瘙癢的抑制的制作方法
【專利說明】瘦癢的抑制
[0001 ]本發(fā)明提供用于抑制或治療痊癢的方法和組合物。
[0002] 痊癢、醫(yī)學(xué)上稱作痊癢癥，已經(jīng)被定義為"引起對搔抓的欲望或反射的令人不愉快 的皮膚感覺"。具有嚴重痊癢的患者通常發(fā)現(xiàn)因相關(guān)的不適感和屯、理素亂例如抑郁或睡眠 剝奪而難W過正常的生活。痊癢還可W是虛弱性病癥，其附帶眾多的皮膚、全身和神經(jīng)系統(tǒng) 障礙。
[0003] 推定痊癢的發(fā)生是為了防止動物受到小的粘性威脅，例如昆蟲和植物尖刺，它們 無法通過與感覺痛相關(guān)的回縮響應(yīng)被有效地除去。密切的發(fā)展相關(guān)性因痊癢與疼痛神經(jīng)元 之間的重疊而是顯而易見的：兩者均通過無髓銷的C-型神經(jīng)纖維(傷害性感受器）的游離神 經(jīng)末梢介導(dǎo)。存在眾多能夠刺激運些神經(jīng)的介體，例如生物胺類、生物堿類、蛋白酶和膚類。 傷害性感受器通過其周圍軸突檢測介體并且將信號傳送至脊髓，W便在腦中產(chǎn)生例如痊癢 知覺。對于臨床醫(yī)師，痊癢與疼痛之間的重疊意味著:可W導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛的相同神經(jīng)性疾 病也可W導(dǎo)致神經(jīng)性痊癢。然而，存在差異。大部分有效地針對疼痛的治療對痊癢無效。值 得注意的是，一些止痛藥如阿片樣疼痛緩解劑(例如嗎啡)甚至導(dǎo)致或惡化痊癢。
[0004] 近期的研究已經(jīng)開始將痊癢線路的特征與疼痛分開描述。已經(jīng)提出：痊癢的特征 在于被傷害性感受器亞組傳遞，稱作"癢覺感受器(pruriceptors)"或痊癢-特異性神經(jīng)纖 維，其位于真皮表皮接合處和表皮內(nèi)。認為一些特異性地在背根神經(jīng)節(jié)(DRG)或=叉神經(jīng)中 的感覺神經(jīng)元中表達的G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)在痊癢獨特性感覺中起到必不可少的作 用。運組受體近期被鑒定為痊癢獨特性的（即它們不牽設(shè)疼痛線路），并且提供了針對抑制 痊癢的潛在治療祀標。
[000引根據(jù)2000年進行的全球疾病負擔(dān)(Global Burden Of Disease)(GBD)研究，4%的 人群(約2.8億）患有與痊癢相關(guān)的病癥。目前的抗組胺藥和皮質(zhì)類固醇藥可W緩解一些類 型的急性痊癢和小百分比的慢性痊癢類型。然而，它們無法治療因腎病和肝病、癌癥和皮膚 病例如特應(yīng)性皮炎導(dǎo)致的大部分慢性痊癢病例。此外，抗組胺藥僅能夠?qū)菇M胺依賴性痊 癢(通常由過敏性刺激引起）。然而，非組胺依賴性痊癢占據(jù)痊癢病例的大部分。
[0006] 嚴重的搔抓可W損傷皮膚，使得它傾向于感染，其中嚴重的牽設(shè)免疫損傷宿主(其 中痊癢可能是病癥或藥物反應(yīng)繼發(fā)的）。此外，因痊癢而損傷和感染的皮膚通常加劇了 "痊 癢-抓曉-痊癢循環(huán)"（運種痊癢循環(huán)需要抓曉且抓曉進一步加劇了痊癢）。由臨床醫(yī)師推薦 的緩解痊癢的其它技術(shù)包括:光療法;穿戴松弛的棉布衣服;頻繁地在溫水中短暫沐浴和維 持30%-40%濕度水平的清涼環(huán)境。然而，運些預(yù)防措施始終不能維持。因此，本領(lǐng)域中需 要用于抑制或治療痊癢的新藥劑。
[0007] 本發(fā)明解決了運種需求，其解決了上述舉出的問題的一種或多種。
[000引發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明通過提供用于抑制或治療受試者(例如患者)的痊癢的融合蛋白、解決了上 述舉出問題的一種或多種，所述融合蛋白包含：
[0010] (i)非細胞毒性蛋白酶，該蛋白酶能夠裂解痊癢-特異性DR巧申經(jīng)元或癢覺感受器 中的SNARE(可溶性N-乙基馬來酷亞胺敏感性因子附著蛋白受體)蛋白；
