一種羊胎素及其制備方法

專利名稱：一種羊胎素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胚胎提取物及其制備方法，特別是涉及一種羊胎素及其制備方法。
背景技術(shù)：
皮膚會自然發(fā)生衰老，主要原因有1)隨年齡增長機(jī)體全面老化；2)過度緊張、疲勞致生活失調(diào)；3)不合理的飲食致營養(yǎng)失去平衡；4)神經(jīng)-內(nèi)分泌-紊亂致免疫功能降低；5)不良生活習(xí)慣。其中，年齡是主要原因。隨著年齡增加，丘腦-垂體軸及免疫功能降低，性腺、腎上腺和甲狀腺等腺體萎縮，機(jī)體出現(xiàn)衰老征象。自由基是生命代謝產(chǎn)物，是衰老的分子基礎(chǔ)。機(jī)體通過抗氧化系統(tǒng)如抗氧化酶(SOD、CAT、GSH)和抗氧化劑(VitE、C，輔酶Q)清除有害自由基。年齡增加或機(jī)體功能失調(diào)，自由基生成增高、清除力下降，生物膜被攻擊，引起脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞功能，皮膚細(xì)胞脫水干燥、角化，松弛、失彈性、少光澤，皺紋形成，色素沉著等一系列皮膚老化癥狀。
皮膚健美在很大的程度上是抗衰老的問題。追溯祖國醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為只有臟腑陰陽平衡、經(jīng)脈氣血通暢，容顏才不至于過早的衰老，并保持面色紅潤皮膚白嫩。早在西漢，《神農(nóng)本草經(jīng)》就記載了百余種養(yǎng)顏美容的藥物，遠(yuǎn)流日本和歐洲，并逐漸融入了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)美容的理念，形成了里表并重的美容方針。因此，以引進(jìn)新理論、新技術(shù)為研究和開發(fā)的宗旨，在現(xiàn)代科學(xué)氛圍中誕生了“生物活性素”。廣義上的“生命活性物質(zhì)”，是指那些維持生命活動的最基本成分，如一般的蛋白、脂肪、糖、水和電解質(zhì)等，然而，在生命活動中，還存在著一類重要物質(zhì)，盡管含量很低，但其生物活性很高，如果這些物質(zhì)缺乏，將影響生命活動正常運(yùn)行，甚至導(dǎo)致疾病的發(fā)生?？茖W(xué)家們對“生命活性物質(zhì)”產(chǎn)生了廣泛關(guān)注，據(jù)報(bào)道1995年，日本東京神經(jīng)心理藥理學(xué)系報(bào)告了老化小鼠年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶與膽堿型神經(jīng)功能的改變。用Y形迷宮實(shí)驗(yàn)，老化小鼠學(xué)習(xí)能力和逃避反應(yīng)性降低，乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿脂酶活性降低。這些結(jié)果表明老化過程伴隨膽堿能神經(jīng)紊亂。(Nitta Aage-related changes inlearning and memory and cholinergic neuronal function in senescenceaccelerated mice(SAM).Behav Brain Res 1955 Dec 14；72(1-2)49-55)；2000年，德國醫(yī)學(xué)中心報(bào)告了細(xì)胞因子和激素是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)系，年輕和年老者的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)不同，老年發(fā)生免疫衰老(Straub RH，Cytokinesand hormones as possible links between endocrinosenescence andimmunosenescence.J Neuroimmunol 2000 Sep 1；109(1)10-5)；2000年，美國科羅拉多大學(xué)提出了在免疫衰老過程中，內(nèi)分泌功能起主要作用，以及激素和神經(jīng)遞質(zhì)的合成釋放降低的證據(jù)，隨年齡增加，生長激素、IGF1、交感神經(jīng)活躍、兒茶酚胺代謝、生殖激素都發(fā)生改變，也反應(yīng)在老齡個(gè)體對體力的耐受度和刺激反應(yīng)性下降(MazzeoRS.Aging，immune function，and exercisehormonal regulation.Int J SportsMed 2000May；21Supp1S10-3)；2001年，日本東京大學(xué)化學(xué)藥物實(shí)驗(yàn)室報(bào)告神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽、激素和細(xì)胞因子介導(dǎo)神經(jīng)內(nèi)分泌與免疫系統(tǒng)相互作用，以維持機(jī)體的正常生理功能，并認(rèn)為神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)失去平衡，在老化過程中起重要作用(Nishiyama N.Thymectomy-induced deterioration of learning and memory.CellMol Biol(Noisy-le-grand).2001Feb；47(1)161-5)；2001年，德國神經(jīng)內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步報(bào)告了神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)通過細(xì)胞因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)特殊的受體和信號傳導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，機(jī)體老化時(shí)，多個(gè)水平發(fā)生改變，這些變化依賴于氧化損傷、非酶性的糖基化和加速老化進(jìn)程(Straub RHThe process of aging changes theinterplay of the immune，endocrine and nervous systems.Mech Ageing Dev 2001Sep 30；122(14)1591-611)。