編碼呼吸道合胞病毒的g蛋白的核酸疫苗的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：編碼呼吸道合胞病毒的g蛋白的核酸疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的領(lǐng)域，尤其涉及包括編碼RSV的吸附(G)蛋白的核酸序列的疫苗。
背景技術(shù)：
屬于病毒的副粘病毒科的呼吸道合胞病毒(RSV)是一種負(fù)鏈RNA病毒，它是決定嬰幼兒支氣管炎和肺炎的主要病毒性病原體(參考文獻(xiàn)1-在本申請(qǐng)中各個(gè)參考文獻(xiàn)在括號(hào)中標(biāo)出，這些參考文獻(xiàn)對(duì)本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)狀態(tài)做更全面的說(shuō)明。有關(guān)每一份引用文件的完整參考文獻(xiàn)信息在本說(shuō)明書(shū)的最后、緊接著權(quán)利要求書(shū)之前給出。這些參考文獻(xiàn)的內(nèi)容被作為參考文獻(xiàn)收入本說(shuō)明書(shū)中)。在美國(guó)，每年由RSV引起的急性呼吸道感染會(huì)導(dǎo)致大約90,000人住院治療，并有4,500人死亡(參考文獻(xiàn)2)。僅在美國(guó)每年用于治療RSV感染所需的費(fèi)用就超過(guò)3.4億美元(參考文獻(xiàn)3)?，F(xiàn)在還沒(méi)有得到許可的、針對(duì)RSV的疫苗。開(kāi)發(fā)RSV疫苗的主要途徑包括滅活的病毒、減毒活病毒和亞單位疫苗。
針對(duì)RSV的保護(hù)性免疫應(yīng)答被認(rèn)為需要誘導(dǎo)針對(duì)表面融合(F)和吸附(G)糖蛋白的中和抗體(參考文獻(xiàn)4)。另外，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答參與了病毒清除。F蛋白在RSV A和B亞型之間是保守的。
RSV的G蛋白(33kDa)是高度O-糖基化的，產(chǎn)生表觀分子量為90kDa的糖蛋白(參考文獻(xiàn)5)。業(yè)已確定了RSV病毒的兩大亞型A和B(參考文獻(xiàn)6)。這兩種亞型之間的主要抗原性差別存在于G糖蛋白上(參考文獻(xiàn)3、7)。
將RSV蛋白用作疫苗可能會(huì)有困難。迄今為止，腸胃外服用的疫苗候選物被證實(shí)在血清陰性黑猩猩中誘導(dǎo)中和抗體的免疫原性很弱。在存在被動(dòng)獲得性抗體的條件下，由所述抗原誘導(dǎo)的血清抗體應(yīng)答會(huì)進(jìn)一步減弱，所述被動(dòng)獲得性抗體如大部分嬰幼兒所具有的通過(guò)胎盤(pán)獲得的母體抗體。RSV的亞單位疫苗候選物包括源于RSV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的純化的融合(F)糖蛋白，所述糖蛋白是通過(guò)免疫親和或離子交換層析純化的(參考文獻(xiàn)8)。用該制劑對(duì)血清陰性或血清陽(yáng)性黑猩猩進(jìn)行腸胃外免疫，在血清陰性動(dòng)物中，為了誘導(dǎo)大約1∶50 RSV血清中和效價(jià)，需要3個(gè)50μg的劑量。隨后在用野生型RSV接種所述動(dòng)物時(shí)，在上呼吸道沒(méi)有檢測(cè)到免疫對(duì)病毒排除的作用或臨床疾病。沒(méi)有研究在下呼吸道中該疫苗免疫對(duì)病毒排除的作用，盡管該部位是通過(guò)胃腸外免疫誘導(dǎo)的血清抗體可能具有其最大效果的部位。業(yè)已在少數(shù)血清陽(yáng)性個(gè)體中進(jìn)行了安全性和免疫原性研究。所述疫苗在血清陽(yáng)性兒童和3個(gè)血清陰性兒童(所有兒童的年齡都超過(guò)2.4歲)中證實(shí)了其安全性。由于接受免疫的兒童的數(shù)量較少，尚不能確定免疫對(duì)下呼吸道疾病的影響。一個(gè)免疫劑量在血清陽(yáng)性兒童體內(nèi)可誘導(dǎo)40％-60％的接種疫苗者體內(nèi)的病毒中和抗體效價(jià)增加4倍。因此，以上小規(guī)模研究不能提供足夠的資料對(duì)所述疫苗抗RSV-誘導(dǎo)的疾病的效力進(jìn)行評(píng)價(jià)。亞單位RSV疫苗所遇到的另一個(gè)問(wèn)題是，用免疫原制劑接種血清陰性受體有可能導(dǎo)致疾病的加重。在20世紀(jì)60年代，用福爾馬林滅活的RSV制劑(FI-RSV)免疫嬰兒，會(huì)導(dǎo)致隨后再次接觸活的病毒時(shí)肺部疾病的增強(qiáng)，也被稱(chēng)作免疫增強(qiáng)(參考文獻(xiàn)9、10)。所述疫苗接種者會(huì)形成強(qiáng)的血清應(yīng)答，但不能預(yù)防感染，并且，某些接種者在天然感染時(shí)會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重甚至有時(shí)致命的呼吸道疾病。盡管精確的機(jī)制尚不清楚，但業(yè)已表明這種形式的免疫強(qiáng)化有可能反映了RSV抗原的結(jié)構(gòu)變化(參考文獻(xiàn)11)、殘余的血清和/或細(xì)胞污染物(參考文獻(xiàn)12)、病毒吸附(G)蛋白的特異特性(參考文獻(xiàn)13、14)或不平衡的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(參考文獻(xiàn)13、15)。業(yè)已證實(shí)，F(xiàn)I-RSV疫苗可以在小鼠中誘導(dǎo)TH2-型免疫應(yīng)答，而用活的RSV免疫不能導(dǎo)致免疫增強(qiáng)，但誘發(fā)一種TH1應(yīng)答(參考文獻(xiàn)15)。
在某些研究中，用合成的RSV G融合蛋白進(jìn)行免疫的免疫應(yīng)答會(huì)導(dǎo)致嚙齒類(lèi)動(dòng)物的疾病的增強(qiáng)，類(lèi)似于由福爾馬林滅活的RSV疫苗誘導(dǎo)的結(jié)果。用能表達(dá)RSV G蛋白的重組疫苗病毒免疫小鼠，可導(dǎo)致在肺中出現(xiàn)G-特異性T細(xì)胞應(yīng)答，所述細(xì)胞只能從CD4+T細(xì)胞亞譜系中征集，并且明顯偏向Th2。G-特異性T細(xì)胞可誘導(dǎo)肺出血，肺嗜中性白細(xì)胞征集(休克肺)，大量的肺嗜伊紅性粒細(xì)胞，并且有時(shí)會(huì)在繼代的轉(zhuǎn)移的小鼠受體中導(dǎo)致死亡(參考文獻(xiàn)14)。用包括非復(fù)制抗原的某些疫苗制劑進(jìn)行免疫與疾病加重的相關(guān)性，表明將其在血清陰性人體中用作疫苗應(yīng)慎重從事。
針對(duì)由RSV引起的疾病的活的減毒疫苗因?yàn)閮煞N主要原因而有希望。首先，被活的疫苗病毒感染會(huì)誘導(dǎo)平衡的免疫應(yīng)答，包括粘膜和血清抗體和細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞。其次，用活的減毒疫苗候選物或天然獲得的野生型病毒感染嬰兒，在隨后再次天然感染時(shí)不會(huì)導(dǎo)致增強(qiáng)的疾病。生產(chǎn)以下的活減毒疫苗是一種挑戰(zhàn)，這種疫苗對(duì)具有母體病毒中和抗體的嬰幼兒具有免疫原性，并且已被減毒可用于大于或等于六月齡血清陰性嬰兒。減毒的活病毒疫苗還具有殘留毒力和遺傳學(xué)不穩(wěn)定性的危險(xiǎn)。
在若干研究中，業(yè)已證實(shí)注射包括編碼一種外源蛋白的序列的質(zhì)粒DNA，可導(dǎo)致所述外源蛋白的表達(dá)，并誘導(dǎo)針對(duì)所述抗原的抗體和細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答(例如，參考文獻(xiàn)16、17、18)。將質(zhì)粒DNA接種用于表達(dá)病毒蛋白較上面歸納的方法具有若干優(yōu)點(diǎn)。首先，可以在有抗體的條件下將編碼病毒抗原的DNA導(dǎo)入病毒本身內(nèi)部，并不會(huì)由于所述抗體綜合病毒而使其喪失效力。其次，在體內(nèi)表達(dá)的抗原應(yīng)當(dāng)具有天然的構(gòu)象和合適的糖基化。因此，所述抗原應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)類(lèi)似于由存在于野生型病毒感染的抗原誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答的抗體應(yīng)答。相反，用于純化蛋白的某些方法可以誘導(dǎo)構(gòu)象的改變，因此導(dǎo)致保護(hù)性表位的免疫原性的喪失，并有可能導(dǎo)致免疫增強(qiáng)。第三，在活體中可以檢測(cè)到由注射的質(zhì)粒DNA進(jìn)行的蛋白表達(dá)的時(shí)間明顯長(zhǎng)于病毒感染的細(xì)胞中的時(shí)間，而它所具有的理論上的優(yōu)點(diǎn)是，延長(zhǎng)了細(xì)胞毒性T-細(xì)胞誘導(dǎo)和增強(qiáng)的抗體應(yīng)答。第四，抗原的體內(nèi)表達(dá)有可能提供保護(hù)作用，而不需要外來(lái)的佐劑。