[0011] (ii)能夠結(jié)合至痊癢-特異性DR巧巾經(jīng)元或癢覺感受器上的結(jié)合位點的祀向部分 (TM),所述結(jié)合位點能夠經(jīng)歷胞吞作用而被并入痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器內(nèi)的 內(nèi)體，且其中所述痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器表達所述SNARE蛋白；和 [001引（iii)能夠使來自內(nèi)體內(nèi)的蛋白酶易位、通過內(nèi)體膜并且進入痊癢-特異性DRG神 經(jīng)元或癢覺感受器的胞質(zhì)溶膠的易位結(jié)構(gòu)域；
[0013] 條件是該多膚不是梭菌神經(jīng)毒素(全毒素)分子。
[0014] 第一個方面還包括用于抑制或治療痊癢的相應(yīng)方法，該方法包括對患者施用治療 有效量的本發(fā)明的多膚。
[001引發(fā)明詳述
[0016] 本發(fā)明的多膚不是天然存在的梭菌神經(jīng)毒素分子(也稱作梭菌全毒素）。梭菌全毒 素是已知對人最致命性的神經(jīng)毒素之一，且因此作為治療分子具有明顯的限制。此外，在抑 制痊癢的情況下，梭菌全毒素與不期望的祀點脫離(off-site targeting)相關(guān)，即祀向非 痊癢途經(jīng)的神經(jīng)細胞的細胞。
[0017] 在應(yīng)用中，本發(fā)明的多膚結(jié)合于痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器上的受體。 易位成分影響蛋白酶成分轉(zhuǎn)運入痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器的胞質(zhì)溶膠。最終， 一旦到達內(nèi)部，則蛋白酶通過裂解痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器胞質(zhì)溶膠中存在的 SNARE蛋白而抑制痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器的細胞外融合過程。因此，通過使痊 癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器的細胞外融合器失活，本發(fā)明的多膚抑制神經(jīng)遞質(zhì)從其 中分泌。因此，本發(fā)明的多膚降低了從痊癢-特異性DR巧申經(jīng)元或癢覺感受器傳送至脊髓的 神經(jīng)遞質(zhì)水平，且由此能夠抑制或治療痊癢。在一個實施方案中，神經(jīng)遞質(zhì)是乙酷膽堿。在 一個優(yōu)選的實施方案中，神經(jīng)遞質(zhì)是谷氨酸鹽。在另一個優(yōu)選的實施方案中，神經(jīng)遞質(zhì)是促 胃液素釋放蛋白（GRP)。
[0018] 本發(fā)明的多膚類提供超過其它治療劑的顯著優(yōu)勢，因為它們具有抑制從特異性祀 細胞即痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器中分泌的潛能。相反，其它提出的治療劑尋求 通過嘗試使用介導(dǎo)運種效應(yīng)的受體括抗劑減輕痊癢。然而，本發(fā)明提供特異性阻斷神經(jīng)遞 質(zhì)從其產(chǎn)生部位分泌的手段。
[0019] 本發(fā)明的主要祀細胞是痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器。DRG細胞通過脊柱 沿脊椎定位，并且是GPCRs例如化即巧1、化甜rA3或化即rCl 1的表達位點，它們已被鑒定為 痊癢-特異性受體。
[0020] 本發(fā)明的融合蛋白在與相應(yīng)的"游離"TM(即分離的TM本身）比較時一般顯示針對 祀細胞減少的結(jié)合親和力(在至多10至100-倍的范圍）。然而，盡管存在運種觀察結(jié)果，但是 本發(fā)明的融合蛋白令人驚奇地顯示出良好的效能。運可W歸因于兩種主要的特征。首先，非 細胞毒性蛋白酶成分是催化性的-因此，少量運類分子的治療作用在祀細胞內(nèi)得W快速地 擴增。其次，存在于祀細胞上的受體僅需要作為治療劑進入的入口起作用，且不一定需要被 刺激至達到配體-受體介導(dǎo)的藥理學(xué)響應(yīng)所需的水平。因此，可W W低于用于其它類型治療 分子的劑量施用本發(fā)明的融合蛋白，其它類型的治療分子典型地W高微克至毫克(甚至達 到數(shù)百毫克）用量施用。相比之下，本發(fā)明的融合蛋白可W W低得多的劑量施用，典型地至 少低10-倍，且更典型地低100-倍。 巧〇引]非細胞毒性蛋白酶
