本發(fā)明涉及藍(lán)布正丙酮提取物及其在治療壞死性腸炎中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、壞死性腸炎(necrotic?enteritis)是由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的一種腸道細(xì)菌性疾病，常常伴隨腹瀉等癥狀，具有高發(fā)病率和高死亡率等特點，極大的損傷了人類健康和損害了家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。
2、目前，治療雞壞死性腸炎時多使用青霉素、泰樂菌素、林可霉素、阿莫西林等抗生素類藥物，但由于抗生素類藥物治療雞壞死性腸炎時濫用、長期不合理使用，導(dǎo)致耐藥率逐漸提高以及藥物殘留風(fēng)險增加。飼用抗生素的濫用、誤用及不合理使用嚴(yán)重?fù)p害了動物和人類健康，目前研究的較多的替抗產(chǎn)品主要有益生菌、植物提取物等。
3、中草藥成分屬于天然化合物，有低毒、無殘留、無污染等特點，中草藥提取物的生物活性物質(zhì)如黃酮類、鞣質(zhì)(多酚)類、萜類、精油類具有抗炎、抗菌、抗氧化等藥理活性。近年來，研究發(fā)現(xiàn)許多中藥提取物、中藥制劑都具有治療雞壞死性腸炎的效果，中草藥對開發(fā)天然高效的動物疾病治療新藥具有重要意義。
4、藍(lán)布正(geiherba)是薔薇科(rosaceae)路邊青屬(geum)植物柔毛路邊青(geumjaponicum?thunb.var.chinense?f.bolle)的干燥全草，又名水楊梅、追風(fēng)七、路邊青等，收載于2020版《中國藥典》，在我國分布廣泛，其全草均可入藥，有益氣補血、祛痰平喘、活血解毒、補虛益腎、祛風(fēng)止痛等功效。藍(lán)布正化學(xué)成分豐富，主要成分包括三萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類、木脂素、揮發(fā)油等化合物，具有抗炎、抗高血壓、抗凝血、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗腹瀉等藥理作用。而如何提高藍(lán)布正的提取物的有效物質(zhì)是重要的研究方向。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明為了進(jìn)一步探究藍(lán)布正抗炎、抗腹瀉的藥理作用機制，首先以藍(lán)布正為研究對象，對藍(lán)布正丙酮提取物中化學(xué)成分進(jìn)行分析；探究藍(lán)布正丙酮提取物中總鞣質(zhì)含量，并優(yōu)化工藝流程，得到藍(lán)布正總鞣質(zhì)提取的最佳參數(shù)；基于脂多糖(lps)誘導(dǎo)小鼠小腸modek細(xì)胞炎癥模型評價藍(lán)布正丙酮提取物的體外抗炎作用；通過藍(lán)布正丙酮提取物對產(chǎn)氣莢膜梭菌體外抑菌試驗確定藍(lán)布正丙酮提取物的抑菌效果，并通過建立以雞為模型的壞死性腸炎人工發(fā)病模型，研究藍(lán)布正丙酮提取物防治家禽壞死性腸炎的效果。本發(fā)明為藍(lán)布正抗炎、抗腹瀉的作用機制提供研究方向，為藍(lán)布正的臨床應(yīng)用和相關(guān)新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。
2、主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下：
3、1.藍(lán)布正丙酮提取物化學(xué)成分分析：以料液比1:10、70％的丙酮溶劑、提取溫度65℃、提取時間1h為提取條件，采用加熱回流法，提取藍(lán)布正總鞣質(zhì)，通過hplc-esi-q-tof-ms技術(shù)對藍(lán)布正丙酮提取物中的成分進(jìn)行分析研究。得到了29種以上的化合物，其中鞣花酸含量最高，23-羥基委陵菜酸含量最低。
4、2.藍(lán)布正總鞣質(zhì)丙酮提取工藝優(yōu)化：(1)采用紫外-可見分光光度法建立對藍(lán)布正總鞣質(zhì)的含量測定方法。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，發(fā)現(xiàn)以760nm處od值測定藍(lán)布正總鞣質(zhì)具有良好的相關(guān)性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性；(2)在料液比、丙酮濃度、提取時間三個單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過正交設(shè)計實驗確定藍(lán)布正總鞣質(zhì)丙酮提取法的最佳工藝條件。結(jié)果顯示，藍(lán)布正最佳工藝參數(shù)為：回流提取法，丙酮濃度50％，反應(yīng)時間0.5h，料液比1:5，提取溫度65℃。在該提取工藝條件下，提取物總鞣質(zhì)含量可達(dá)到30.2840mg/g。
5、3.藍(lán)布正丙酮提取物防治壞死性腸炎的動物實驗。通過建立雞壞死性腸炎人工發(fā)病模型，觀察腸道病變、不同腸段(十二指腸、空腸、回腸)的病理組織學(xué)特征，利用gc、高通量測序、qpcr等方法檢測盲腸短鏈脂肪酸、腸道菌群、空腸粘膜mrna等。結(jié)果顯示：
6、(1)根據(jù)雞壞死性腸炎小腸病變記分標(biāo)準(zhǔn)對腸道肉眼記分進(jìn)行評分，結(jié)果顯示，與發(fā)病對照組相比，藍(lán)布正中劑量預(yù)防組顯著降低(p<0.05)，藍(lán)布正低、高劑量預(yù)防組以及石榴皮對照組無顯著性差異。