在本發(fā)明之前，尚不了解通過(guò)服用編碼RSV G蛋白的DNA分子對(duì)由RSV引起的疾病進(jìn)行免疫的能力。具體地講，尚不了解用編碼分泌形式的RSV G蛋白的基因?qū)SV誘導(dǎo)的疾病進(jìn)行免疫的效力。RSV的感染可導(dǎo)致嚴(yán)重疾病。提供編碼RSV G蛋白的分離的基因和非復(fù)制型載體是有用的和有利的，所述載體包括質(zhì)粒載體，將其用于體內(nèi)服用，并用于包括疫苗在內(nèi)的免疫制劑，以便預(yù)防由RSV導(dǎo)致的疾病，并用于制備診斷制劑和試劑盒。具體地講，需要提供可以作為人類(lèi)(包括血清陰性嬰兒)的免疫原和保護(hù)劑的疫苗，這種疫苗不會(huì)導(dǎo)致疾病的增強(qiáng)(免疫增強(qiáng))。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及免疫宿主使其抵抗由呼吸道合胞病毒引起的疾病的方法，涉及含有用于所述目的的免疫組合物中的核酸分子的非復(fù)制型載體，并涉及使用所述載體和核酸分子的診斷方法。具體地講，本發(fā)明涉及提供編碼呼吸道合胞病毒的G蛋白的核酸疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于給宿主體內(nèi)服用的免疫組合物，以便在所述宿主體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白的保護(hù)性抗體，包括一種非復(fù)制型載體和可藥用的載劑，該載體包括一個(gè)編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，一個(gè)可操作地連接于所述第一核苷酸序列上的啟動(dòng)子序列，用于在所述宿主中表達(dá)RSV G蛋白，和一個(gè)位于所述第一核苷酸序列和所述啟動(dòng)子序列之間的第二核苷酸序列，用于增強(qiáng)所述載體在所述宿主中進(jìn)行RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)。
所述第一核苷酸序列可以是編碼完整長(zhǎng)度RSV G蛋白的核苷酸序列。該第一核苷酸序列可以包括圖2所示的核苷酸序列(序列1)或編碼具有序列2所示氨基酸序列的完整長(zhǎng)度的RSV G蛋白(序列2)。
另外，所述第一核苷酸序列可以是編碼缺少了跨膜編碼序列和其上游序列的RSV G蛋白的序列。編碼所述截短的RSV G蛋白的第一核苷酸序列可以包括圖3所示的核苷酸序列(序列3)或者可以包括編碼具有圖3所示氨基酸序列(序列4)的截短的RSV G蛋白的核苷酸序列。跨膜區(qū)表達(dá)的缺乏會(huì)導(dǎo)致分泌形式的RSV G蛋白的產(chǎn)生。
所述非復(fù)制型載體還可以包括位于所述第一核苷酸序列的5’末端上游的異源信號(hào)肽編碼核苷酸序列。所述信號(hào)肽編碼序列可以編碼人組織纖溶酶原激活物的信號(hào)肽。
所述啟動(dòng)子序列可以是立即早期巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。所述第二核苷酸序列可以包括人巨細(xì)胞病毒內(nèi)含子A。
所述非復(fù)制型載體通常是質(zhì)粒載體。由本發(fā)明的該方面所提供的免疫組合物所包含的編碼G蛋白的質(zhì)粒載體具體為pXL5或pXL6，其構(gòu)建和所具有的特有元件如圖4或5所示。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種免疫宿主使其抵抗由呼吸道合胞病毒(RSV)感染引起的疾病的方法，該方法包括給所述宿主服用有效量的非復(fù)制型載體，該載體包括一個(gè)編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，一個(gè)可操作地連接于所述第一核苷酸序列上的啟動(dòng)子序列，以便在所述宿主中表達(dá)RSV G蛋白，和一個(gè)位于所述第一核苷酸序列和所述啟動(dòng)子序列之間的第二核苷酸序列，用于增強(qiáng)所述載體在所述宿主中進(jìn)行所述RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)。
可以實(shí)施所述免疫方法，以便誘導(dǎo)平衡的Th1/Th2免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還包括使用編碼呼吸道合胞病毒(RSV) G蛋白或RSV G蛋白片段的基因預(yù)防宿主發(fā)生由呼吸道合胞病毒感染引起的疾病的新型方法，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，該方法包括分離所述基因；將所述基因可操作地連接在至少一個(gè)控制序列上，以便產(chǎn)生一種非復(fù)制型載體，所述控制序列在所述載體被導(dǎo)入宿主之后可指導(dǎo)RSVG蛋白的表達(dá)，以便產(chǎn)生針對(duì)RSV G蛋白的免疫應(yīng)答，和將所述載體導(dǎo)入所述宿主。
由本發(fā)明的該方面所提供的方法還可以包括以下步驟將所述基因可操作地連接于免疫保護(hù)增強(qiáng)序列上，以便由RSV G蛋白在所述宿主中產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，優(yōu)選通過(guò)將免疫保護(hù)增強(qiáng)序列導(dǎo)入所述控制序列和所述基因之間，包括在所述載體中導(dǎo)入免疫刺激CpG序列。
另外，本發(fā)明包括一種生產(chǎn)用于預(yù)防宿主發(fā)生由呼吸道合胞病毒(RSV)感染引起的疾病的疫苗的方法，該方法包括分離編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，該核苷酸序列能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，將所述第一核苷酸序列可操作地連接于至少一個(gè)控制序列上，以便產(chǎn)生一種非復(fù)制型載體，所述控制序列在導(dǎo)入宿主之后可指導(dǎo)所述RSV G蛋白的表達(dá)，當(dāng)由所述載體在所述宿主中進(jìn)行體內(nèi)表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生針對(duì)RSV G蛋白的免疫應(yīng)答，將所述第一核苷酸序列可操作地連接于第二核苷酸序列上，以便增強(qiáng)所述載體在所述宿主中進(jìn)行所述RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)，和將所述載體制備成用于體內(nèi)服用的疫苗。
所述載體可以是選自pXL5和pXL6的質(zhì)粒載體。本發(fā)明還包括由該方法生產(chǎn)的用于給包括人類(lèi)宿主在內(nèi)的宿主服用的疫苗。
如上文所述，本發(fā)明所提供的載體可用于診斷目的。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了一種測(cè)定呼吸道合胞病毒(RSV) G蛋白在樣品中存在的方法，包括以下步驟a)用一種非復(fù)制型載體免疫宿主，以便產(chǎn)生對(duì)所述RSV G蛋白特異的抗體，所述非復(fù)制型載體包括一個(gè)編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，一個(gè)可操作地連接于所述第一核苷酸序列上的啟動(dòng)子序列，以便在所述宿主中表達(dá)所述RSV G蛋白，以及位于所述第一核苷酸序列和所述啟動(dòng)子序列之間的第二核苷酸序列，以便在所述宿主中增強(qiáng)由所述載體進(jìn)行的RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)；b)分離所述RSV G蛋白特異性抗體；c)讓所述樣品與分離的抗體接觸，以便產(chǎn)生包括存在于所述樣品中的任何RSV G蛋白和RSV G蛋白特異性抗體的復(fù)合體；和d)測(cè)定所述復(fù)合體的產(chǎn)生。