天然的生命活性物包括以下幾類物質(zhì)1)免疫活性因子，如淋巴因子；2)活性酶，如超氧歧化酶；3)細(xì)胞生長因子，如表皮生長因子；4)內(nèi)分泌素，如促性激素；5)有益的磷脂，如腦磷脂、卵磷脂；6)豐富的氨基酸和維生素。二十世紀(jì)末興起的生物活性物有①酶類膠原酶、透明質(zhì)酸酶、組織蛋白酶、糖苷酶等，參與皮膚角質(zhì)細(xì)胞代謝，能夠抑制皮膚老化和色斑形成；②肽類腦素肽類，具有防皺、止癢、防禿和擴(kuò)張血管的功效，日本已開發(fā)出惱素系列產(chǎn)品，如惱素晚霜等；③蛋白魚蛋白與維生素復(fù)合，可增加皮膚彈性、改善皮膚老化狀態(tài)。
胚胎的研究與應(yīng)用是二十世末生物醫(yī)學(xué)的重大課題，醫(yī)學(xué)革命和治療學(xué)新的里程碑。中醫(yī)認(rèn)為“胚胎雖秉后天之形，卻承先天之氣”，具有返老還童之功效。補(bǔ)精益陽，益精血，助腎陽，養(yǎng)血益氣，滋潤肌膚，安神定志，以心血養(yǎng)顏。九十年代初，歐洲用一種純種的黑色胎羊制備羊胎素，并風(fēng)靡歐洲及東南亞，價(jià)格之昂貴只有一些名人和富者能夠使用。羊胎素的問世，為現(xiàn)代科學(xué)美容開辟了一條嶄新的思路(羊胎素世界知識畫報(bào)，2005，1，A版，P62)?，F(xiàn)代科學(xué)已經(jīng)證實(shí)，胚胎組織中含有豐富的生命活性因子，采用先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)提取和純化的胚胎活性因子，在臨床上顯示出高效的健膚養(yǎng)顏的奇特功效。這是因?yàn)榕咛ソM織中含有的眾多的細(xì)胞因子、促激性素類因子、酶類、細(xì)胞生長素、磷脂和多肽等多種生物活性分子。胚胎組織中含有的生物活性物質(zhì)及其作用為1)活性肽促進(jìn)皮膚新陳代謝；2)免疫活性因子調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能；3)酶激活轉(zhuǎn)化因子清除自由基；4)細(xì)胞生長因子促進(jìn)生長修復(fù)；5)天然生態(tài)調(diào)節(jié)因子保濕。
胚胎干細(xì)胞，可分裂成專職干細(xì)胞，發(fā)育成包括多種臟器的完整的機(jī)體，表明胚胎細(xì)胞具有非常強(qiáng)大的生命活力，這種活力是由存在于胚胎的活性因子提供的。目前已經(jīng)證實(shí)胚胎素中含有30余種活性物質(zhì)，以必要氨基酸、多肽、微量元素復(fù)合體的形式存在，對出生后機(jī)體的生長、發(fā)育、代謝，以及抵抗衰老和促進(jìn)損傷修復(fù)起到十分重要的作用。胚胎發(fā)育過程中的內(nèi)分泌活動十分活躍，特別是下丘腦-垂體-腎上腺發(fā)育，在人和羊表現(xiàn)為mRNA編碼的糖皮激素蛋白表達(dá)水平升高和前列腺素(PGHS-II)合成增加，介導(dǎo)11β-羥基類固醇脫氫酶增加；胚胎代謝活躍的另一個(gè)證據(jù)是胚胎血管內(nèi)皮細(xì)胞含有豐富的糖原酵素和原形蛋白，調(diào)節(jié)糖原代謝。這些特征與胚胎含有多種豐富的生命活性物質(zhì)有關(guān)。細(xì)胞因子是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最熱門的研究課題，因其涉及生命活動的各個(gè)環(huán)節(jié)，構(gòu)成了生命調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和中心，控制心血管、呼吸、消化、生殖、生長、發(fā)育和老化，甚至人的心理和行為。胚胎含IL-2、IL-3、IL-6、SCF和IFN等造血和免疫刺激因子，肝細(xì)胞生長因子、腦活素、生長素和類胰島素生長因子(IGF)。人和綿羊胎膜EPO及受體表達(dá)很高，胚胎皮膚和肝組織中含有豐富的生長激素受體，分泌的3種類胰島素生長因子結(jié)合蛋白量比成年高出10倍。解毒酶胚胎肝合成谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一種重要的生命活性物，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)許多成分的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體。最近發(fā)現(xiàn)幾乎胚胎的所有組織中解毒酶的含量都很高，參與細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)活動，催化谷胱甘肽與毒物結(jié)合，進(jìn)一步水解后將產(chǎn)物排除體外，因此，該酶在機(jī)體解毒過程中起到控制作用。胚胎腦組織含有神經(jīng)營養(yǎng)因子(NF)，胚胎7-8周，在端腦囊的神經(jīng)膠質(zhì)和脈絡(luò)膜血管呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，第10周室管膜也出現(xiàn)強(qiáng)陽性染色，15-16周移到腦皮質(zhì)板和星形細(xì)胞，因此，NF對胚胎腦發(fā)育、分化、移動甚至存活起關(guān)鍵作用。胚胎腦組織表達(dá)強(qiáng)烈的另一種神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)在胚胎的活存、分化和發(fā)育中也起到關(guān)鍵作用。此外，胚胎中含有多種生物活性肽，如垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽，血管緊張肽，胃泌素和分泌素等，對上皮性組織的增殖和分化起到重要作用。胚胎肝有含量豐富的細(xì)胞色素P450超家族成員，是重要的生物活性成分，在所有的胚胎肝中，含量高于成人。許多天然的生物活性肽對出生后機(jī)體的性功能促進(jìn)、延緩皮膚微循環(huán)障礙、彈性下降、色素沉著、老化的組織再生和修復(fù)具有重要的多功能活性。
