抑制酪蛋白激酶2活性在促進(jìn)i型干擾素表達(dá)的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)治療領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及酪蛋白激酶2抑制劑在促進(jìn)I 型干擾素及其下游基因表達(dá)中的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] I型干擾素包括IFNa和IFN0兩種，它們與細(xì)胞表面的干擾素受體結(jié)合后激活蛋 白激酶Jakl和Tyk2,隨后活化轉(zhuǎn)錄因子STAT1或/和STAT2,誘導(dǎo)上百種基因的表達(dá)（干 擾素誘導(dǎo)基因，ISGs)，包括MX1、MX2、Rsad2/Viperine、CXCL10/IP-10 等。
[0003] 干擾素誘導(dǎo)的這些基因在細(xì)胞的繁殖和凋亡、血管生成、T細(xì)胞免疫反應(yīng)等過(guò)程中 起著重要的生理作用。因此I型干擾素在免疫相關(guān)性疾病中的應(yīng)用得到了廣泛的研究。
[0004] I型干擾素的表達(dá)是受模式識(shí)別受體（PRRs，PatternRecognitionReceptors)及 其介導(dǎo)的信號(hào)通路所誘導(dǎo)的。這些模式識(shí)別受體包括Toll樣受體（Toll-likereceptors/ TLRs)、NOD樣受體（NOD-1ikereceptors/NLRs)、RIG-I樣受體（RIG-I-1ikereceptors/ RLRs)和胞衆(zhòng)內(nèi)DNA受體（cytosolicDNAsensors，Q)Ss)通過(guò)識(shí)別組織中死亡的細(xì)胞所 分泌的RNA和DNA等"模式分子"（PAMPs，Pathogen-AssociatedMolecularPatterns)，激 活復(fù)雜的信號(hào)通路（包括蛋白激酶TBK1、IKKα/β和MAPkinases)，活化關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因 子IRF3、NFκB和AP-1等，誘導(dǎo)I型干擾素、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，激活天然免疫和 適應(yīng)性免疫反應(yīng)，實(shí)施宿主防御和組織修復(fù)等生理功能。
[0005] 但是I型干擾素表達(dá)過(guò)量或異常也會(huì)引起疾病，特別是系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免 疫性疾病，因此體內(nèi)往往存在調(diào)控I型干擾素的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制，以避免干擾素的異常表達(dá)。這 些調(diào)控機(jī)制往往導(dǎo)致在病理狀態(tài)下，I型干擾素也不能有效的表達(dá)，從而導(dǎo)致各種免疫反應(yīng) 不足的相關(guān)性疾病。因此如何在病理狀態(tài)下，突破機(jī)體調(diào)控I型干擾素表達(dá)的機(jī)制，從而有 效地治療免疫相關(guān)性疾病，是基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一個(gè)重要課題。
[0006] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)一種提高人體自身I型干擾素表達(dá)，提高人體免疫功 能的有效方法，以治療多種感染性和非感染性的人類(lèi)疾病。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明提供了一種CK2抑制劑在促進(jìn)I型干擾素表達(dá)中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明第一方面，提供了一種酪蛋白激酶2(Caseinkinase2,CK2)抑制劑的用 途，（i)用于制備促進(jìn)I型干擾素（IFNa/β)和/或I型干擾素誘導(dǎo)基因或其蛋白表達(dá)的 藥物組合物；和/或（ii)用于制備治療和/或預(yù)防I型干擾素缺乏相關(guān)疾病的藥物組合 物。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的CK2來(lái)源于哺乳動(dòng)物，較佳地，來(lái)源于人、小鼠、大鼠。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的I型干擾素缺乏是指在疾病發(fā)生前和或/疾病發(fā)生后，I 型干擾素表達(dá)量和/或活性的降低。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的I型干擾素缺乏相關(guān)疾病是指缺乏I型干擾素會(huì)導(dǎo)致疾 病的發(fā)生和/或加重、且提高I型干擾素的表達(dá)量和/或活性后能夠?qū)λ黾膊∑鸬街委?和/或預(yù)防作用的疾病。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑包括CK2的反義核酸、抑制性microRNA、抗體或小 分子化合物。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗體包括小分子多肽。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑為CK2基因的siRNA、shRNA。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的CK2基因的shRNA如（SEQIDNO. : 1-2所示）