用于誘導(dǎo)所述抗體的非復(fù)制型載體可以是質(zhì)粒載體pXL5和pXL6。
本發(fā)明還包括一種用于檢測(cè)呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白在樣品中存在的診斷試劑盒，該試劑盒包括a)一種非復(fù)制型載體，該載體在給宿主服用之后能產(chǎn)生對(duì)所述RSV G蛋白特異的抗體，所述非復(fù)制型載體包括一個(gè)編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，一個(gè)可操作地連接于所述第一核苷酸序列上的啟動(dòng)子序列，以便在宿主中表達(dá)所述RSV G蛋白，以及位于所述第一核苷酸序列和所述啟動(dòng)子序列之間的第二核苷酸序列，以便在所述宿主中增強(qiáng)由所述載體進(jìn)行的RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)；b)分離所述RSV G蛋白特異性抗體的分離裝置；c)讓所述分離的RSV G蛋白特異抗體與所述樣品接觸的裝置，以便產(chǎn)生包括存在于所述樣品中的任何RSV G蛋白和RSV G蛋白特異性抗體的復(fù)合體；和d)測(cè)定所述復(fù)合體產(chǎn)生的鑒定裝置。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白特異的抗體的方法，包括a)用有效量的非復(fù)制型載體對(duì)宿主進(jìn)行免疫，以便產(chǎn)生RSV G蛋白特異性抗體，所述非復(fù)制型載體包括一個(gè)編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，一個(gè)可操作地連接于所述第一核苷酸序列上的啟動(dòng)子，用于在宿主中表達(dá)所述RSV G蛋白，和一個(gè)位于所述第一核苷酸序列和所述啟動(dòng)子序列之間的第二核苷酸序列，以便在所述宿主中增強(qiáng)由所述載體進(jìn)行的所述RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)；b)從所述宿主中分離RSV G蛋白特異性抗體；本發(fā)明還涉及一種用于生產(chǎn)對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白特異的單克隆抗體的方法，包括以下步驟a)構(gòu)建一種載體，該載體包括一個(gè)編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，一個(gè)可操作地連接于所述第一核苷酸序列上的啟動(dòng)子序列，以便在所述宿主中表達(dá)所述RSV G蛋白，以及位于所述第一核苷酸序列和所述啟動(dòng)子序列之間的第二核苷酸序列，以便在宿主中增強(qiáng)由所述載體進(jìn)行的RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)；b)給至少一只小鼠服用所述載體，以便產(chǎn)生至少一只免疫的小鼠；c)從所述至少一只免疫小鼠體內(nèi)取出B-淋巴細(xì)胞；d)將來(lái)自所述至少一只免疫小鼠的B-淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以便產(chǎn)生雜交瘤；e)克隆所述雜交瘤；
f)篩選能產(chǎn)生抗-RSV G蛋白抗體的克隆；g)培養(yǎng)所述產(chǎn)生抗-RSV G蛋白抗體的克隆；h)分離抗-RSV G蛋白單克隆抗體。
可將所述單克隆抗體用于從病毒中純化RSV G蛋白。
在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“RSV G蛋白”被用于限定完整長(zhǎng)度的RSV G蛋白，所述蛋白在其氨基酸序列中具有變化，包括天然存在于各種RSV株的G蛋白，缺少跨膜區(qū)的分泌形式的RSV G蛋白，以及RSV G蛋白的功能類(lèi)似物。在本申請(qǐng)中，如果第一種蛋白在免疫學(xué)上與第二種蛋白相關(guān)和/或具有與第二種蛋白相同功能的話，所述第一種蛋白是第二種蛋白的“功能類(lèi)似物”。例如，所述功能類(lèi)似物可以是所述蛋白的免疫學(xué)活性片段或其免疫學(xué)活性取代、添加或缺失突變型。
附圖簡(jiǎn)述通過(guò)以下一般性說(shuō)明和實(shí)施例，并參考附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中

圖1表示編碼呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白的基因的限制圖。
圖2表示編碼膜結(jié)合形式的呼吸道合胞病毒G蛋白的基因的核苷酸序列(序列1)，以及由它所編碼的RSV G蛋白的氨基酸序列(序列2)；圖3表示編碼缺少所述跨膜域的分泌形式RSV G蛋白的基因的核苷酸序列(序列3)，以及由它所編碼的缺少所述跨膜域的截短的RSVG蛋白的氨基酸序列(序列4)。
圖4表示質(zhì)粒pXL5的構(gòu)建，該質(zhì)粒包括編碼完整長(zhǎng)度的膜結(jié)合形式的RSV G蛋白的基因，并包括CMV內(nèi)含子A序列；圖5表示質(zhì)粒pXL6的構(gòu)建，該質(zhì)粒含有編碼缺少所述跨膜域的分泌形式的RSV G蛋白的基因，并包括CMV內(nèi)含子A序列，以及編碼人組織纖溶酶原激活物(TPA)的信號(hào)肽的核苷酸序列。
圖6表示質(zhì)粒VR-1012的核苷酸序列(序列5)；圖7表示5’非翻譯區(qū)和人組織纖溶酶原激活物(TPA)的信號(hào)肽的核苷酸序列(序列6)和圖8表示在用RSV刺激之后DNA免疫小鼠體內(nèi)的肺細(xì)胞因子表達(dá)特征。
發(fā)明的一般說(shuō)明如上文所述，本發(fā)明總體上涉及多核苷酸，包括DNA，進(jìn)行免疫，以便獲得對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)感染以便獲得保護(hù)，并涉及使用特殊非復(fù)制型載體的診斷方法。在本發(fā)明中，構(gòu)建了若干重組質(zhì)粒載體，以便包括編碼RSV G蛋白的核苷酸序列。
完整長(zhǎng)度RSV G基因的核苷酸如圖2所示(序列1)，本發(fā)明所提供的某些結(jié)構(gòu)包括編碼完整長(zhǎng)度RSV G(序列2)蛋白的核苷酸序列，而另一些包括通過(guò)缺失跨膜編碼序列和其上游的核苷酸進(jìn)行修飾的RSV G基因(參見(jiàn)圖3，序列3)，以便產(chǎn)生缺少所述跨膜域的分泌的或截短的RSV G蛋白(序列4)。
編碼RSV G蛋白的核苷酸序列可操作地連接于一個(gè)啟動(dòng)子序列上，以便體內(nèi)表達(dá)所編碼的RSV G蛋白。所述啟動(dòng)子序列可以是人類(lèi)立即早期巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子披露于參考文獻(xiàn)19中?？梢允褂萌魏纹渌Ｒ?jiàn)啟動(dòng)子，包括組成型啟動(dòng)子，如肉瘤病毒LTRs，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如金屬硫蛋白啟動(dòng)子，和組織特異性啟動(dòng)子。
本發(fā)明所提供的非復(fù)制型載體，在以與可藥用的載劑組配的免疫組合物形式給動(dòng)物服用時(shí)，可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)RSV G蛋白表達(dá)，這一點(diǎn)由服用了所述組合物的動(dòng)物體內(nèi)的抗體應(yīng)答所證實(shí)。所述抗體在本發(fā)明中可用于檢測(cè)樣品中的RSV蛋白，如下文中更進(jìn)一步披露的。服用所述非復(fù)制型載體，特別是質(zhì)粒pXL5和pXL6能產(chǎn)生抗-G抗體，病毒中和抗體，在病毒刺激之后，在肺中產(chǎn)生平衡的Th1/Th2應(yīng)答，并在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)活的RSV感染的預(yù)防作用，通過(guò)以下實(shí)施例可以說(shuō)明這一點(diǎn)。