基于上述功效，國內(nèi)外現(xiàn)已開發(fā)出多種羊胎素產(chǎn)品，目前市場中的羊胎素的制作方法主要為85％以上選用羊胎盤為原料，用中空纖維柱進(jìn)行超濾(蛋白吸附率約為40％)，粉碎烘干，或采用流化噴霧法(溫度50℃以上)，制粒。產(chǎn)品呈褐色、有腥臭味、不溶于水，且含有防腐劑，多采用胃溶膠囊或軟膠囊劑型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生物活性較高、不含防腐劑的羊胎素及其制備方法。
本發(fā)明所提供的制備羊胎素的方法，包括以下步驟1)在無菌條件下，以2-3個(gè)月齡的羊胚胎為原料，經(jīng)清洗、絞碎、凍融和勻漿，得到粒度為2-50μ的組織液；2)將組織液在65-70℃下加熱殺菌、過分子篩和超濾進(jìn)行純化，收集分子量小于30000道爾頓的組分；3)對收集的組分進(jìn)行微孔過濾除菌，濾膜孔徑為0.20-0.45μ；4)冷凍干燥后得到羊胎素。
在上述制備方法中，為使胚胎中的活性物質(zhì)得到充分釋放，所述步驟1)中凍融的次數(shù)為2-4次，優(yōu)選為3次，其中冷凍的溫度為-10℃至-30℃。
步驟2)中加熱殺菌的時(shí)間為9-11小時(shí)，優(yōu)選為10小時(shí)，溫度優(yōu)選為65℃；分子篩的孔徑依次為100目、200目；超濾所用的濾膜為生物纖維素膜，優(yōu)選為美國PALL公司生產(chǎn)的SER#33094048R超濾纖維素膜。
本發(fā)明的羊胎素可以制成膠囊、片劑、顆粒劑、粉劑、口服液等任何一種便于服用和攜帶的劑型，將步驟4)中經(jīng)冷凍干燥后得到的羊胎素造粒，裝膠囊，即可得到膠囊劑型的產(chǎn)品；所述膠囊優(yōu)選為腸溶膠囊。
用上述方法得到的羊胎素即為生物活性高、不含防腐劑的羊胎素。
本發(fā)明提供了一種羊胎素及其制備方法。該制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1)精選2-3個(gè)月齡的羊胚胎為原料，生物活性物質(zhì)含量豐富；2)用美國PALL公司的生物纖維素膜進(jìn)行提純，蛋白吸附率僅為0.04％；3)經(jīng)冷凍干燥(溫度-30℃以下)后得到產(chǎn)品，可使其生物活性不受損失；4)采用腸溶膠囊，可保證多肽不被胃酸水解、吸收完全；5)制備工藝簡單，具有工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。本發(fā)明的羊胎素為白色微粒、微甜、無異味、易溶于水，不含防腐劑，服用方便、適用人群廣、保質(zhì)期長，與市場上現(xiàn)有的羊胎素相比，色澤、氣味、水溶性等方面均得到顯著改善。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明羊胎素可促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，促進(jìn)心、肝、肺、腦多種組織呼吸，抗感染，提高機(jī)體免疫力和抗缺氧能力，并可直接或間接地激活肌膚的生理活性，經(jīng)皮膚吸收后，能夠調(diào)節(jié)和改善因年齡或工作節(jié)奏過快、生活緊張、久坐少動等造成的皮膚衰老如彈性降低等現(xiàn)象，具有較好的美容功效(尤其是祛黃褐斑，總有效率達(dá)70.00％)?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，本發(fā)明具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場前景，可以在制藥、保健品生產(chǎn)及化妝品生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、羊胎素的制備其制備過程，包括以下步驟1)在萬級凈化間內(nèi)，以2-3個(gè)月齡的羊胚胎為原料，對其進(jìn)行清洗、絞碎、反復(fù)凍融2次和勻漿，得到粒度為45μ的組織液；2)將組織液在65℃下加熱9小時(shí)進(jìn)行殺菌、依次過100目、200目的分子篩，用美國PALL公司生產(chǎn)的超濾纖維素膜進(jìn)行純化，收集分子量小于30000道爾頓的組分；3)對收集的組分用孔徑為0.20μ的濾膜進(jìn)行過濾除菌；4)-40℃冷凍干燥后得到產(chǎn)品。
經(jīng)檢測，用上述方法制備的羊胎素白色、微甜、無異味、易溶于水，不含防腐劑，符合標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例2、羊胎素膠囊的制備其制備過程，包括以下步驟1)在萬級凈化間內(nèi)，以2-3個(gè)月齡的羊胚胎為原料，對其進(jìn)行清洗、絞碎、反復(fù)凍融4次和勻漿，得到粒度為2μ的組織液；2)將組織液在70℃下加熱11小時(shí)進(jìn)行殺菌、依次過100目、200目的分子篩，用美國PALL公司生產(chǎn)的超濾纖維素膜進(jìn)行純化，收集分子量小于30000道爾頓的組分；3)對收集的組分用孔徑為0.24μ的濾膜進(jìn)行過濾除菌；4)-60℃冷凍干燥后造粒，裝腸溶膠囊(180mg/粒)，得到膠囊劑型的產(chǎn)品。
經(jīng)檢測，用上述方法制備的羊胎素為白色微粒、微甜、無異味、易溶于水，不含防腐劑，符合標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例3、氨基酸含量分析分析儀器日立L-8500氨基酸分析儀。
分析條件分析柱日立#2622SC，緩沖液流速0.4mL/min。
對實(shí)施例1制備的羊胎素進(jìn)行氨基酸含量分析，結(jié)果如表1A所示