[0022] 本發(fā)明TSI多膚類的生物活性成分是非細胞毒性蛋白酶。因此，一旦被遞送入祀細 胞的胞質(zhì)溶膠，則非細胞毒性蛋白酶成分影響期望祀細胞內(nèi)的SNARE裂解。因為SNARE蛋白 是哺乳動物細胞內(nèi)的分泌過程的必要成分，故其蛋白水解失活抑制/阻止從所述細胞分泌。
[0023] 非細胞毒性蛋白酶是不殺傷細胞的離散類分子;而它們通過抑制非蛋白質(zhì)合成的 細胞過程起作用。非細胞毒性蛋白酶由各種高級生物體(例如植物和動物)產(chǎn)生-運類高級 生物體的實例是己西全蝸(Brazilian scorpion)。此外，非細胞毒性蛋白酶由各種微生物、 特別是細菌例如梭菌屬(Clostridi皿sp.)和奈瑟球菌屬(Neisseria sp.)產(chǎn)生。
[0024] 梭菌神經(jīng)毒素代表主要的一組非細胞毒性毒素分子，并且包含通過二硫鍵連接的 兩個多膚鏈。兩個鏈稱作具有約l〇〇W)a分子量的重鏈化-鏈)和具有約SOkDa分子量的輕鏈 a-鏈）。輕鏈具有蛋白酶功能并且展示出對牽設(shè)細胞外過程的囊泡或質(zhì)膜相關(guān)SNARE蛋白 (例如突觸融合蛋白、SNAP和突觸泡蛋白（或VAMP))的高底物特異性。運些底物是細胞分泌 器的必需成分。
[0025] 顯然大部分來自淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeas)種類的奈瑟球菌屬產(chǎn)生功能類似 的非細胞毒性毒素分子。運類非細胞毒性蛋白酶的實例是IgA蛋白酶(參見W099/58571)。類 似的IgA蛋白酶由鏈球菌屬（streptococci)例如肺炎鏈球菌（Sheptococ州S pneumoniae) 產(chǎn)生。
[0026] 因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的非細胞毒性蛋白酶可W是梭菌神經(jīng)毒素蛋白 酶或IgA蛋白酶(例如參見WO 99/032272)。非細胞毒性蛋白酶的另一個實例是蝸毒液蛋白 酶，例如來自己西全蝸己西錯蝸（T i tyus S erru 1 atus)的毒液的那些或蛋白酶an tar eas e (例如參見WO 2011/022357)。 巧027] 祀向部分(TM)
[0028] 現(xiàn)在轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明的祀向部分(TM)成分，運種成分是使本發(fā)明的多膚結(jié)合至痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器的成分。TM優(yōu)選是膚。
[0029] 在應(yīng)用中，本發(fā)明的多膚結(jié)合至痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器。此后，該多 膚的易位成分影響蛋白酶成分轉(zhuǎn)運入痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器的胞質(zhì)溶膠。最 終，一旦到達內(nèi)部，則蛋白酶通過裂解痊癢-特異性DR巧申經(jīng)元或癢覺感受器胞質(zhì)溶膠中存 在的SNARE蛋白來抑制痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器的細胞外融合過程。因此，通過 使痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器的細胞外融合器失活，本發(fā)明的多膚抑制神經(jīng)遞質(zhì) 從其中分泌。因此，本發(fā)明的多膚減少痊癢-感覺信號通過脊髓傳送至腦，且由此能夠抑制 或治療痊癢。