所述重組載體還可以包括一個(gè)位于靠近RSV G蛋白編碼核苷酸序列的第二核苷酸序列，以便在宿主內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)表達(dá)時(shí)增強(qiáng)RSV G蛋白的免疫保護(hù)能力。所述增強(qiáng)作用可以通過(guò)加強(qiáng)體內(nèi)表達(dá)提供，例如，通過(guò)提高mRNA穩(wěn)定性，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。該額外序列通常位于所述啟動(dòng)子序列和RSV G蛋白編碼序列之間。該增強(qiáng)序列可以包括立即早期巨細(xì)胞病毒內(nèi)含子A序列。
本發(fā)明所提供的非復(fù)制型載體還可以包括一個(gè)額外的核苷酸序列，該序列編碼源于RSV的另一種抗原，源于至少一種其它病原體的抗原或至少一種免疫調(diào)節(jié)劑，如細(xì)胞因子。所述載體還可以包括為嵌合或雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)的額外核苷酸序列。另外，可以分別構(gòu)建含有所述額外核苷酸序列的載體，并與本發(fā)明所提供的非復(fù)制型載體同時(shí)給宿主服用。
所述非復(fù)制型載體還可以包括一個(gè)編碼異源病毒或真核信號(hào)肽的核苷酸序列，如人組織纖溶酶原激活物(TPA)信號(hào)肽，以便取代截短的RSV G蛋白上的內(nèi)源信號(hào)肽。所述核苷酸序列可以位于所述載體中緊挨著RSV G編碼序列的上游。
通過(guò)在所述載體中插入免疫刺激CpG序列可以增強(qiáng)所述非復(fù)制型DNA載體的免疫原性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，本發(fā)明的各種實(shí)施方案在RSV感染免疫、診斷和治療領(lǐng)域具有很多用途。下面將提供對(duì)所述用途的進(jìn)一步非限定性說(shuō)明。1.疫苗制備和用途。
可以由本發(fā)明所披露的RSV G基因和載體制備適于用作疫苗的免疫組合物。所述疫苗可以在動(dòng)物體內(nèi)引起免疫應(yīng)答，該應(yīng)答包括抗-RSV G抗體的產(chǎn)生。含有所述核酸的包括疫苗在內(nèi)的免疫組合物可以用生理學(xué)上可以接受的液體溶液或乳液制備成注射劑，用于服用多核苷酸。所述核酸可以與脂質(zhì)體結(jié)合，如與卵磷脂脂質(zhì)體或本領(lǐng)域公知的其它脂質(zhì)體結(jié)合成核酸脂質(zhì)體(例如，在WO93/24640中所披露的，參考文獻(xiàn)20)或所述核酸可以與一種佐劑結(jié)合，如下面所要進(jìn)一步披露的。包括陽(yáng)離子型脂類(lèi)的脂質(zhì)體能自主地并迅速地與諸如DNA和RNA的聚陰離子相互作用，產(chǎn)生脂質(zhì)體/核酸組合物，該組合物能捕獲100％的多核苷酸。另外，所述聚陽(yáng)離子型復(fù)合體與細(xì)胞膜融合，導(dǎo)致多核苷酸的細(xì)胞內(nèi)輸送，由此避開(kāi)所述脂質(zhì)體區(qū)室的消化酶。公開(kāi)的PCT申請(qǐng)WO94/27435披露了包括陽(yáng)離子型脂類(lèi)和多核苷酸的遺傳學(xué)免疫組合物。使用能幫助細(xì)胞攝取核酸的制劑是有利的，如鈣離子、病毒蛋白和其它轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。
多核苷酸免疫制劑還可以制備成微膠囊，包括可生物降解的長(zhǎng)效顆粒。因此，US5,151,264披露了一種磷脂/糖脂/多糖性質(zhì)的顆粒狀載體，該載體被命名為Bio Vecteurs Supra Moleculaires(BVSM)。所述顆?；d體可用于在其若干層中的一層中輸送各種具有生物學(xué)活性的分子。
US5,075,109披露了在50∶50聚(DL-丙交酯共乙交酯)中的抗原三硝基苯基化匙孔嘁血藍(lán)蛋白和葡萄球菌腸毒素B的膠囊化。還提出了其它用于膠囊化的聚合物，如聚(乙交酯)，聚(DL-丙交酯共乙交酯)，共聚草酸酯、聚己酸內(nèi)酯、聚(丙交酯共己酸內(nèi)酯)、聚(酰胺酯)、聚原酸酯和聚(8-羥基丁酸)、和聚酐。
公開(kāi)的PCT申請(qǐng)WO91/06282披露了一種含有若干生物附著微球體和抗原的輸送載體。所述微球體是淀粉、凝膠、葡聚糖、膠原或白蛋白。這種輸送載體特別適用于通過(guò)鼻粘膜吸收疫苗。所述輸送載體可以額外含有吸收增強(qiáng)劑。
含有非復(fù)制型載體的RSV G基因可以與相容的可以藥用的賦形劑混合。所述賦形劑可以包括水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及其組合。所述免疫組合物和疫苗還可以含有輔助物質(zhì)，如增濕或乳化劑，pH緩沖劑，或增強(qiáng)其效果的佐劑。免疫組合物和疫苗可以通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)或肌內(nèi)注射通過(guò)腸胃外途徑服用，并可以在注射之前對(duì)注射部位進(jìn)行局部麻醉預(yù)處理。另外，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的免疫組合物可以在粘膜表面引起免疫應(yīng)答的方式制備和輸送。因此，可以通過(guò)諸如鼻腔或口腔(胃腸內(nèi))途徑將所述免疫組合物用于粘膜表面。另外，其它服用模式包括栓劑和口服制劑可能是理想的。對(duì)于栓劑來(lái)說(shuō)，粘結(jié)劑和載體可以包括，例如聚亞烷基二醇或甘油三酯。口服制劑可以包括通常使用的物質(zhì)，如藥用級(jí)糖精、纖維素和碳酸鎂。
所述免疫制劑和疫苗以與劑型吻合的方式服用，其用量能起到治療、預(yù)防和免疫作用。服用量取決于接受治療的對(duì)象，例如，包括個(gè)體的免疫系統(tǒng)合成RSV G蛋白及其抗體的能力，如果必需，還取決于產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。需要服用的活性成分的精確用量取決于醫(yī)師的判斷。不過(guò)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地確定合適劑量范圍，該范圍為大約1μg至大約2mg含有RSV G基因的載體。最初服用和加強(qiáng)劑量的合適方案也是可變的，但可以包括在初次服用之后緊接著后續(xù)服用。所述劑量還可以取決于服用途徑，并根據(jù)宿主的大小而變化。只能預(yù)防一種病原體的疫苗是單價(jià)疫苗。含有若干病原體的抗原材料的疫苗是組合疫苗，而且也屬于本發(fā)明。例如，所述組合疫苗含有源于各種病原體或同一種病原體的各種株或源于各種病原體的組合的材料。
如果與佐劑一起同時(shí)服用所述載體，可以明顯提高其免疫原性，通常以溶解在磷酸緩沖的鹽溶液中的0.05-0.1％的溶液形式使用。佐劑能提高抗原的免疫原性，但它本身不一定是免疫原。佐劑還可以通過(guò)將所述抗原保持在靠近使用部位的地方而起作用，以便產(chǎn)生儲(chǔ)存效應(yīng)，促進(jìn)抗原向所述免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中緩慢持久地釋放。佐劑還可以將所述免疫系統(tǒng)的細(xì)胞吸引到抗原儲(chǔ)存部位，并刺激所述細(xì)胞誘發(fā)免疫應(yīng)答。
多年以來(lái)免疫刺激劑或佐劑業(yè)已被用于增強(qiáng)宿主對(duì)諸如疫苗的免疫應(yīng)答。因此，業(yè)已鑒定了能增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的佐劑。不過(guò)，所述佐劑中的某一些是有毒的，而且會(huì)導(dǎo)致不希望的副作用，使其不適用于人類(lèi)和很多動(dòng)物。事實(shí)上，僅有氫氧化鋁和磷酸鋁(通常通稱(chēng)為礬)通常被用作人類(lèi)和獸用疫苗的佐劑。