上述氨基酸含量分析結(jié)果表明本發(fā)明的羊胎素氨基酸含量較高，生物活性物質(zhì)含量豐富。
實(shí)施例4、本發(fā)明的羊胎素對表皮細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物歧化酶(SOD)的影響自由基的積累損傷作用是皮膚衰老的重要原因之一。超氧化物歧化酶(SOD)可清除氧自由基，具有保護(hù)細(xì)胞、延緩衰老的作用。
由于SOD分子量大，皮膚難于吸收，加之SOD屬于酶類，半衰期短且不穩(wěn)定，易受理化因素影響而失活，故外捈SOD類化妝品，很難達(dá)到宣傳效果。
現(xiàn)采用鄰苯三酚自氧化法和皮膚原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對本發(fā)明的羊胎素促進(jìn)表皮細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生超氧化物歧化酶(SOD)的能力進(jìn)行檢測。
一、表皮角朊細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)1、用包皮環(huán)切術(shù)取兒童包皮組織，用無菌PBS清洗，將標(biāo)本置于含100u/mL青霉素和100ug/mL鏈霉素的雙抗液中浸泡30分鐘后，在超凈臺中剪去皮下組織，并用PBS清洗兩次，將包皮組織剪成條狀，加入0.25％胰酶于4℃冷消化12-18小時(shí)，再置于37℃熱消化30分鐘，分離表皮層，將表皮層放入細(xì)胞培養(yǎng)液中，用研磨器輕輕研磨、吸管反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，低速離心5分鐘，棄上清后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL，接種于24孔板，置于二氧化碳孵箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。
2、棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用新鮮培養(yǎng)液稀釋實(shí)施例1制備的羊胎素樣品為0mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL和2mg/mL，加入24孔板中(每個(gè)樣品濃度做3個(gè)平行孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，其中0mg/mL為不加樣品的對照。
3、棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.25％胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌三遍，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，懸于PBS中，終濃度為50個(gè)/mL。反復(fù)凍融三次，渦旋器上劇烈振蕩2分鐘，10000rpm離心5分鐘，取上清測定SOD活性。
二、鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性SOD標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司產(chǎn)品(目錄號S-2515，批次號81K7587)，配制濃度1U/70μl。
對照品(空白參比)(0mg/mL)不加樣品的細(xì)胞裂解液。
測試品步驟一制備的不同濃度樣品的細(xì)胞裂解液。
溶液配制1)TE50mM Tris-HCl(pH8.2)，0.1mM EDTA。
2)PG6mM鄰苯三酚(pyrograllol)，配于10mM HCl中。
測定液(見表1)表1 測定液