[0016]Forward(SEQIDNO. :1):
[0017] 5'CCGGCCGAGTTGCTTCTCGATATTTCTCGAGAAATATCGAGAAGCAACTCGGTTTTTG3' ；
[0018] Reverse(SEQIDNO. :2):
[0019] 5' AATTCAAAAACCGAGTTGCTTCTCGATATTTCTCGAGAAATATCGAGAAGCAACTCGG 3'。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的CK2蛋白的氨基酸序列的Genbank登錄號(hào)為 ΝΡ_031814· 2 (小鼠）和ΝΡ_808227· 1 (人）。
[0021 ] 在另一優(yōu)選例中，所述的CK2蛋白的編碼核苷酸序列的Genbank登錄號(hào)如ΝΜ_007788· 3 (小鼠）和NM_177559 (人）所示。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的I型干擾素缺乏相關(guān)疾病包括：病毒感染性疾病、惡性腫 瘤、多發(fā)性硬化。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的病毒感染性疾病包括感染了以下的病毒的疾病：?jiǎn)渭儼?疹病毒（HSV)、水泡病毒（VSV)、卡波希氏瘤皰疹病毒（KSHV)、呼吸道合胞病毒（RSV)、手足 口病病毒（腸道病毒EV71和CA16)乙型肝炎病毒（HBV)、丙型肝炎病毒（HCV)、人類(lèi)獲得性 免疫缺陷病毒/艾滋病病毒（HIV);和/或
[0024] 所述的惡性腫瘤包括以下腫瘤：多毛細(xì)胞白血?。╤airycellleukaemia)、慢 性髓性白血?。–ML)、淋巴瘤（lymphoma)、骨髓瘤（myeloma)、黑色素瘤（melanoma)、腎細(xì) 胞癌與膀脫癌（renalcellandbladdercellcarcinoma)、卡波希氏肉瘤（Kaposi's sarcoma)〇
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的病毒為感染細(xì)胞后能夠激活模式識(shí)別受體的病毒。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑還用于抑制病毒和/或腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述CK2抑制劑還用于抑制病毒的復(fù)制和組裝。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的I型干擾素和/或I型干擾素誘導(dǎo)基因或其蛋白的表達(dá) 包括誘導(dǎo)產(chǎn)生和/或提高I型干擾素和/或I型干擾素誘導(dǎo)基因或其蛋白的表達(dá)量和/或 活性。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑為小分子化合物，較佳地，包括四溴苯三唑（TBB)、 CX-4945(Silmitasertib)、DMAT(2-二甲氨基-4, 5, 6, 7-四溴-1H-苯并咪唑）、山奈酚、 酪氨酸磷酸化抑制劑AG114(TyrphostinAG114)、四溴肉桂酸、3-[[5-(4_甲苯基）噻 吩[2,3-d]嘧啶-4-yl]硫基]丙酸（TTP22)、CX-5011、鞣花酸（EllagicAcid)、3-甲 基-1，6, 8-三氫蒽醌（emodin)、4'，5, 7-三羥基黃酮（apigenin)。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的I型干擾素誘導(dǎo)基因或其蛋白包括CXCL10/IP-10、 STAT1、MX1、MX2、Rsad2/Viperine、磷酸激酶TBK1、干擾素調(diào)節(jié)因子 3 (IRF3)。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的I型IFN包括IFN-α、IFN-β。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物包括作為活性成分的CK2抑制劑，和藥學(xué)上 可接受的載體。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的CK2抑制劑的有效濃度為1-1000μM，較佳地，為 20-100 μΜ〇
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的CK2抑制劑對(duì)I型干擾素和/或I型干擾素誘導(dǎo)基因或 其蛋白的促進(jìn)作用呈劑量依賴(lài)性。
[0035] 本發(fā)明第二方面，提供了一種體外非治療性的促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)I型干擾素和/或I 型干擾素誘導(dǎo)基因或其蛋白和/或體外非治療性的抑制I型干擾素缺乏相關(guān)病毒細(xì)胞和/ 或腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括步驟：在CK2抑制劑的存在下，培養(yǎng)細(xì)胞，從而促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)I 型干擾素和/或I型干擾素誘導(dǎo)基因或其蛋白抑制I型干擾素缺乏相關(guān)病毒細(xì)胞和/或腫 瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞、或?yàn)镈NA或RNA病毒感染的細(xì)胞。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法還可用于制備I型干擾素或其誘導(dǎo)蛋白，例如收集 并純化細(xì)胞培養(yǎng)體系中獲得的I型干擾素或其誘導(dǎo)蛋白。
