發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于治療成熟生物膜相關(guān)銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)感染的兩種已知藥物的協(xié)同組合。本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(nih)，約65％的所有微生物感染和80％的所有慢性感染都與細(xì)菌生物膜的存在相關(guān)。然而，最近才定義細(xì)菌生物膜代表對(duì)公共衛(wèi)生的重大威脅，因?yàn)樗鼈兪共≡w對(duì)抗生素和對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的敏感性降低。此外，生物膜相關(guān)的感染與多種由mdr(多重耐藥)細(xì)菌引起的感染性疾病的惡化有關(guān)，所述mdr細(xì)菌通常對(duì)更最近開(kāi)發(fā)的抗生素發(fā)展耐藥性。事實(shí)上，通常目前使用的抗生素可以減少生物膜中的細(xì)菌的數(shù)量，但它們不能完全根除在該受保護(hù)環(huán)境中的細(xì)菌(fernandez?barat,2017等人j.cyst.fibros.16,222-229doi:https://doi.org/10.1016/j.jcf.2016.08.005)。胞外聚合物(eps)(在下文中為生物膜)由蛋白質(zhì)(<1-2％，包括酶)、dna(<1％)、多糖(1-2％)、rna(<1％)和允許營(yíng)養(yǎng)素在生物膜基質(zhì)內(nèi)流動(dòng)的水(最高達(dá)97％)制成。生物膜形成是由于細(xì)菌機(jī)制和基因轉(zhuǎn)錄的激活，這些機(jī)制和基因轉(zhuǎn)錄對(duì)于浮游階段是不常見(jiàn)的。事實(shí)上，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變至生長(zhǎng)的生物膜階段時(shí)，它經(jīng)歷行為的表型轉(zhuǎn)換，其中大量基因被差異調(diào)節(jié)和表達(dá)(blasi?f.等人respiratory?medicine,2016,117:190-197；becker?p.等人,appl.env.microbiology,2001年7月,67(7):2958-2965；trubenova等人trends?in?microbiol,2022年3月22日,https://doi.org/10.1016/j.tim.2022.02.005)。事實(shí)上，形成生物膜的病原體展示與由相同病原體在浮游生長(zhǎng)階段中所展示的特征不同的特征，包括對(duì)抗生素的耐藥性或敏感性。這些差異解釋了為什么許多對(duì)浮游(快速生長(zhǎng))的細(xì)菌有效的抗生素對(duì)包埋在生物膜中的相同細(xì)菌無(wú)效，在所述生物膜中包埋的細(xì)菌還具有降低的生長(zhǎng)速率或是靜止的，并且因此對(duì)最常見(jiàn)的抗生素活性背后的機(jī)制較不敏感。這也可以解釋為什么診斷方法也可能無(wú)法確定細(xì)菌感染中的抗生素敏感性和最適合的抗生素療法：診斷試驗(yàn)通常是針對(duì)處于生長(zhǎng)的浮游階段中的細(xì)菌進(jìn)行的，而感染則通過(guò)生物膜生長(zhǎng)的細(xì)菌維持在潛伏狀態(tài)中(trubenova等人2022)。此外，直到最近，生物膜生長(zhǎng)的細(xì)菌都通過(guò)為浮游細(xì)菌開(kāi)發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定進(jìn)行研究，而處于該階段中的生物膜生長(zhǎng)的細(xì)菌的研究需要特定的試驗(yàn)，不幸的是，這些試驗(yàn)仍然缺乏良好的標(biāo)準(zhǔn)化。如blasi,2016(如上所引用，參見(jiàn)圖1)中所明確概述的，生物膜形成是一個(gè)多步驟的過(guò)程，其中細(xì)菌需要以可逆的方式粘附到基質(zhì)上，然后它們的粘附變成不可逆的，只有那時(shí)它們才發(fā)展出小菌落，并且之后，它們才發(fā)展出具有成熟生物膜的穩(wěn)定菌落。銅綠假單胞菌在醫(yī)院獲得性感染中具有高發(fā)病率，并且與高死亡率相關(guān)。此外，它參與多種持續(xù)性生物膜感染，并且是肺部慢性感染中的主要病原體。morse等人(frontiersin?immunology,2021,12:1-15)綜述了處于生長(zhǎng)的生物膜階段中的該病原體與人類(lèi)免疫系統(tǒng)之間的相互作用，并且圖1報(bào)告了生物膜的不同成熟階段的清晰示意圖，其中包括年輕的生物膜和成熟/年老的生物膜，每種生物膜都包含不同的細(xì)胞群以及不同的特征。