測定方法為按表1中的劑量將TE分別與空白參比、SOD標(biāo)準(zhǔn)品及測試品混勻后，25℃恒溫10min，然后加入PG，立即用島津UV-1601分光光度計(jì)測量A320的吸光度變化率。再按下述公式計(jì)算SOD活性抑制率I＝(ΔA1/min-ΔA2/min)/(ΔA1/min)(ΔA1/min為空白參比的吸光度變化率，ΔA2/min為測試品的吸光度變化率)SOD活性(U)＝2ISOD活性測定結(jié)果如表2所示
表2 SOD活性測定結(jié)果

結(jié)果用上述檢測方法，以未加樣品的、同樣培養(yǎng)條件的表皮細(xì)胞裂解液為空白參比，測得樣品組細(xì)胞內(nèi)有SOD活性，即加入本發(fā)明的羊胎素24小時(shí)，能提高表皮細(xì)胞內(nèi)源性SOD活性。上述檢測結(jié)果表明可以本發(fā)明的羊胎素為活性成分制備外用護(hù)膚品，例如，其中的一個(gè)配方為羊胎素88％，甘油10％，香精2％。
實(shí)施例5、本發(fā)明羊胎素的免疫調(diào)節(jié)作用檢驗(yàn)待測樣品(受試物)實(shí)施例2制備的膠囊劑型的羊胎素(推薦量0.54g/人·日，相當(dāng)于9mg/Kg BW)，常溫下保存。
實(shí)驗(yàn)動物清潔級昆明種小鼠，192只，雌性，體重20-24g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證號京動許字99001，動物實(shí)驗(yàn)室合格證號SYXK(京)2002-0022)。
劑量選擇與受試物給予方式分別按推薦日攝入量(9mg/Kg Bw)的1、10、30倍，即9、90、270mg/Kg BW為三個(gè)劑量組，以去離子水為溶劑，按0.1mL/10g Bw經(jīng)口灌胃，每天一次，連續(xù)30天，同時(shí)另設(shè)陰性對照組，給予相同劑量的去離子水。
主要儀器與試劑電子秤、半自動生化分析儀、7200型分光光度計(jì)、血球計(jì)數(shù)儀、全自動酶標(biāo)儀、顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱、游標(biāo)卡尺、離心機(jī)、Hank’s液、新鮮羊血、新鮮雞血、生理鹽水、刀豆蛋白A、MTT、RPMI1640培養(yǎng)液、印度墨汁、乳酸鋰、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶I等。
實(shí)驗(yàn)方案動物檢疫3日，未見異常，可用于實(shí)驗(yàn)。選健康昆明小鼠192只，分為四批，每批48只，第一批為臟/體比值、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)、抗體形成細(xì)胞數(shù)(PFC)、血清半數(shù)溶血值(HC50)實(shí)驗(yàn)組；第二批為腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能實(shí)驗(yàn)組；第三批為碳廓清實(shí)驗(yàn)組；第四批為小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和NK細(xì)胞活性測定組。將每批動物再分為四組，每組12只，按設(shè)計(jì)劑量每天灌胃一次，連續(xù)30天，于末次給予受試物后對動物進(jìn)行各項(xiàng)免疫指標(biāo)測定。各項(xiàng)指標(biāo)具體的測定方法及結(jié)果如下一、免疫器官重量及臟/體比值變化1、免疫器官重量變化分別于注射后第0、1、2、3、4周對上述不同批次、不同劑量組小鼠稱重，采用”SPSS10.0for Windows”軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢測數(shù)據(jù)先經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，再進(jìn)行方差分析，如組間差異有顯著性，繼續(xù)進(jìn)行多個(gè)實(shí)驗(yàn)組語一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較。對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足“正態(tài)方差齊”要求后，用轉(zhuǎn)換所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、NK細(xì)胞活性測定數(shù)據(jù)需經(jīng)sin-1P1/2轉(zhuǎn)換，并經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)再進(jìn)行方差分析。數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表3-表6所示表3 第一批小鼠體重變化(X±S，g)

