但由于鹿胎盤溫補(bǔ)作用顯著，主要適合于氣血不足，腎氣虧虛的人食用，而大部分健康人群都不能過多食用，因此，限制了鹿胎盤的開發(fā)利用。同時(shí)，在一些鹿業(yè)公司鹿胎盤用酶活性為資源也未能被充分利用，而造成資源浪費(fèi)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用鹿肉制備的生物活性蛋白寡肽及其制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種利用鹿肉制備生物活性蛋白寡肽粉。本發(fā)明還提供了一種利用鹿肉制備生物活性蛋白寡肽粉及其制備方法，所述制備方法包括以下步驟a.鹿胎盤預(yù)處理將鹿胎盤煮至所述鹿胎盤的蛋白變性；b.蛋白酶水解向變性的鹿胎盤中添加堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶，進(jìn)行酶解反應(yīng)；c.分離純化將所述酶解液除鹽、冷凍干燥所得到的淡黃色粉針狀細(xì)末即為所述生物活性蛋白寡肽粉。本發(fā)明還提供了所述生物活性寡肽作為原料在醫(yī)藥、保健品、化妝品的應(yīng)用。由于本發(fā)明以生物活性豐富以鹿肉或鹿胎盤作為原料，具有補(bǔ)腎益精、延緩衰老的功效；同時(shí)，由于寡肽富有的各種生物活性，本發(fā)明的生物活性的蛋白寡肽同時(shí)還具有 ACE抑制的補(bǔ)腎益精活性和基于清除自由基指標(biāo)的抗衰老活性，將該生物活性寡肽作為原料應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品領(lǐng)域，為有效利用鹿肉資源，提供一種開發(fā)途徑。
圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的鹿胎盤寡肽四個(gè)批次的TLC圖譜。圖2為用相似度評價(jià)軟件自動(dòng)生成的本發(fā)明的鹿胎盤寡肽對照圖譜。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1的鹿胎盤寡肽的分子量分布。圖4為本發(fā)明實(shí)施例1的鹿胎盤寡肽在分子量為500-2000的展開圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例1的鹿胎盤寡肽濃度與ACE抑制活性關(guān)系曲線。
具體實(shí)施例方式下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，其制備及質(zhì)量檢測方法是a.鹿肉預(yù)處理將鹿肉或者鹿胎盤中肉質(zhì)部分，去除筋膜和血管，洗凈，反復(fù)凍融，絞碎。優(yōu)選地，原料選自鹿胎盤；優(yōu)選地，凍融三次以上；優(yōu)選地，用95°C以上水煮15-30 分鐘。b.蛋白酶水解將變性的鹿肉與的水均勻混合，添加的堿性蛋白酶和的木瓜蛋白酶，進(jìn)行酶解反應(yīng)，滅酶活，冷卻至常溫。優(yōu)選地，堿性蛋白酶占鹿胎原料的0.8%-2% ；木瓜蛋白酶占鹿胎原料的0. 8 % -2 %，優(yōu)選地，在55 士 5°C，pH7. 5 士0. 5的條件下酶解反應(yīng)3_5 小時(shí)；優(yōu)選地，95°C以上滅酶活15分鐘，冷卻至常溫；優(yōu)選地，變性的鹿肉與1 1的水的混合比例為1 1，按重量計(jì)。c.分離純化離心去除不溶雜質(zhì)后，將酶解液稀釋，分離，收集分子量< 5k的部分，將收集到的料液除鹽，收集除鹽后的濃縮液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分水后，冷凍干燥即獲得淡黃色粉針狀細(xì)末。優(yōu)選地，采用SOOOrpm高速離心；優(yōu)選地，將酶解液稀釋10倍以上， 優(yōu)選地，采用超濾膜分離，優(yōu)選地，利用納濾除鹽。d.薄層色譜檢測產(chǎn)品薄層色譜條件為展開劑配方為正丁醇乙醇乙酸水 =4:1:1: 2，顯色劑配方為0.2%的茚三酮乙醇溶液，得到該工藝產(chǎn)品的5個(gè)主要特征點(diǎn)，為合格。e.高效液相色譜檢測產(chǎn)品高效液相條件為=Agilent 1100型高效液相色譜儀， At 1 ant I S T3色譜柱(4. 6X 10_，3 μ m)，流動(dòng)相為100%的超純水，流速0. 6ml/min,選樣量10μ 1，檢測波長紫外215nm。用國家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A》軟件制定出對照圖譜，與對照圖譜相似度大于90%的鹿胎盤寡肽為合格。