[0038] 本發(fā)明第三方面，提供了一種篩選能夠抑制CK2的化合物的方法，包括步驟：
[0039] (a)在試驗(yàn)組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系加入待測(cè)化合物，并測(cè)定I型干擾素的表達(dá)量和 /或活性；在對(duì)照組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系不加入待測(cè)化合物，并測(cè)定I型干擾素的表達(dá)量和/ 或活性；
[0040] 其中，若試驗(yàn)組中I型干擾素的表達(dá)量和/或活性顯著高于對(duì)照組，則說(shuō)明所述的 候選化合物為能夠抑制CK2的化合物和/或
[0041] (a2)在試驗(yàn)組中，向病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入待測(cè)化合物，并測(cè)定細(xì)胞培 養(yǎng)體系中病毒的滴度；在對(duì)照組中，向病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入待測(cè)化合物，并測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)體系中的病毒滴度；
[0042] 其中，若試驗(yàn)組病毒的滴度顯著低于對(duì)照組，則說(shuō)明所述的候選化合物為能夠抑 制CK2的化合物。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟：
[0044] (b)對(duì)（a)中的化合物進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)酪蛋白激酶2或I型干擾素誘導(dǎo)基因或其 蛋白的促進(jìn)作用。
[0045] 本發(fā)明第四方面，提供了一種制備I型干擾素的方法，包括步驟：
[0046] ⑴在CK2抑制劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞；
[0047](ii)收集、分離并純化細(xì)胞培養(yǎng)液中的I型干擾素。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，在L929細(xì)胞中加入CK2抑制劑，在非感染條件下培養(yǎng)12-48小 時(shí)或者在病毒感染條件下培養(yǎng)12-24小時(shí)。收集上清，利用HPLC純化I型干擾素。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞還包括成纖維細(xì)胞、或巨噬細(xì)胞。
[0050] 本發(fā)明第五方面，提供了一種CK2基因或其蛋白的用途，用于制備降低I型干擾素 和/或I型干擾素誘導(dǎo)基因或其蛋白表達(dá)的藥物組合物。
[0051] 本發(fā)明第六方面，提供了一種治療病毒性感染的方法，向需要治療的對(duì)象施用CK2 抑制劑，從而治療病毒性感染。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述需要治療的對(duì)象為哺乳動(dòng)物，較佳地，為人。
[0053] 本發(fā)明第七方面，提供了一種（i)治療I型干擾素缺乏相關(guān)疾病；和/或（ii)促 進(jìn)I型干擾素和/或I型干擾素誘導(dǎo)基因或其蛋白表達(dá)的藥物組合物，所述的藥物組合物 包括作為活性成分的CK2抑制劑，和藥學(xué)上可以接受的載體。
[0054] 本發(fā)明第八方面，提供了一種判斷CK2抑制劑是否對(duì)腫瘤或病毒有效的方法，包 括步驟：
[0055] (a)向腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入CK2抑制劑；
[0056] (b)觀察加入CK2抑制劑前后所述培養(yǎng)體系中I型干擾素的表達(dá)量和/或活性；
[0057] 其中，當(dāng)加入CK2抑制劑后I型干擾素的表達(dá)量和/或活性II較加入之前的表達(dá) 量和/或活性10有顯著升高，則說(shuō)明CK2抑制劑對(duì)該腫瘤或病毒具有抑制作用。
[0058] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0059] 圖1顯示了CK2抑制Toll樣受體信號(hào)所誘導(dǎo)的I型干擾素和/或I型干擾素誘 導(dǎo)基因或其蛋白，但不影響炎癥因子TNFa的表達(dá)。
[0060] 圖2顯示了CK2抑制Toll樣受體信號(hào)所誘導(dǎo)的TBK1和IRF3活化，但不影響MAP kinases的激活。
[0061] 圖3顯示了CK2抑制胞漿內(nèi)識(shí)別RNA和DNA的模式識(shí)別受體所誘導(dǎo)的信號(hào)通路以 及I型干擾素和/或I型干擾素誘導(dǎo)基因或其蛋白的表達(dá)。
[0062] 圖4顯示了HSV感染時(shí)，CK2抑制小鼠巨噬細(xì)胞系Raw表達(dá)I型干擾素和/或I 型干擾素誘導(dǎo)基因或其蛋白，而隨著I型干擾素及其靶基因產(chǎn)物的大量表達(dá)，HSV病毒的復(fù) 制、組裝和釋放受到顯著的抑制，在CK2α敲降的Raw264. 7細(xì)胞培養(yǎng)液中檢測(cè)到的HSV病 毒滴度比對(duì)照組的要低接近10倍。
[0063] 圖5顯示了仙臺(tái)病毒感染時(shí)，CK2抑制小鼠成纖維細(xì)胞系L929表達(dá)I型干擾素和 /或I型干擾素誘導(dǎo)基因或其蛋白。
[0064] 圖6顯示了VSV病毒感染時(shí)，CK2抑制小鼠成纖維細(xì)胞系L929表達(dá)I型干擾素和 /或I型干擾素誘導(dǎo)基因或其蛋白。