表4 第二批小鼠體重變化(X±S，g)

表5 第三批小鼠體重變化(X±S，g)

表6 第四批小鼠體重變化(X±S，g)


表3-表6數(shù)據(jù)表明，實(shí)驗(yàn)期間對照組及試驗(yàn)組動物生長良好，體重增長正常，對每批動物各劑量組每周體重進(jìn)行方差分析，其組間無顯著差異(P＞0.05)，表明本發(fā)明的羊胎素對受試動物體重?zé)o顯著影響。
2、臟器/體比值變化于注射后第30天取上述第一批小鼠的脾和胸腺，統(tǒng)計(jì)脾/體比值和胸腺/體比值，用與步驟1相同的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表7所示表7 臟器/體比值變化(X±S)

表7數(shù)據(jù)表明，各劑量組小鼠脾/體比值、胸腺/體比值無顯著變化，經(jīng)方差分析，其組間差異無顯著性(P＞0.05)二、細(xì)胞免疫功能測定1、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)于末次給予受試物后，給每組12只小鼠腹腔注射2％(V/V)的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)。4天后在其左后足趾部皮下注射20％(V/V)SRBC進(jìn)行攻擊。于攻擊前和攻擊后24小時(shí)分別測量左后足趾部厚度，計(jì)算攻擊前、后的差值，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表8所示表8 對小鼠DTH的影響(X±S)

*與陰性對照組比較，P＜0.05；**與陰性對照組比較，P＜0.01。
表8數(shù)據(jù)表明，中、高劑量組小鼠足趾增厚程度明顯高于陰性對照組，經(jīng)方差分析及多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較，其差異具有顯著性(P＜0.01或P＜0.05)。
2、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)對每組12只小鼠無菌取脾，制成脾細(xì)胞懸液，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，按照MTT法，在570nm波長處測定吸光度值(OD)。用加ConA孔的吸光度值減去不加ConA孔的吸光度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表9所示表9 對淋巴細(xì)胞的增殖能力的影響(X±S)

*與陰性對照組比較，P＜0.05；**與陰性對照組比較，P＜0.01。
表9數(shù)據(jù)表明，中、高劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力明顯高于陰性對照組，經(jīng)方差分析及多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較，其差異具有顯著性(P＜0.01或P＜0.05)。
三、體液免疫功能測定1、血清半數(shù)溶血值(HC50)測定給小鼠腹腔注射SRBC 5天后，摘其有求取血，進(jìn)行血清半數(shù)溶血值(HC50)測定，計(jì)算公式如下，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表10所示

表10 對小鼠血清半數(shù)溶血值(HC50)的影響(X±S)

表10數(shù)據(jù)表明，各劑量組小鼠血清半數(shù)溶血值(HC50)未見明顯升高，經(jīng)方差分析，其組間差異無顯著性(P＞0.05)。
2、PFC測定將步驟1取血清后的小鼠處死，取胸腺、脾臟稱重，計(jì)算臟器/體比值，同時(shí)制備脾細(xì)胞懸液，進(jìn)行抗體生成細(xì)胞(PFC)測定，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表11所示表11 對小鼠脾臟IgM PFC的影響(X±S)

表11數(shù)據(jù)表明，各劑量組小鼠脾臟抗體形成細(xì)胞數(shù)未見明顯升高，經(jīng)方差分析，其組間差異無顯著性(P＞0.05)。
四、單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能測定1、小鼠碳廓清試驗(yàn)給每組12只小鼠靜脈注射0.2mL經(jīng)稀釋的印度墨汁(用生理鹽水稀釋5倍)，待墨汁注入1分鐘和10分鐘后，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μl，并將其加到2mL 0.1％(V/V)Na2CO3溶液中，用7200型分光光度計(jì)在600nm波長處測吸光度值(OD)。將小鼠處死，取肝臟和脾臟稱重，計(jì)算吞噬指數(shù)(a)，計(jì)算公式如下，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表12所示

表12 對小鼠碳廓清能力的影響(X±S)