實(shí)施例1以鹿胎盤為原料，去除其鹿胎盤肉質(zhì)子葉，去除其血管和筋膜，將其洗凈。將所屬肉質(zhì)子葉反復(fù)凍融三次，絞碎，95°C以上水煮15-30分鐘。將變性的鹿肉與1 1的水均勻混合，添加鹿胎原料的0.8%的堿性蛋白酶(酶活力2. 4AU/g，丹麥諾維信)和2%的木瓜蛋白酶(800000u/g，南寧東恒華道)，在55士5°C，pH7. 5士0. 5的條件下，酶解反應(yīng)3_5小時(shí)， 950C以上滅酶活15分鐘，冷卻至常溫。采用SOOOrpm高速離心去除不溶雜質(zhì)后，將酶解液稀釋10倍以上，采用超濾膜分離，收集分子量< 5k的部分，將收集到的料液利用納濾除鹽， 收集納濾后的濃縮液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分水后，冷凍干燥即獲得淡黃色粉針狀細(xì)末。實(shí)施例2以鹿胎盤為原料，去鹿胎盤肉質(zhì)子葉，去除血管和筋膜，洗凈。將肉質(zhì)子葉反復(fù)凍融三次，絞碎，95°C以上水煮15-30分鐘。將變性的鹿肉與1 1的水均勻混合，添加鹿胎原料的2 %的堿性蛋白酶和0.8%的木瓜蛋白酶，在55 士 5°C，pH7. 5 士0. 5的條件下，酶解反應(yīng)3-5小時(shí)，95°C以上滅酶活15分鐘，冷卻至常溫。采用8000rpm高速離心去除不溶雜質(zhì)后，將酶解液稀釋10倍以上，采用超濾膜分離，收集分子量< 5k的部分，將收集到的料液利用納濾除鹽，收集納濾后的濃縮液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分水后，冷凍干燥即獲得淡黃色粉針狀細(xì)末。
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實(shí)施例3選料去鹿胎盤肉質(zhì)子葉，去除血管和筋膜，洗凈。將肉質(zhì)子葉反復(fù)凍融三次，絞碎，95°C以上水煮15-30分鐘。將變性的鹿肉與1 1的水均勻混合，添加鹿胎原料的1.5% 的堿性蛋白酶和1.5%的木瓜蛋白酶，在55 士 5°C，pH7. 5 士 0.5的條件下，酶解反應(yīng)3-5小時(shí)，95°C以上滅酶活15分鐘，冷卻至常溫。采用8000rpm高速離心去除不溶雜質(zhì)后，將酶解液稀釋10倍以上，采用超濾膜分離，收集分子量<證的部分，將收集到的料液利用納濾除鹽，收集納濾后的濃縮液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分水后，冷凍干燥即獲得淡黃色粉針狀細(xì)末。實(shí)施例4圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的鹿胎盤寡肽四個(gè)批次的TLC圖譜。將上述實(shí)施例1的鹿胎盤寡肽的淡黃色粉末制備成四個(gè)批次，分別將四個(gè)批次的樣品溶解并制成lmg/ml的溶液在展開缸中進(jìn)行展開，采用TLC法檢測四個(gè)批次生產(chǎn)的鹿胎盤寡肽產(chǎn)品，展開劑配方為正丁醇乙醇乙酸水=4 1 1 2，顯色劑配方為0.2%的茚三酮乙醇溶液。對四個(gè)不同批次生產(chǎn)的鹿胎盤寡肽產(chǎn)品的薄層色譜結(jié)果進(jìn)行分析，如圖1所示，每個(gè)樣品中，共含有5個(gè)可見圓點(diǎn)，從上到下1-5這5個(gè)點(diǎn)的比移值分別為0. 8375,0. 65，0. 5375,0. 475， 0.觀75。當(dāng)?shù)玫降漠a(chǎn)品為如圖1所示從上到下的5個(gè)主要特征點(diǎn)時(shí)，為合格產(chǎn)品。實(shí)施例5高效液相色譜檢測條件為高效液相色譜檢測產(chǎn)品條件為=Agilent 1100型高效液相色譜儀，At Iant i S T3色譜柱(4. 6X 10mm，3 μ m),流動(dòng)相為100 %的超純水，流速 0. 6ml/min，進(jìn)樣量10 μ 1，檢測波長紫外215nm。圖2為相似度評價(jià)軟件自動(dòng)生成的鹿胎盤寡肽對照圖譜。該圖譜用國家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng) 2004A》軟件制定出，且該對照圖譜積分?jǐn)?shù)據(jù)如表1。與對照圖譜相似度大于90%的鹿胎盤寡肽為合格產(chǎn)品。表1對照用指紋圖譜積分?jǐn)?shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種利用鹿胎盤制備生物活性蛋白寡肽粉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a.鹿胎盤預(yù)處理將鹿胎盤煮至所述鹿胎盤的蛋白變性；b.蛋白酶水解向變性的鹿胎盤中添加堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶，進(jìn)行酶解反應(yīng)；c.分離純化將所述酶解液除鹽、冷凍干燥所得到的淡黃色粉針狀細(xì)末即為所述生物活性蛋白寡肽粉。