多種外源性佐劑和其它免疫調(diào)節(jié)材料可以引起針對(duì)抗原的有效的免疫應(yīng)答。其中包括將皂苷與膜蛋白抗原組合生成免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)，與礦物油組合的pluronic聚合物，存在于礦物油中的滅活分支桿菌，弗氏完全佐劑，細(xì)菌制品，如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)，以及單磷酰脂A，QS21和polyphosphazene。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，所述包括編碼RSV的G蛋白的第一核苷酸序列的非復(fù)制型載體可以與定向分子一起使用，以便使所述載體定向于特定的細(xì)胞，包括所述免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。
所述非復(fù)制型載體的免疫原性可以通過(guò)與表達(dá)細(xì)胞因子或趨化因子的質(zhì)粒DNA載體同時(shí)服用或通過(guò)以雙順?lè)醋踊蛉诤辖Y(jié)構(gòu)形式共表達(dá)所述分子而得到加強(qiáng)。
可以通過(guò)多種方法將所述非復(fù)制型載體輸送給宿主，例如，Tang等(參考文獻(xiàn)21)披露了將涂有編碼牛生長(zhǎng)激素(BGH)的DNA金微粒導(dǎo)入小鼠皮膚，導(dǎo)致在該小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗BGH抗體，而Feurth等(參考文獻(xiàn)22)證實(shí)，可將一種噴射注射器用于轉(zhuǎn)染活的動(dòng)物的皮膚、肌肉、脂肪和乳腺組織。2.免疫測(cè)定本發(fā)明的RSV G基因和載體可用作免疫原，以便制備用于免疫測(cè)定的抗-G抗體，包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，RIAs和其它非酶聯(lián)抗體結(jié)合測(cè)定或本領(lǐng)域已知方法。在ELISA測(cè)定中，首先給宿主服用所述非復(fù)制型載體，以便產(chǎn)生對(duì)RSV G蛋白特異的抗體。將所述RSVG-特異抗體固定在選擇的表面上，例如，能夠結(jié)合所述抗體的表面，如聚苯乙烯微量滴定板的孔。在通過(guò)洗滌除去未吸附的抗體之后，可以將諸如牛血清白蛋白(BSA)溶液的非特異性蛋白結(jié)合到所述選擇的表面上，已知所述非特異蛋白能對(duì)所述測(cè)試樣品起到抗原中和作用。這樣可以封閉所述固定表面上的非特異吸附位點(diǎn)，并因此降低由于抗血清非特異結(jié)合到所述表面上所引起的背景。
然后將所述固定表面與諸如臨床或生物學(xué)材料的樣品接觸，以能誘導(dǎo)免疫復(fù)合體(抗原/抗體)形成的方式進(jìn)行測(cè)定。該方法可以包括用諸如BSA溶液、牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)/Tween的稀釋劑稀釋所述樣品。然后將所述樣品溫育大約2-4小時(shí)，溫育溫度大約為20-37℃。在溫育之后，洗滌樣品接觸過(guò)的表面，以便除去未免疫復(fù)合的材料。所述洗滌方法可以包括用諸如PBS/Tween或硼酸緩沖液的溶液洗滌。在形成測(cè)試樣品和結(jié)合的RSV G特異抗體之間的特異免疫復(fù)合體，并經(jīng)過(guò)洗滌之后，可以測(cè)定免疫復(fù)合體的形成甚至是數(shù)量。
生物學(xué)材料本文所涉及的含有編碼RSV G蛋白的基因的某些質(zhì)粒業(yè)已按照布達(dá)佩斯條約在本申請(qǐng)的申請(qǐng)日之前交由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏，保藏中心的地址是12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，20852，USA。
在以該美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)為基礎(chǔ)獲得專(zhuān)利之后，公眾可以獲得保藏質(zhì)粒的樣品，到那時(shí)對(duì)獲取保藏物的所有限制都將解除。如果所述保藏機(jī)構(gòu)不能提供有活性的樣品，可以更換所述保藏質(zhì)粒的樣品。本文所披露的、并要求保護(hù)的發(fā)明并不局限于由所保藏的質(zhì)粒所限定的范圍，因?yàn)楸２氐膶?shí)施方案僅被用作本發(fā)明的說(shuō)明。編碼與本申請(qǐng)所披露的抗原相似或相同的抗原的任何相同或相似質(zhì)粒都屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例以上說(shuō)明從整體上披露了本發(fā)明。通過(guò)以下具體實(shí)施例可以更全面地理解本發(fā)明。披露這些實(shí)施例僅僅是出于說(shuō)明目的，而不是要限定本發(fā)明的范圍。形式的改變和等同物的取代被視為本發(fā)明所暗示的或顯而易見(jiàn)的方案。盡管本文中使用了具體的術(shù)語(yǔ)，這些術(shù)語(yǔ)是用于說(shuō)明目的的，而不是用于限定目的。
所使用的分子遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)、和免疫學(xué)方法在本說(shuō)明書(shū)中沒(méi)有明確披露，這類(lèi)例子大量報(bào)導(dǎo)于科學(xué)文獻(xiàn)中，并且屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般技能。
例1本實(shí)施例披露了含有RSV G基因的載體的構(gòu)建。
圖1表示編碼呼吸道合胞病毒的G蛋白的基因的限制圖，而圖2表示編碼完整長(zhǎng)度RSV G蛋白的基因的核苷酸序列(序列1)和推測(cè)的氨基酸序列(序列2)。圖3表示編碼分泌的RSV G蛋白的基因(序列3)和推測(cè)的氨基酸序列(序列4)。
為了表達(dá)完整長(zhǎng)度的RSV G蛋白，以如下方式制備質(zhì)粒pXL5(圖4)將含有編碼完整長(zhǎng)度臨床RSV分離物(A亞群)的G蛋白的cDNA的重組Bluescript質(zhì)粒(RSV G12)用于構(gòu)建RSV DNA-G免疫載體。用AflIII和EcoRI消化RSV G12，并用DNA聚合酶的Klenow片段補(bǔ)平。對(duì)所得到的含有所述完整長(zhǎng)度G蛋白的編碼序列的1.23kb片段進(jìn)行凝膠純化，并連接于預(yù)先用EcoRV線性化的VR-1012(Vical)(圖6)上。該過(guò)程將RSV G cDNA置于立即早期巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和人巨細(xì)胞病毒(CMV)的內(nèi)含子A序列的下游，并位于牛生長(zhǎng)激素(BGH)poly-A位點(diǎn)上游。通過(guò)測(cè)序分析證實(shí)所述cDNA片段接合在所述質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中。所得到的質(zhì)粒被命名為pXL5。
為了表達(dá)分泌RSV G蛋白，按如下方法制備質(zhì)粒pXL6(圖5)
用EcoRI消化RSV G12，用Klenow補(bǔ)平，并用BamHI再次消化。所述BamHI裂解會(huì)導(dǎo)致N-末端截短的編碼RSV G蛋白的cDNA片段的產(chǎn)生。對(duì)該DNA片段進(jìn)行凝膠純化，并在存在一對(duì)十一聚體寡聚脫氧核苷酸(5’GATCCAATCAG3’)(序列7)(3’GTGAGTCCTAG5’)(序列8)的條件下連接到預(yù)先用BglII消化過(guò)的VR-1020(Vical)上，用Klenow補(bǔ)平，用BamHI再次消化，并進(jìn)行凝膠純化。該過(guò)程將截短的RSV GcDNA(缺少包括跨膜域在內(nèi)的N-末端91個(gè)氨基酸殘基的編碼區(qū))置于立即早期CMV啟動(dòng)子和人CMV的內(nèi)含子A序列的下游，和BGH polyA位點(diǎn)的上游。另外，導(dǎo)入了大約100bp的5’非翻譯區(qū)和人類(lèi)纖溶酶原激活物蛋白的信號(hào)肽(圖7)的編碼序列，該序列框內(nèi)融合在位于CMV啟動(dòng)子/內(nèi)含子A序列下游的RSV G蛋白編碼序列的N-末端。通過(guò)測(cè)序分析證實(shí)了所述cDNA片段結(jié)合在所述質(zhì)粒結(jié)構(gòu)上。所得到的質(zhì)粒被命名為pXL6。