**與陰性對照組比較，P＜0.01。
表12數(shù)據(jù)表明，經(jīng)方差分析及多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較，高劑量組小鼠碳廓清指數(shù)明顯高于陰性對照組，其差異具有顯著性(P＜0.01)。
2、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)于末次給予受試物后，給每組12只小鼠腹腔注射1％(V/V)的雞紅細(xì)胞懸液1mL，間隔30分鐘后處死動物，用2mL Hank’s液沖洗腹腔，取腹腔洗液0.5mL滴片，37℃溫育30分鐘，甲醇固定，Giemsa染色，于油鏡下對每只動物計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表13所示表13 對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(X±S)

**與陰性對照組比較，P＜0.01。
表13數(shù)據(jù)表明，中、高劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)明顯增高，經(jīng)方差分析及多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較，中、高劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)明顯高于陰性對照組，其差異具有顯著性(P＜0.01)。
五、NK細(xì)胞活性測定試驗(yàn)前24小時(shí)，將靶細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，按乳酸脫氫酶(LDH)法在酶標(biāo)儀490nm處測吸光度值(OD)，計(jì)算NK細(xì)胞活性，計(jì)算公式如下，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表

表14 對小鼠NK細(xì)胞活性的影響(X±S)

表14數(shù)據(jù)表明，各劑量組小鼠NK細(xì)胞活性未見明顯升高，經(jīng)方差分析，其組間差異無顯著性(P＞0.05)。
綜上所述，本發(fā)明的羊胎素對小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用。
實(shí)施例6、美容(祛黃褐斑)功能人體試食試驗(yàn)受試物實(shí)施例2制備的腸溶膠囊劑型的羊胎素。
受試對象按自愿原則選擇18-65歲，具有黃褐斑受試者30例。
診斷標(biāo)準(zhǔn)頭面部肉眼觀察可見黃褐色斑，多發(fā)于顴、頰、額、鼻、唇周等處，無痛癢等癥狀。
納入者標(biāo)準(zhǔn)凡生有黃褐斑的自愿受試者，經(jīng)體檢合格均可進(jìn)行試食觀察。
排除者標(biāo)準(zhǔn)1)年齡在18歲以下或65歲以上者，妊娠或哺乳期婦女，對本發(fā)明的羊胎素過敏者；2)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，未按規(guī)定用受試物，無法判定功效或資料不全影響功效或安全性判斷者。
對照形式采用自身前后對照形式。
服用劑量及時(shí)間每次3粒，每日2次，連續(xù)服用30天，受試者在試驗(yàn)期間停止服用有關(guān)養(yǎng)顏祛斑的藥物或其它保健品及化妝品。
儀器與試劑F-820型血球計(jì)數(shù)儀，MIDIRON尿十項(xiàng)分析儀(德國產(chǎn))，Olympus全自動生化分析儀(日本產(chǎn)，型號AU600)，《實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)色卡》(中國科學(xué)院地理研究所設(shè)計(jì)研制，測繪出版社出版，1992，第一版)。
對下述指標(biāo)進(jìn)行檢測(試驗(yàn)前后各檢查一次)一、功效性檢測共觀察黃褐斑受試者30例，均為女性，年齡最小25歲，最大48歲，平均38.93±5.69歲，平均病程5.07±2.96年。
1、臨床癥狀改善情況受試前詳細(xì)詢問病史，了解受試者飲食情況，觀察主要臨床癥狀疲勞感、煩躁、睡眠等。按癥狀輕重(重癥3分、中度2分、輕癥1分)在試食前后統(tǒng)計(jì)積分值，并就其主要癥狀改善(每一癥狀改善2分顯效，改善1分為有效)，計(jì)算改善率。主要癥狀改善情況如表15所示表15 主要癥狀改善情況

癥狀積分變化如表16所示表16 癥狀積分變化

**P＜0.01。
表15和表16的檢測結(jié)果表明，本發(fā)明的羊胎素對受試者的疲勞感、煩躁及睡眠等癥狀均有改善作用。
2、祛斑功效檢測1)頭面部黃褐斑面積大小改變情況用標(biāo)尺測量受試者受試前后同一黃褐斑的長徑和寬徑，計(jì)算面積(cm2)，結(jié)果如表17所示表17 黃褐斑面積大小變化

**P＜0.01。
2)頭面部黃褐斑顏色深淺變化按照《實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)色卡》(中國科學(xué)院地理研究所設(shè)計(jì)研制，測繪出版社出版，1992，第一版)中的棕色(Y+M+Bk，即黃+品紅+黑的疊色)色卡為黃褐斑顏色深淺的判斷標(biāo)準(zhǔn)I度(15、20、5)，II度(30、40、10)，III度(40、60、15)，結(jié)果如表18所示表18 黃褐斑顏色深淺變化