通常，生物膜相關(guān)的感染保持無(wú)癥狀，直到生物膜已達(dá)到成熟/年老的階段并且開(kāi)始釋放浮游細(xì)胞或生物膜碎片(即，所謂的腐敗性栓子(septic?emboli))，這些是疾病的臨床表現(xiàn)的原因。常規(guī)的抗生素治療通?？梢詺鐝纳锬ぶ嗅尫诺母∮渭?xì)胞和部分生物膜包埋細(xì)胞，“耐藥株(persister)”細(xì)胞(由于特有的生理狀態(tài)，對(duì)抗生素不敏感的休眠細(xì)胞)維持在生物膜內(nèi)，并且準(zhǔn)備促進(jìn)感染的復(fù)發(fā)。此外，已顯示銅綠假單胞菌中的多糖組分，特別是鼠李糖脂，充當(dāng)強(qiáng)力清潔劑，引起細(xì)胞壞死和中性粒細(xì)胞消除，因此進(jìn)一步屏蔽病原體免受宿主免疫反應(yīng)(jensen?p.等人,microbiology,2007,153:1329-1338)。在文獻(xiàn)中，關(guān)于抗生素和粘液溶解劑如nac之間的假設(shè)的相互作用，報(bào)告了有爭(zhēng)議的結(jié)果。在1981年，roberts和cole發(fā)現(xiàn)2％-5％的nac展示出對(duì)銅綠假單胞菌的抗微生物活性，并且低濃度的nac增強(qiáng)了羧芐西林對(duì)銅綠假單胞菌的作用(journal?of?infection第3卷,第4期,1981年12月,353-359頁(yè))。在2016年，由landini等人進(jìn)行的關(guān)于高nac濃度對(duì)針對(duì)一系列呼吸系統(tǒng)病原體的抗生素活性的影響的研究結(jié)果，證明高nac濃度不干擾最常使用的抗生素的活性，而nac損害碳青霉烯類(lèi)的活性(landini等人.antimicrob.agents?chemother.2016年12月第60卷第12期7513-7517)。然而，所有nac誘導(dǎo)的生物學(xué)機(jī)制尚未被完全闡明。nac和粘菌素對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(s.maltophilia)和鮑氏不動(dòng)桿菌(a.baumannii)的強(qiáng)協(xié)同活性已由相同的申請(qǐng)人在wo2018/154091中描述。這些病原體的感染通常對(duì)健康人無(wú)害，僅在免疫功能低下的患者中引起嚴(yán)重肺炎，并且僅很少與致命后果相關(guān)。charrier等人在：“cysteaminea?novel?mucoactiveantimicrobial&antibiofilm?agent?for?the?treatment?of?cystic?fibrosis”orphanetjournal?of?rare?diseases?2014?9:189；doi:10.1186/s13023-014-0189-2)中公開(kāi)了半胱胺在增加銅綠假單胞菌對(duì)妥布霉素的敏感性方面的活性。他關(guān)注了該粘液溶解劑的活性，主要關(guān)注半胱胺對(duì)dna和粘蛋白(粘液的兩種主要組分)的粘彈性性質(zhì)、對(duì)預(yù)防生物膜形成的影響、和半胱胺的殺滅作用。銅綠假單胞菌參與多種持續(xù)性生物膜感染。在慢性肺部患者中，銅綠假單胞菌感染與頻繁加重和較高的死亡率相關(guān)(malhotra等人2019clin.microbiol.rev.32(3):e00138-18；parkins等人clin?microbiol?rev31(4):e00019-18)。此外，宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫的激活導(dǎo)致慢性炎癥狀態(tài)和導(dǎo)致廣泛的組織損傷，深刻影響肺功能。這使得對(duì)該病原體的有效治療變得極其緊迫，特別是對(duì)這些患者而言。值得注意的是，在患有囊性纖維化或其他慢性呼吸系統(tǒng)疾病的患者中，粘菌素常常用作被由該病原體或其他多重耐藥非發(fā)酵革蘭氏陰性病原體(例如，鮑氏不動(dòng)桿菌(acinetobacter?baumannii)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(stenotrophomonas?maltophilia))引起的感染的最后的治療手段，因此也增加了在屬于不同菌株的病原體之間發(fā)展和傳播對(duì)該抗生素的耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，鑒于過(guò)去幾年內(nèi)多重耐藥表型的擴(kuò)散和新一代抗生素的低功效，能夠克服和繞過(guò)細(xì)菌病原體(特別是主要病原體銅綠假單胞菌)的免疫逃逸機(jī)制的新的治療選擇極為緊迫。