例2該實(shí)施例披露了小鼠的免疫。如參考文獻(xiàn)24中所披露的，小鼠易感RSV。
通過(guò)兩次氯化銫離心純化質(zhì)粒DNA。為了進(jìn)行肌內(nèi)(i.m.)免疫，用2×50μg(1μg/μl，溶解在PBS中)的pXL5、pXL6或V-1012從兩側(cè)對(duì)BALB/c小鼠(雄性，6-8周齡)(Jackson Lab.，BarHarbor，ME，USA)的脛骨前側(cè)肌肉進(jìn)行注射。在注射DNA之前5天用2×50μl(10μM，溶解在PBS中)的洋地黃毒苷(Latoxan，法國(guó))處理所述肌肉，以便增強(qiáng)DNA吸收并增強(qiáng)免疫應(yīng)答，如Davis等所披露的(參考文獻(xiàn)23)。分別在6周和13周之后用相同劑量的質(zhì)粒DNA對(duì)所述動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)化免疫。為了進(jìn)行真皮內(nèi)(i.d.)免疫，將100μg的質(zhì)粒DNA(2μg/μl，溶解在PBS中)注射到其尾巴根處，并分別在6周和13周之后強(qiáng)化免疫。通過(guò)鼻內(nèi)方式(i.n.)用生長(zhǎng)在Hep2細(xì)胞中的106噬菌斑形成單位(pfu)的A2亞型的臨床RSV株對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組中的小鼠進(jìn)行免疫，所述菌株是由B.Eraham博士惠贈(zèng)的(參考文獻(xiàn)24)。
在第三次免疫4周之后，通過(guò)鼻內(nèi)途徑用106pfu的RSV A2菌株刺激小鼠。4天以后，在無(wú)菌條件下取出肺，稱(chēng)重，并在2ml的完全培養(yǎng)基中勻漿(參考文獻(xiàn)25)。按以前披露的方法(參考文獻(xiàn)26)用疫苗質(zhì)量Vero細(xì)胞重復(fù)測(cè)定肺勻漿物中的pfu的數(shù)量。
例3該實(shí)施例披露了多核苷酸免疫的免疫原性和保護(hù)作用。
用特異酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)分析獲自免疫小鼠的抗血清的抗-RSV G IgG抗體效價(jià)，并分析RSV-特異噬斑降低效價(jià)。ELISAs是用涂有免疫親和純化RSV G蛋白(50ng/mL)和2倍系列稀釋的免疫血清的96孔平板進(jìn)行的。將與堿性磷酸酶(JacksonImmunoRes.，Mississauga，Ontario，加拿大)綴合的山羊抗小鼠IgG抗體用作第二抗體。按照Prince等的方法(參考文獻(xiàn)26)用疫苗質(zhì)量Vero細(xì)胞測(cè)定噬斑降低效價(jià)。將免疫血清的4倍系列稀釋液與50pfu的RSV Long株(ATCC)一起放在培養(yǎng)基中，在有5％二氧化碳的條件下在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)，并將該混合物用于感染Vero細(xì)胞。用80％的甲醇固定噬斑，并于5天之后用與過(guò)氧化物酶(JacksonImmunoRes.，Mississauga，Ontario，加拿大)綴合的小鼠抗RSV F單克隆IgGl抗體和驢抗小鼠IgG抗體顯色。所述RSV-特異噬斑降低效價(jià)被定義為導(dǎo)致噬斑數(shù)量降低60％的血清樣品稀釋度。ELISA和噬斑降低測(cè)定都重復(fù)進(jìn)行，所給出的數(shù)據(jù)是兩次測(cè)定的平均值。
所獲得的結(jié)果在下面的表I和II中示出表I.DNA-G在BALB/c小鼠體內(nèi)的免疫原性免疫原 抗-RSVG lgG效價(jià) RSV特異性噬斑效價(jià) (Log2(效價(jià)/100)減少6周 10周 17周 (Log2效價(jià))17周VR-1012(i.m.) 0.00±0.000.00±0.00 0.00±0.000.00±0.00pXL5(i.m.) 3.10±2.779.70±1.06 8.60±1.175.40±1.65pXL6(i.m.) 5.78±1.209.30±0.82 8.89±1.547.26±0.82pXL5(i.d.) 1.50±1.278.60±1.43 8.30±1.257.92±0.59pXL6(i.d.) 3.70±1.2510.30±1.06 9.44±1.246.92±0.94RSV(i.n.) 6.83±0.419.67±0.52 9.83±0.4111.80±0.08表II.DNA-G在BALB/c小鼠中的免疫保護(hù)能力免疫原 小鼠數(shù) 平均病毒肺效價(jià)* 充分保護(hù)(pfu/g肺) 的小鼠數(shù)#(Log10±SD)VR-1012(i.m.) 6 4.81±0.010pXL5(i.m.)6 0.29±0.905pXL6(i.m.)6 0.40±1.205pXL5(i.d.)6 0.30±1.105pXL6(i.d.)6 0.29±0.905RSV(i.n.) 6 0.00±0.006*測(cè)定的靈敏度101.96pfu/g肺#術(shù)語(yǔ)充分保護(hù)的小鼠是指在病毒刺激之后4天，在肺中無(wú)可檢測(cè)到的RSV的動(dòng)物。
如表I所示，在通過(guò)i.m.或i.d.免疫之后，質(zhì)粒pXL5和pXL6是產(chǎn)生抗-G抗體和病毒中和抗體的免疫原。另外，如表II所示，質(zhì)粒pXL5和pXL6能保護(hù)免疫過(guò)的小鼠的下呼吸道不受最初的RSV感染。對(duì)照載體不能產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且不能提供保護(hù)作用。
例4該實(shí)施例披露了在用RSV刺激之后用pXL5和pXL6免疫過(guò)的小鼠中局部肺細(xì)胞因子表達(dá)特征的確定。
在第0周和第6周用100μg按照例l的方法制備的pXL5和pXL6免疫BALB/c小鼠，并在第10周通過(guò)i.n.用RSV刺激。對(duì)照動(dòng)物用相同的方法用空白PI-RSV和活的RSV免疫，并用RSV刺激。另外，按照申請(qǐng)日為1995年6月7日的待批美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/476,397，(WO96/40945)中披露的方法用pXL2免疫動(dòng)物，并按照相同方法用RSV刺激。在病毒刺激4天之后，將肺從免疫過(guò)的小鼠體內(nèi)取出，并馬上在液氮中冷凍。在TRIzol/β-巰基乙醇中勻漿肺，通過(guò)氯仿提取和異丙醇沉淀制備總RNA。然后用購(gòu)自CloneTech的IL-4、IL-5或IFN-γ特異引物對(duì)所述RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。然后將擴(kuò)增的產(chǎn)物與購(gòu)自CloneTech的細(xì)胞因子特異性32P-標(biāo)記過(guò)的探針進(jìn)行液體雜交，在5％聚丙烯酰胺凝膠上分離，并通過(guò)掃描所述凝膠中的放射性信號(hào)進(jìn)行定量。從每一個(gè)處理組中取出3個(gè)小鼠肺，并分析肺細(xì)胞因子表達(dá)，至少進(jìn)行2次。結(jié)果在圖8中示出，并且，在圖中示出了所述測(cè)定的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。
從圖8中提供的數(shù)據(jù)可以看出1.用活RSV通過(guò)鼻腔內(nèi)(i.n.)方法進(jìn)行免疫會(huì)產(chǎn)生平衡的細(xì)胞因子曲線(IFN-γ、IL-4和IL-5)，而用FI-RSA通過(guò)肌內(nèi)(i.m.)方法進(jìn)行免疫會(huì)產(chǎn)生Th2優(yōu)勢(shì)(較高的IL-4和IL-5)。以上結(jié)果類(lèi)似于在有關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)的結(jié)果。