2.一種如權(quán)利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟a包括將鹿胎盤去除筋膜和血管后，反復(fù)凍融，再將融化的鹿胎盤絞碎，在水中煮已攪碎的鹿胎盤，直至所述鹿胎盤的蛋白變性；步驟b包括將變性的鹿胎盤與水混合，向混合物中添加堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶，進(jìn)行酶解反應(yīng)，然后滅酶活性，將所得酶解液冷卻至常溫；步驟c包括將所述酶解液離心去除雜質(zhì)后，稀釋，并分離、收集酶解液中分子量< 5k 的部分，然后除鹽，再將除鹽后的濃縮液除去水后，冷凍干燥；所得到得淡黃色粉針狀細(xì)末即為所述生物活性蛋白寡肽粉。
3.—種如權(quán)利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制備方法，其特征在于，所述鹿胎盤包括馬鹿的胎盤或梅花鹿的胎盤。
4.一種如權(quán)利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制備方法，其特征在于，在步驟(b) 中，堿性蛋白酶的用量是鹿胎盤原料重量的0.8% _2%，木瓜蛋白酶的用量是鹿胎盤原料重量的0.8% _2%，酶解反應(yīng)的pH為7. 5士0.5，酶解反應(yīng)溫度為55士5°C。
5.一種如權(quán)利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制備方法，其特征在于，在步驟(b) 中，所述變性的鹿胎盤和水的重量比例為1 1，所述酶解反應(yīng)進(jìn)行3-5小時(shí)。
6.一種如權(quán)利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制備方法，其特征在于，在步驟(b) 中，所述堿性蛋白酶的用量是鹿胎盤原料重量的0. 8%，所述木瓜蛋白酶的用量是鹿胎盤原料重量的2%，所述酶解反應(yīng)為3小時(shí)。
7.—種如權(quán)利要求1所述的生物活性蛋白寡肽粉的制備方法，其特征在于，在步驟(b) 中，將酶解后的產(chǎn)物離心，并將所得上清液進(jìn)一步純化。
8.—種如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法制得的生物活性蛋白寡肽粉。
9.一種如權(quán)利要求8所述的一種生物活性蛋白寡肽粉，其特征在于，所述生物活性蛋白寡肽粉的總氨基酸含量占所述寡肽粉的79%以上。
10.一種如權(quán)利要求8所述的一種生物活性蛋白寡肽粉，其特征在于，所述生物活性蛋白寡肽粉的分子量在500-2000之間。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的鹿胎盤生物活性寡肽作為原料在醫(yī)藥、保健品及化妝品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用鹿肉的生物活性蛋白寡肽粉及其制備方法，其制備方法包括以下步驟將鹿肉進(jìn)行預(yù)處理、蛋白酶水解及分離純化，即得到所述生物活性蛋白寡肽粉；所得到的利用鹿肉的生物活性蛋白寡肽粉的總氨基酸含量在75％以上，分子量在500-2000之間。由于本發(fā)明以生物活性豐富的鹿胎盤作為原料，具有補(bǔ)腎益精、延緩衰老的功效；同時(shí)，由于寡肽富有的各種生物活性，本發(fā)明的生物活性的蛋白寡肽同時(shí)還具有ACE抑制的補(bǔ)腎益精活性和基于清除自由基的抗衰老活性，故本發(fā)明將該生物活性寡肽作為原料應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品領(lǐng)域，為有效利用鹿肉資源，提供一種開發(fā)途徑。
文檔編號(hào)A61Q1/00GK102485903SQ20111023752
公開日2012年6月6日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者劉春生, 龐秀明, 董栗 申請人:內(nèi)蒙古健元鹿業(yè)有限責(zé)任公司