6-{[4-(2-氟苯基)1-哌嗪基]甲基}-n-(萘基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺在制備血管生成抑 ...的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及抑制血管生成的應用。更具體地說，本發(fā)明設及6-{[4-(2-氣苯 基）1-贓嗦基]甲基}-N-(糞基）-1，3, 5-Ξ嗦-2, 4-二胺在制備血管生成抑制劑中的應 用。
【背景技術】
[0002] 視網(wǎng)膜病變、風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生與血管生成有密切關系。
[0003] (1)腫瘤新生血管生成是指在腫瘤組織中，血管內皮細胞在相關刺激血管生成信 號的作用下由相對靜止轉為快速生長，在已存在的血管組織中產(chǎn)生新生血管的過程，是腫 瘤生長的重要前提。腫瘤新生血管的生成滿足了腫瘤組織進一步生長代謝的需要，使腫瘤 細胞不斷分裂增殖，并成為腫瘤細胞浸潤侵襲、遠處轉移的重要路徑。
[0004]Fo化man教授于1971年首次提出了腫瘤的生長需要新生血管形成。血管生成抑制 劑是通過抑制促進血管生成的生長因子、生長因子受體及下游信號通路等，抑制新生血管 生成，從而抑制腫瘤的生長和轉移的發(fā)生。抗腫瘤新生血管生成治療已成為惡性腫瘤綜合 治療中的重要方法之一。針對腫瘤新生血管形成或血管生成的治療手段在癌癥治療中占有 重要地位，貝伐單抗等針對血管內皮生長因子（VEGF)的單克隆抗體生物制劑在臨床上已 被廣泛運用。 陽0化](2)在視網(wǎng)膜血管性疾病的病理改變過程中，血管內皮生長因子（VEG巧呈高表達 狀態(tài)；抗VEGF治療的臨床試驗證實，治療可使脈絡膜新生血管膜縮小、液體滲漏減少，在新 生血管性年齡相關性黃斑變性、各種病因的脈絡膜新生血管膜、糖尿病和靜脈阻塞導致的 黃斑水腫、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變及新生血管性青光眼的治療中，抗VEGF治療顯示出一定程度 的有效性。
[0006] 血管生成是類風濕性關節(jié)炎（RA)早期滑膜病理改變的特征之一，也是產(chǎn)生和維 持RA血管繫的主要因素，新血管生成被認為形成和維持RA血管繫的重要因素，抑制血管生 成的藥物可W有效緩解RA的病情。
[0007] (4)動脈粥樣硬化引起血管阻塞的同時也設及到動脈新血管生成。新血管從動脈 外膜的營養(yǎng)血管開始生長并延伸入粥樣斑塊下內膜層，運些新生毛細血管可W起到促進粥 樣斑塊生長的作用。因此抑制血管生成的藥物對于抗動脈粥硬化治療有著重要意義。
[000引對于本發(fā)明設及的6-{[4-(2-氣苯基）1-贓嗦基]甲基}-N-(糞基）-1, 3, 5-二 嗦-2, 4-二胺在治療糖尿病引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷、類風濕性關節(jié)炎W及抗動脈粥樣硬化 中的應用屬于首次公開，由于其對于上述疾病的治療強得意想不到，不存在由其他化合物 給出任何啟示的可能，具備突出的實質性特點，同時用于抑制血管生成顯然具有顯著的進 步。
【發(fā)明內容】
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種6-{[4-(2-氣苯基）1-贓嗦基]甲基}-N-(糞 基）-1，3, 5-Ξ嗦-2, 4-二胺在制備血管生成抑制劑中的應用，其能抑制促進血管生成的生 長因子、生長因子受體及下游信號通路，抑制新生血管生成，從而抑制腫瘤的生長和轉移的 發(fā)生。
[0010] 為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的運些目的和其它優(yōu)點，提供了 1、6-{[4-(2-氣苯基）1-贓 嗦基]甲基}-N-(糞基）-1，3, 5-Ξ嗦-2, 4-二胺在制備血管生成抑制劑中的應用，其中， 6-{[4-(2-氣苯基）1-贓嗦基]甲基} -N-(糞基）-1，3, 5-Ξ嗦-2, 4-二胺的結構式為式 (I)：
[0011]
[0012] 優(yōu)選的是，所述的6-{[4-(2-氣苯基）1-贓嗦基]甲基}-N-(糞基）-1,3,5-Ξ 嗦-2, 4-二胺的應用中，所述血管生成抑制劑在制備治療視網(wǎng)膜病變的藥物制劑中的應 用。
[0013] 優(yōu)選的是，所述的6-{[4-(2-氣苯基）1-贓嗦基]甲基}-N-(糞基）-1，3, 5-Ξ 嗦-2, 4-二胺的應用中，所述血管生成抑制劑在制備治療類風濕性關節(jié)炎的藥物制劑中的 應用。