2.通過(guò)i.m.或真皮內(nèi)(i.d.)方法用pXL5或pXL6免疫可產(chǎn)生類(lèi)似活的RSV免疫的平衡的細(xì)胞因子曲線。
3.用能表達(dá)分泌型蛋白(SEC)的結(jié)構(gòu)通過(guò)i.m.進(jìn)行pXL6(RSV G)和pXL2(RSV F)免疫所產(chǎn)生的細(xì)胞因子應(yīng)答的強(qiáng)度明顯高于用活的RSV免疫產(chǎn)生的免疫強(qiáng)度。
4.用能表達(dá)完整長(zhǎng)度的膜結(jié)合RSV G蛋白(MA)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行pXL5免疫和i.d.pXL6所產(chǎn)生的細(xì)胞因子應(yīng)答的強(qiáng)度略高于用活的RSV免疫產(chǎn)生的免疫強(qiáng)度。
5.與由Openshaw等所報(bào)導(dǎo)的結(jié)果不同(參考文獻(xiàn)13)，用DNA-G免疫觀察到了平衡的局部細(xì)胞因子應(yīng)答。所述研究者使用表達(dá)G蛋白的重組疫苗病毒通過(guò)支氣管肺泡灌洗分析報(bào)導(dǎo)了局部Th2應(yīng)答。本發(fā)明的結(jié)果是通過(guò)單基因方法獲得的，表明Th2應(yīng)答不一定是G蛋白的內(nèi)在特征。
說(shuō)明書(shū)總結(jié)作為本說(shuō)明書(shū)的總結(jié)，本發(fā)明提供了含有編碼RSV G蛋白的基因的新型非復(fù)制型載體，用所述載體免疫的方法，以及用所述載體診斷的方法。在本發(fā)明范圍內(nèi)進(jìn)行改進(jìn)是可能的。
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權(quán)利要求
1.一種用于給宿主體內(nèi)服用以便在該宿主體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白的保護(hù)性抗體的免疫組合物，包括一種非復(fù)制型載體和可藥用的載劑，所述非復(fù)制型載體包括一個(gè)編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，一個(gè)可操作地連接于所述第一核苷酸序列上的啟動(dòng)子序列，以便在所述宿主中表達(dá)所述RSV G蛋白，和一個(gè)位于所述第一核苷酸序列和所述啟動(dòng)子序列之間的第二核苷酸序列，以便增強(qiáng)所述載體在所述宿主中進(jìn)行的RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1的組合物，其中，所述第一核苷酸序列編碼完整長(zhǎng)度的RSV G蛋白。
3.如權(quán)利要求2的組合物，其中，所述核苷酸序列包括圖2所示的核苷酸序列(序列1)。
4.如權(quán)利要求2的組合物，其中，所述第一核苷酸序列包括編碼具有圖2所示氨基酸序列(序列2)的完整長(zhǎng)度RSV G蛋白的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求1的組合物，其中，所述第一核苷酸序列編碼缺少跨膜編碼區(qū)和其上游序列的RSV G蛋白。
6.如權(quán)利要求5的組合物，其中，所述非復(fù)制型載體還包括一個(gè)緊靠所述第一核苷酸序列的5’末端上游的異源信號(hào)肽編碼核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求6的組合物，其中，所述信號(hào)肽編碼序列編碼人組織纖溶酶原激活物的信號(hào)肽。
8.如權(quán)利要求5的組合物，其中，所述第一核苷酸序列包括圖3所示核苷酸序列(序列3)。
9.如權(quán)利要求5的組合物，其中，所述第一核苷酸序列包括編碼具有圖3所示氨基酸序列(序列4)的截短的RSV G蛋白的核苷酸序列。
10.如權(quán)利要求1的組合物，其中，所述啟動(dòng)子序列是立即早期巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。
11.如權(quán)利要求1的組合物，其中，所述第二核苷酸序列是人巨細(xì)胞病毒內(nèi)含子A。
12.如權(quán)利要求1的組合物，其中，所述非復(fù)制型載體是質(zhì)粒載體。
13.如權(quán)利要求12的組合物，其中，所述質(zhì)粒載體是如圖4所示的pXL5。
14.如權(quán)利要求12的組合物，其中，所述質(zhì)粒載體是如圖5所示的pXL6。
15.一種免疫宿主使其抵抗由呼吸道合胞病毒(RSV)感染引起的疾病的方法，該方法包括給所述宿主服用有效量的非復(fù)制型載體，該載體包括一個(gè)編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，一個(gè)可操作地連接于所述第一核苷酸序列上的啟動(dòng)子序列，以便在所述宿主中表達(dá)所述RSV G蛋白，和一個(gè)位于所述第一核苷酸序列和所述啟動(dòng)子序列之間的第二核苷酸序列，以便增強(qiáng)所述載體在所述宿主中進(jìn)行RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)。
16.如權(quán)利要求15的方法，所述第一核苷酸序列編碼完整長(zhǎng)度RSV G蛋白。
17.如權(quán)利要求16的方法，所述核苷酸序列包括圖2所示的核苷酸序列(序列1)。
18.如權(quán)利要求16的方法，所述第一核苷酸序列包括編碼圖2所示完整長(zhǎng)度RSV G蛋白的核苷酸序列(序列2)。
19.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述第一核苷酸序列編碼缺少跨膜編碼序列和其上游序列的RSV G蛋白。
20.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述非復(fù)制型載體還包括緊靠所述第一核苷酸序列5’末端上游的異源信號(hào)肽編碼核苷酸序列。
21.如權(quán)利要求20的方法，其中，所述信號(hào)肽編碼序列編碼人組織纖溶酶原激活物的信號(hào)肽。
22.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述第一核苷酸序列包括如圖3所示的核苷酸序列(序列3)。
23.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述第一核苷酸序列包括編碼如圖3所示截短的RSV G蛋白的核苷酸序列(序列4)。
24.如權(quán)利要求15的方法，所述啟動(dòng)子序列是立即早期巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。
25.如權(quán)利要求15的方法，其中，所述第二核苷酸序列是人巨細(xì)胞病毒內(nèi)含子A。
26.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述非復(fù)制型載體是質(zhì)粒載體。
27.如權(quán)利要求26的方法，其中，所述質(zhì)粒載體是如圖4所示pXL5。
28.如權(quán)利要求26的方法，其中，所述質(zhì)粒載體是如圖5所示pXL6。
29.如權(quán)利要求15的方法，其中，誘導(dǎo)了平衡的Th1/Th2免疫應(yīng)答。
30.一種用編碼呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白或RSV G蛋白片段的基因在宿主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，該方法包括分離所述基因；將所述基因可操作地連接在至少一個(gè)控制序列上，以便產(chǎn)生一種非復(fù)制型載體，所述控制序列在導(dǎo)入所述宿主之后能指導(dǎo)RSV G蛋白的表達(dá)，以便產(chǎn)生針對(duì)所述RSV G蛋白的免疫應(yīng)答，和將所述載體導(dǎo)入所述宿主。
31.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述編碼RSV G蛋白的基因編碼完整長(zhǎng)度RSV G蛋白。
32.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述編碼RSV G蛋白的基因編碼缺少跨膜域和其上游序列的RSV G蛋白。