7、(2)取各組空腸、回腸和十二指腸腸段進(jìn)行組織切片，并于顯微鏡下觀察腸道絨毛長度和隱窩深度，量取其數(shù)值并計算絨毛長度與隱窩深度的比值，用于評價藍(lán)布正提取物對于腸道組織形態(tài)的改善效果。結(jié)果顯示，藍(lán)布正高劑量預(yù)防組空腸、十二指腸絨毛長度顯著高于發(fā)病對照組(p)，絨毛長度/隱窩深度顯著高于發(fā)病對照組(p<0.05)；與發(fā)病對照組相比，藍(lán)布正低、中劑量預(yù)防組絨毛長度無顯著性差異，各藥物預(yù)防組組隱窩深度無顯著性差異。
8、(3)提取小腸內(nèi)容物基因組dna，使用qpcr檢測其中的產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量,結(jié)果顯示，藍(lán)布正低、中、高劑量預(yù)防組小腸內(nèi)容物中產(chǎn)氣莢膜梭菌含量顯著低于發(fā)病對照組(p＜0.05)。
9、(4)提取小腸內(nèi)容物的dna進(jìn)行16s?rrna基因高通量測序，對腸道菌群進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與發(fā)病組相比，藍(lán)布正中劑量預(yù)防組sobs指數(shù)顯著升高(p＜0.05)，表明藍(lán)布正丙酮提取物能夠提高腸道微生物豐富度；與發(fā)病組相比，各預(yù)防組微生物群落多樣性shannon指數(shù)無顯著差異。門水平物種豐度分析結(jié)果顯示，空白對照組(o組)厚壁菌門相對豐度顯著低于其他組(p＜0.05)；空白對照組放線菌門相對豐度顯著高于其他組(p＜0.05)。屬水平物種豐度分析結(jié)果顯示，與魚粉對照組相比，發(fā)病對照組乳桿菌屬相對豐度顯著升高，狹義梭菌屬_1相對豐度顯著降低(p＜0.05)；與發(fā)病對照組相比，藍(lán)布正各劑量預(yù)防組乳桿菌屬相對豐度顯著降低(p＜0.05)，羅姆布茨菌屬相對豐度顯著升高(p＜0.05)，藍(lán)布正中劑量預(yù)防組分段絲狀細(xì)菌屬相對豐度顯著升高(p＜0.05)，藍(lán)布正低劑量預(yù)防組腸球菌屬相對豐度顯著升高(p＜0.05)，藍(lán)布正高劑量預(yù)防組梭狀芽胞桿菌相對豐度顯著升高(p＜0.05)。
10、(5)提取空腸粘膜的rna，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選不同處理組的差異表達(dá)基因(degs)，并進(jìn)行富集分析。go功能富集分析結(jié)果顯示，發(fā)病對照組與魚粉對照組之間的差異表達(dá)基因在生物過程方面主要富集到核染色體分離、細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、細(xì)胞有絲分裂周期等過程；在細(xì)胞成分方面，主要富集到染色體著絲粒區(qū)、染色體區(qū)、染色體組織等成分；在分子功能方面，主要富集到細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等功能。藍(lán)布正組與發(fā)病對照組之間的degs主要富集到有機酸代謝過程、小分子代謝過程、脂質(zhì)代謝、羧酸代謝、細(xì)胞周期、染色體分離等；在分子功能方面，主要富集到氧化還原驅(qū)動的活性跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、初級活性跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、電子轉(zhuǎn)移活性等。
11、kegg功能富集分析結(jié)果顯示，發(fā)病對照組與魚粉對照組之間的差異表達(dá)基因富集顯著的通路主要有foxo轉(zhuǎn)錄因子信號通路等；藍(lán)布正組與發(fā)病對照組之間的degs富集顯著的通路主要有化學(xué)致癌-活性氧、氧化磷酸化、趨化因子信號通路、半乳糖代謝、foxo轉(zhuǎn)錄因子信號通路等。
12、(6)提取盲腸內(nèi)容物，采用氣相色譜法檢測短鏈脂肪酸含量。結(jié)果顯示，與發(fā)病對照組相比，藍(lán)布正中、高劑量預(yù)防組乙酸、丙酸、丁酸含量顯著升高(p<0.05)。
13、結(jié)論：
14、1.本發(fā)明通過超高效液相-飛行時間質(zhì)譜(uhplc-q-tof-ms)分析方法，對藍(lán)布正丙酮提取物進(jìn)行成分分析，得到29種疑似化合物，其中可推測出結(jié)構(gòu)式的有23種，以含量高低依次為鞣花酸、密蒙花苷、4,4'-二甲基鞣花酸等鞣質(zhì)類、黃酮類化合物，為后續(xù)藍(lán)布正的丙酮回流提取工藝優(yōu)化提供了實驗基礎(chǔ)。
15、2.通過正交設(shè)計實驗確定了藍(lán)布正總鞣質(zhì)提取的最佳提取工藝為：回流提取法，提取溶劑丙酮濃度50％，提取時間0.5h，料液比1:5，提取溫度65℃。所得總鞣質(zhì)含量可達(dá)到30.2840mg/g。
16、3.雞壞死性腸炎人工發(fā)病模型試驗結(jié)果顯示，藍(lán)布正丙酮提取物可明顯減輕腸炎病變，具體在以下幾個方面：
17、(1)藍(lán)布正能顯著減低壞死性腸炎病變記分；藍(lán)布正對空腸和十二指腸腸道形態(tài)有明顯改善作用，腸絨毛高度及其與隱窩深度的比值顯著升高。
18、(2)藍(lán)布正能顯著降低小腸中netb陽性產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量；藍(lán)布正可顯著提高有益菌如屬羅姆布茨菌屬、分段絲狀細(xì)菌屬和梭狀芽胞桿菌相對豐度，對壞死性腸炎造成的小腸腸道菌群紊亂有不同程度的改善作用。