[0014] 優(yōu)選的是，所述的6-{[4-(2-氣苯基）1-贓嗦基]甲基}-N-(糞基）-1，3,5-Ξ 嗦-2, 4-二胺的應用中，所述血管生成抑制劑在制備治療動脈粥樣硬化的藥物制劑中的應 用。
[0015] 本發(fā)明至少包括W下有益效果：
[0016] 通過實驗證明，6-{[4-(2-氣苯基）1-贓嗦基]甲基}-Ν-(糞基）-1，3,5-Ξ 嗦-2, 4-二胺可W有效地降低糖尿病人的視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷，治療類風濕性關節(jié)炎W及 動脈粥樣硬化。
[0017] 本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本 發(fā)明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，W令本領域技術人員參照說明書 文字能夠據(jù)W實施。
[0019] 需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所 述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。 陽〇2〇] 實施例1
[0021] 6-{[4-(2-氣苯基）1-贓嗦基]甲基}-Ν-(糞基）-1,3,5-Ξ嗦-2, 4-二胺在膠原 誘導小鼠關節(jié)炎動物模型體內免疫保護作用。
[0022] 構建原型小鼠關節(jié)炎動物模型，研究6- {[4- (2-氣苯基）1-贓嗦基]甲基} -N-(糞 基）-1，3, 5-Ξ嗦-2, 4-二胺，W下簡稱化合物A，對小鼠膠原誘導性關節(jié)炎（CIA)的治療作 用。采用小鼠作為受試動物，SPF級DBA/1小鼠90只（由上海西普爾-必凱實驗動物有限 公司）提供，雄性，7-8周齡，體重18-22g，隨機分成6組，分別是正常對照組、模型對照組、 化合物A低中高0). 3、0. 6、1. 2mg/kg) 3個劑量組和陽性藥物（甲氨蝶嶺2mg/kg)對照組。
[0023] 除正常對照組外，實驗第0天，6個實驗組均建立小鼠CIA模型，方法是雞軟骨II型 膠原（CII)用0.Imol/L醋酸溶液溶解成4mg/mL的溶液，于4°C冰箱中放置一夜。實驗當 天將醋酸溶解后的雞軟骨II型膠原（CII)與含4mg/血結核分枝桿菌菌株冊7Rv的完全弗 氏佐劑（CFA)等體積充分乳化，制得第一乳化液，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮內每只 注射第一乳化液50μL進行致敏，21d后將醋酸溶解后的雞軟骨II型膠原（CII)與不完全 弗氏佐劑（IFA)等體積充分乳化，制得第二乳化液，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮內每 只注射第二乳化液50μL進行再次免疫。
[0024] 造模第30d起皮下注射給藥，化合物A低中高3個劑量組（0. 3、0.6、1.2mg/kg)， 每日兩次，每次給藥30mg，連續(xù)給藥lOd;陽性藥物對照組（甲氨蝶嶺2mg/kg)，每五天一 次，每次給藥30mg，連續(xù)3次；正常對照組和模型對照組（生理鹽水），每日兩次，每次注射 30mg，連續(xù)10天。
[00巧]分別于造模后第21天至第70天每3天稱量體重、關節(jié)評分、分別檢測左右后足足 踩直徑來觀察藥物對小鼠膠原型關節(jié)炎的影響。
[0026] 實驗結果：造模后小鼠與正常小鼠相比，免疫后第27天，CIA小鼠足爪紅腫，關節(jié) 炎指數(shù)評分增高，模型組第42-55天為腫脹高峰，模型組第34天開始體重幾乎不增加，后期 略有下降。
[0027] 化合物A在膠原誘導小鼠關節(jié)炎動物模型體內免疫保護作用具體結果如下：
[0028] 化合物A對小鼠膠原型關節(jié)炎左足足爪腫脹度的影響：陽性對照組、化合物A低中 高劑量組左后足踩直徑與模型組比較，均有極顯著的差異（P<〇. 01)，實驗結果具有統(tǒng)計學 意義。化合物A對小鼠膠原型關節(jié)炎右足足爪腫脹程度的影響：陽性對照組、化合物低中高 劑量組右后足踩直徑與模型組相比，均有極顯著差異（P<〇. 01)，實驗結果具有統(tǒng)計學意義。 化合物A對膠原型關節(jié)炎小鼠臨床評分的影響：化合物低中高劑量組四肢評分明顯低于模 型對照組（P<〇. 01)，與模型對照組比較有極顯著差異，實驗結果具有統(tǒng)計學意義?；衔顰 對膠原型關節(jié)炎小鼠體重影響，化合物低中高劑量組體重顯著高于模型對照組（P<〇. 01)， 與模型組比較有極顯著性差異，實驗結果具有統(tǒng)計學意義。由此可知，化合物A對小鼠膠原 型關節(jié)炎具有治療作用。