[0030] TM結(jié)合痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器上的結(jié)合位點，由此提供所述多膚對 運一種類祀細胞超過其它細胞的選擇性。在運方面，本發(fā)明優(yōu)選的TM實施方案包括抗體(例 如單克隆抗體、抗體片段例如化6少(36)'2少巾、5〇。巾等和抗體結(jié)構(gòu)域膚類)和結(jié)合骨架，它 們結(jié)合如下鑒定的受體。因此，本發(fā)明的多膚類可W包括商購抗體或結(jié)合骨架，它們已經(jīng)被 設(shè)計成實現(xiàn)與所述祀細胞或受體的特異性結(jié)合?；蛘撸瑑?yōu)選的TMs包括生物胺類、生物堿類、 蛋白酶、膚配體和神經(jīng)膚類。
[0031] 本發(fā)明的TM結(jié)合至痊癢-特異性DR巧申經(jīng)元或癢覺感受器。作為實例，本發(fā)明多膚 的TM結(jié)合痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器上的G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，其選自Mas-相 關(guān)G-蛋白受體（例如化甜巧1、化甜rA3或化甜rCll)。
[0032] 在一個實施方案中，TM選自牛腎上腺髓質(zhì)膚（例如BAM8-22)、促黑激素膚（例如丫 2-M甜）、終止于RF/Y-G或RF/Y-酷胺中的神經(jīng)膚(例如NPFF或NPAF)、包含化IG化-NH2的膚、 生物堿類(例如氯哇）、生物胺類(辣椒素、組胺、血清素、皮質(zhì)抑素(cortistatin))W及其截 短物或膚類似物。
[0033] 在一個實施方案中，本發(fā)明多膚的TM結(jié)合至痊癢-特異性DRG神經(jīng)元或癢覺感受器 上的受體，其選自化即巧1、化即rA3或化甜rCl 1。所有運些受體均在痊癢-特異性DRG神經(jīng)元 或癢覺感受器上表達。
[0034] 在一個實施方案中，TM選自：BAMs-22、丫 2-M甜、肥。。、肥4。、5116化-畑2、氯哇、辣椒 素、組胺、血清素、皮質(zhì)抑素及其截短物和膚類似物。
[003引在一個實施方案中，本發(fā)明多膚的TM結(jié)合至化即r受體，且優(yōu)選化即巧、化即rA或 化甜rC。在一個實施方案中，本發(fā)明多膚結(jié)合至化甜Xl或化甜rA3或化即rCl 1。作為實例，適 合的TMs包括:BAMs-22、氯哇、丫 2-M甜、終止于RF/Y-G或RF/Y-酷胺中的神經(jīng)膚類（例如NPFF 或NPAF)、辣椒素、組胺、血清素或皮質(zhì)抑素。運些TMs優(yōu)選結(jié)合Mr甜rs。
[0036] 在一個優(yōu)選的實施方案中，TM結(jié)合化即巧受體，優(yōu)選Mr即巧1;還優(yōu)選TM是BAM8-22 或其截短物或膚類似物。 咖別易位結(jié)構(gòu)域
[0038]本發(fā)明的易位成分能夠?qū)⒎羌毎拘缘鞍酌?或其片段)易位入祀細胞，使得蛋白 酶活性的功能表達發(fā)生在祀細胞的胞質(zhì)溶膠內(nèi)。所述易位成分優(yōu)選能夠在低pH條件下在脂 質(zhì)膜(例如內(nèi)體膜）內(nèi)形成離子可滲透的孔。易位成分可W得自微生物蛋白來源，例如細菌 或病毒蛋白來源。因此，在一個實施方案中，所述易位成分包含酶的易位結(jié)構(gòu)域或由其組 成，例如細菌毒素。在另一個實施方案中，所述易位結(jié)構(gòu)域包含病毒蛋白的易位結(jié)構(gòu)域或由 其組成。在一個實施方案中，本發(fā)明的易位成分可W包含梭菌神經(jīng)毒素 H-鏈或其片段或由 其組成，例如梭菌神經(jīng)毒素的化結(jié)構(gòu)域(或其易位成分）。 巧039] 多膚制備
[0040] 本發(fā)明的多膚類包含3種主要成分："生物活性"（即非細胞毒性蛋白酶）；TM;和易 位結(jié)構(gòu)域。與制備運類融合蛋白相關(guān)的通用技術(shù)通常稱作再祀向毒素技術(shù)。作為示例，我們 參考:W094/21300 ;W096/33273 ;W098/07864 ;W000/10598 ;W001/21213 ;W006/059093; WOOO/ 62814;胖000/04926;胖093/15766;胖000/61192;和胖099/58571。將所有運些公開文本并入本 文參考。
[0041] 更具體地，可W使本發(fā)明的TM成分與本發(fā)明的蛋白酶成分或易位成分融合。所述