33.如權(quán)利要求32的方法，其中，所述載體還包括緊靠所述第一核苷酸序列的5’末端上游的信號(hào)肽編碼核苷酸序列。
34.如權(quán)利要求33的方法，其中，所述信號(hào)肽編碼序列編碼人組織纖溶酶原激活物的信號(hào)肽。
35.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述至少一個(gè)控制序列包括立即早期巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。
36.如權(quán)利要求35的方法，包括以下步驟將所述基因可操作地連接于免疫保護(hù)增強(qiáng)序列上，以便在所述宿主中產(chǎn)生針對(duì)所述RSV G蛋白的增強(qiáng)的免疫保護(hù)作用。
37.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述免疫保護(hù)增強(qiáng)序列被導(dǎo)入所述載體的所述控制序列和所述基因之間。
38.如權(quán)利要求37的方法，其中，所述免疫包括保護(hù)增強(qiáng)序列是人巨細(xì)胞病毒內(nèi)含子A。
39.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述基因被包含在選自下列一組的質(zhì)粒上pXL5或pXL6。
40.一種生產(chǎn)用于保護(hù)宿主免受由于呼吸道合胞病毒(RSV)感染引起的疾病的疫苗的方法，該方法包括分離編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，將所述第一核苷酸序列可操作地連接于至少一個(gè)控制序列上，以便產(chǎn)生一種非復(fù)制型載體，所述控制序列在導(dǎo)入宿主之后可指導(dǎo)所述RSV G蛋白的表達(dá)，以便產(chǎn)生針對(duì)RSV G蛋白的免疫應(yīng)答，將所述第一核苷酸序列可操作地連接于第二核苷酸序列上，以便在所述宿主中增強(qiáng)由所述載體進(jìn)行的所述RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)，和將所述載體制備成用于給宿主體內(nèi)服用的疫苗。
41.如權(quán)利要求40的方法，其中，所述載體選自下列一組pXL5和pXL6。
42.一種用權(quán)利要求40的方法生產(chǎn)的疫苗。
43.一種測(cè)定樣品中呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白存在的方法，包括以下步驟a)用一種非復(fù)制型載體免疫宿主，以便產(chǎn)生對(duì)所述RSV G蛋白特異的抗體，所述非復(fù)制型載體包括編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，一個(gè)可操作地連接于所述第一核苷酸序列上的啟動(dòng)子序列，以便在所述宿主中表達(dá)所述RSV G蛋白，以及位于所述第一核苷酸序列和所述啟動(dòng)子序列之間的第二核苷酸序列，以便在所述宿主中增強(qiáng)由所述載體進(jìn)行的RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)；b)分離所述RSV G蛋白特異性抗體；c)讓所述樣品與分離的抗體接觸，以便產(chǎn)生包括存在于所述樣品中的任何RSV G蛋白和RSV G蛋白特異性抗體的復(fù)合體；和d)測(cè)定所述復(fù)合體的產(chǎn)生。
44.如權(quán)利要求43的方法，其中，所述載體選自下列一組pXL5和pXL6。
45.一種用于檢測(cè)樣品中呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白存在的診斷試劑盒，包括a)一種非復(fù)制型載體，該載體在給宿主服用之后能產(chǎn)生對(duì)所述RSV G蛋白特異的抗體，所述非復(fù)制型載體包括編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，一個(gè)可操作地連接于所述第一核苷酸序列上的啟動(dòng)子序列，以便在宿主中表達(dá)所述RSV G蛋白，以及位于所述第一核苷酸序列和所述啟動(dòng)子序列之間的第二核苷酸序列，以便在所述宿主中增強(qiáng)由所述載體進(jìn)行的RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)；b)分離所述RSV G蛋白特異性抗體的分離裝置；c)讓所述分離的RSV G蛋白特異抗體與所述樣品接觸的裝置，以便產(chǎn)生包括存在于所述樣品中的任何RSV G蛋白和RSV G蛋白特異性抗體的復(fù)合體；和d)測(cè)定所述復(fù)合體產(chǎn)生的鑒定裝置。
46.如權(quán)利要求45的診斷試劑盒，其中，所述載體選自下列一組pXL5和pXL6。
47.一種用于生產(chǎn)對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白特異的抗體的方法，包括a)用有效量的非復(fù)制型載體對(duì)宿主進(jìn)行免疫，以便產(chǎn)生RSV G蛋白特異性抗體，所述非復(fù)制型載體包括一個(gè)編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，一個(gè)可操作地連接于所述第一核苷酸序列上的啟動(dòng)子，用于在宿主中表達(dá)所述RSV G蛋白，和位于所述第一核苷酸序列和所述啟動(dòng)子序列之間的第二核苷酸序列，以便在所述宿主中增強(qiáng)由所述載體進(jìn)行的RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)；b)從所述宿主中分離RSV G蛋白特異性抗體；
48.一種生產(chǎn)對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)的G蛋白特異的單克隆抗體的方法，包括以下步驟a)構(gòu)建一種載體，該載體包括編碼RSV G蛋白或RSV G蛋白片段的第一核苷酸序列，所述蛋白片段能產(chǎn)生與RSV G蛋白特異反應(yīng)的抗體，一個(gè)可操作地連接于所述第一核苷酸序列上的啟動(dòng)子序列，以便在所述宿主中表達(dá)所述RSV G蛋白，以及位于所述第一核苷酸序列和所述啟動(dòng)子序列之間的第二核苷酸序列，以便在宿主中增強(qiáng)由所述載體進(jìn)行的RSV G蛋白的體內(nèi)表達(dá)；b)給至少一只小鼠服用所述載體，以便產(chǎn)生至少一只免疫的小鼠；c)從所述至少一只免疫小鼠體內(nèi)取出B-淋巴細(xì)胞；d)將來(lái)自所述至少一只免疫小鼠的B-淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以便產(chǎn)生雜交瘤；e)克隆所述雜交瘤；f)篩選能產(chǎn)生抗-RSV G蛋白抗體的克?。籫)培養(yǎng)所述產(chǎn)生抗-RSV G蛋白抗體的克?。籬)由培養(yǎng)物中分離抗-RSV G蛋白單克隆抗體。
全文摘要
披露了諸如質(zhì)粒載體的非復(fù)制型載體,該載體含有編碼呼吸道合胞病毒(RSV)的G蛋白的核苷酸序列,以及該序列的啟動(dòng)子,優(yōu)選為巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。所述載體還可以包含靠近所述RSV G蛋白編碼序列的其它核苷酸序列,以便在體內(nèi)表達(dá)時(shí)增強(qiáng)RSV G蛋白的免疫保護(hù)能力。可以通過(guò)服用所述非復(fù)制型載體,將所述載體用于對(duì)包括人類(lèi)宿主在內(nèi)的宿主進(jìn)行免疫,使其免受RSV感染。還可將所述非復(fù)制型載體用于生產(chǎn)抗體,以便在樣品中檢測(cè)RSV感染。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1271389SQ98809301
公開(kāi)日2000年10月25日 申請(qǐng)日期1998年7月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月18日
發(fā)明者李小毛, S·桑布哈拉, M·H·克萊恩 申請(qǐng)人:康諾特實(shí)驗(yàn)室有限公司