[0029] 實施例2
[0030] 化合物A的體外藥效試驗
[0031] 精確稱取化合物A，加入二甲基亞諷完全溶解，實驗前用培養(yǎng)液梯度稀釋成所需濃 度（二甲基亞諷最終濃度<0. 1% )。
[0032] 取第Ξ代滑膜細胞W5X104個/mL細胞密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，4化后更 換培養(yǎng)基并分別加入各濃度藥物，使化合物A最終濃度為100、50、10、5、1、0. 5M，同時設空 白調零組（即只加培養(yǎng)液200μL/孔）、對照組、及甲氨蝶嶺對照組（最終濃度分別為5、1、 0. 1μΜ)每組5個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)4化后每孔加入15μL質量濃度為5mg/mL的MTT后繼 續(xù)培養(yǎng)地，吸凈培養(yǎng)液，加入150μL二甲基亞諷，振蕩lOmin，在酶標儀上于490皿測定OD 值。
[0033] 藥物對滑膜細胞生長抑制率（％ ) =(1-受試藥物組平均OD值/對照組平均OD 值）X100%
[0034] W上各組OD值均需減去空白調零組OD值。
[0035] 用SPSS軟件計算ICs。值，體外Μ?Τ法試驗結果表明，化合物A具有很強的抑制成 纖維樣滑膜細胞的增殖活性，其ICe。值為5μM。
[0036] 實施例3
[0037] 3. 1實驗動物
[003引選擇出生l-3d的標準普通級SD大鼠，由廣西中醫(yī)藥大學提供，符合國家醫(yī)用動物 使用標準，標準號為清潔級。
[0039] 3. 2SD大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的原代培養(yǎng)及高糖模型的建立
[0040] 3.2. 1配制W下主要試劑
[0041] 含10%胎牛血清培養(yǎng)液、葡萄糖、5-漠-2'脫氧尿巧、4%多聚甲醒、PBS憐酸鹽緩 沖液。
[0042] 3. 2. 2多聚賴氨酸處理細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板
[0043] 為促進所培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的貼壁，于接種前預先用多聚賴氨酸處理細胞培 養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板。方法：于實驗前一天，25mm2培養(yǎng)瓶加入100μg/mL多聚賴氨酸2.OmU均勻 覆蓋瓶底，于37°C培養(yǎng)箱內過夜，吸除培養(yǎng)瓶內多聚賴氨酸，PBS洗Ξ遍，放于37°C培養(yǎng)箱 內干燥備用。擬行免疫巧光鑒定的細胞接種于6孔板，培養(yǎng)板中預先放置27mmX29mm的蓋 玻片，并如上所述方法用多聚賴氨酸提前處理。 W44] 3. 2. 3原代視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞懸液的制備 W45] 將出生l-3d的SD大鼠浸泡至75%酒精中進行消毒5min，超凈工作臺內無菌取眼 球，于冰浴PBS(含青霉素lOOU/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素）洗3遍，顯微鏡下自角鞏 膜緣后約1mm處作環(huán)形切口，去除眼前節(jié)組織及玻璃體，純性分離出視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，冰 浴PBS漂洗2遍。顯微眼科剪將取出的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層剪成約1mm2大小的組織塊，收集 于離屯、管內。加入約10倍體積的0. 125%膜蛋白酶，37°C消化10-15min。含10%胎牛血清 的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，吸管輕輕反復吹打成單細胞懸液后400目不誘鋼濾網(wǎng)過濾， 100化/111111離屯、5111111，收集細胞沉淀，含10%胎牛血清的0161/。12培養(yǎng)液重懸細胞。細胞 計數(shù)板進行細胞計數(shù)，調整細胞密度為1X1〇6個/mL。
[0046] 3. 2. 4原代