*P＜0.05。
3)功效判定現(xiàn)根據(jù)上述頭面部黃褐斑面積大小及顏色深淺的改變情況對本發(fā)明的羊胎素的祛斑功效進(jìn)行判定，判定標(biāo)準(zhǔn)如下顯效黃褐斑顏色下降II度，或面積縮小≥30％，不產(chǎn)生新的黃褐斑。
有效黃褐斑顏色下降I度，或面積縮?。?0％，≥10％不產(chǎn)生新的黃褐斑。
無效黃褐斑面積縮小＜10％，顏色無明顯變化。
根據(jù)上述判定標(biāo)準(zhǔn)得出的本發(fā)明的羊胎素的祛斑功效判定結(jié)果如表19所示表19 祛斑功效判定結(jié)果

30例黃褐斑受試者按要求服用本發(fā)明的羊胎素膠囊30天，黃褐斑面積平均縮小5.13±8.79cm2(P＜0.01)，黃褐斑顏色變淺，色卡平均降低0.42±0.40(P＜0.05)，其中顯效3例，有效18例，總有效率達(dá)70.00％，表明本發(fā)明的羊胎素膠囊具有較高的美容(祛黃褐斑)效果。
二、安全性檢測對試食前、后的受試者的下述生理、生化指標(biāo)進(jìn)行檢測1)血液及尿常規(guī)檢查紅細(xì)胞、血紅蛋白及白細(xì)胞計(jì)數(shù)，尿十項(xiàng)檢測；2)生化指標(biāo)血清蛋白ALB，總蛋白TP，心肝腎功能(谷草轉(zhuǎn)氨酶AST，谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT，尿素UREA，肌苷CRE)，血糖GLU，血脂(總膽固醇TC，甘油三酯TG)；3)腹部B超，心電圖，X線胸部透視。
其中，1)和2)中的安全性指標(biāo)檢測結(jié)果如表20所示表20 安全性指標(biāo)檢測結(jié)果

表20的數(shù)據(jù)表明，受試者試食前、后各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)；此外，受試者腹部B超、心電圖及X線胸部透視檢測結(jié)果也均正常，表明本發(fā)明的羊胎素對人身體健康無不良影響，服用安全。
權(quán)利要求
1.一種制備羊胎素的方法，包括以下步驟1)在無菌條件下，以2-3個(gè)月齡的羊胚胎為原料，經(jīng)清洗、絞碎、凍融和勻漿，得到粒度為2-50μ的組織液；2)將組織液在65-70℃下加熱殺菌、過分子篩和超濾，收集分子量小于30000道爾頓的組分；3)對收集的組分進(jìn)行微孔過濾除菌，濾膜孔徑為0.20-0.45μ；4)冷凍干燥后得到羊胎素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中凍融的次數(shù)為2-4次，其中冷凍的溫度為-10℃至-30℃；所述步驟2)中加熱殺菌的時(shí)間為9-11小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述加熱殺菌的時(shí)間為10小時(shí)，溫度為65℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中分子篩的孔徑依次為100目、200目；超濾所用的濾膜為生物纖維素膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述生物纖維素膜為美國PALL公司生產(chǎn)的SER#33094048R生物纖維素膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將所述步驟4)中得到的羊胎素造粒，裝膠囊，得到膠囊劑型的羊胎素產(chǎn)品。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述膠囊為腸溶膠囊。
8.用權(quán)利要求1-7所述方法制備得到的羊胎素。
9.一種護(hù)膚品，其活性成分為權(quán)利要求8所述的羊胎素。
10.權(quán)利要求8所述的羊胎素在制備護(hù)膚品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羊胎素及其制備方法。其制備方法包括以下步驟1)在無菌條件下，以2－3個(gè)月齡的羊胚胎為原料，經(jīng)清洗、絞碎、凍融和勻漿，得到粒度為2－50μ的組織液；2)將組織液在65－70℃下加熱殺菌、過分子篩和超濾進(jìn)行純化，收集分子量小于30000道爾頓的組分；3)對收集的組分進(jìn)行微孔過濾除菌，濾膜孔徑為0.20－0.45μ；4)冷凍干燥后得到羊胎素。本發(fā)明的羊胎素為白色微粒、微甜、無異味、易溶于水，不含防腐劑，服用方便、適用人群廣、保質(zhì)期長，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場前景。
文檔編號A61Q19/08GK1843377SQ200610003550
公開日2006年10月11日 申請日期2006年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月13日
發(fā)明者周中慧, 王玉芝, 王宏權(quán) 申請人:北京凱詩倫生物技術(shù)有限公司