背景技術(shù)：
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
0、發(fā)明概述
1、本發(fā)明涉及粘菌素和n-乙酰半胱氨酸(nac)的協(xié)同組合用于治療由病原體銅綠假單胞菌引起的細(xì)菌感染中的用途，其中所述病原體處于生長(zhǎng)的生物膜階段中。優(yōu)選地，所述細(xì)菌感染與呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)，如慢性阻塞性肺疾病(copd)、囊性纖維化(cf)，非囊性纖維化支氣管擴(kuò)張(ncfb)、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(vap)及其加重。
2、所述組合對(duì)病原體具有多重耐藥(mdr)或粘菌素耐藥(cstr)表型的銅綠假單胞菌感染特別有用，如，例如在醫(yī)院相關(guān)感染(hai)或醫(yī)療保健相關(guān)感染(hcai)中。
3、當(dāng)所述兩種藥物通過(guò)相同或不同的施用途徑，在施用時(shí)間段重疊或不重疊的情況下，按順序或分開(kāi)地同時(shí)施用，即使不是一起施用時(shí)，粘菌素和nac的組合也是協(xié)同的。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，粘菌素通過(guò)吸入途徑施用。
4、本發(fā)明的另外的目的是部件套盒，其包含一小瓶呈散劑的粘菌素和一小瓶nac水性溶液或作為片劑或顆粒劑的nac，任選地與稀釋裝置組合，用于聯(lián)合施用粘菌素和nac的協(xié)同組合。
5、用粘菌素和nac的協(xié)同組合用于治療銅綠假單胞菌感染的治療方法(其中病原體處于生長(zhǎng)的生物膜階段中)，以及用于根除有此需要的受試者中這樣的細(xì)菌感染的治療方法，也是被包含在本發(fā)明內(nèi)的實(shí)施方案。
6、附圖簡(jiǎn)要描述
7、圖1.n-乙酰半胱氨酸(nac)8000mg/l(灰色方塊)，粘菌素2、4和8mg/l(分別帶有淺灰色、深灰色和黑色邊框的空心方塊)，以及nac?8000mg/l與粘菌素2、4和8mg/l的組合(分別帶有淺灰色、深灰色和黑色邊框的灰色方塊)對(duì)來(lái)自cf(粘液型和粘菌素敏感的)的銅綠假單胞菌z154的抗生物膜活性。填充的圓圈表示不存在nac和/或粘菌素的生物膜(即，對(duì)照)。符號(hào)上面的黑色實(shí)線(xiàn)表示中位數(shù)值。x軸設(shè)定在檢測(cè)限處(即，20cfu/peg)。使用帶有dunn氏校正的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)(kruskal-wallis?test)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。****,p<0.0001。cfu：菌落形成單位。
8、圖2.n-乙酰半胱氨酸(nac)8000mg/l(灰色方塊)、粘菌素8mg/l(空心方塊)和nac/粘菌素組合(帶有黑色邊框的灰色方塊)對(duì)銅綠假單胞菌pao1(a)和來(lái)自cf的銅綠假單胞菌z34(b)(兩者均為非粘液型和粘菌素敏感的)的抗生物膜活性。填充的圓圈表示不存在nac和/或粘菌素的生物膜(即，對(duì)照)。符號(hào)上面的黑色實(shí)線(xiàn)表示中位數(shù)值。x軸設(shè)定在檢測(cè)限處(即，20cfu/peg)。使用帶有dunn氏校正的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。***,p<0.001；****,p<0.0001。cfu：菌落形成單位。
9、圖3.n-乙酰半胱氨酸(nac)8000mg/l(灰色方塊)、粘菌素8mg/l(空心方塊)和nac/粘菌素組合(帶有黑色邊框的灰色方塊)對(duì)銅綠假單胞菌m19(a)和銅綠假單胞菌m25(b)(兩者均來(lái)自cf，為粘液型和粘菌素敏感的)的抗生物膜活性。填充的圓圈表示不存在nac和/或粘菌素的生物膜(即，對(duì)照)。符號(hào)上面的黑色實(shí)線(xiàn)表示中位數(shù)值。x軸設(shè)定在檢測(cè)限處(即，20cfu/peg)。使用帶有dunn氏校正的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001。cfu：菌落形成單位。
10、圖4.n-乙酰半胱氨酸(nac)8000mg/l(灰色方塊)、粘菌素32mg/l(空心方塊)和nac/粘菌素組合(帶有黑色邊框的灰色方塊)對(duì)來(lái)自cf的銅綠假單胞菌fc238(非粘液型和粘菌素敏感的)的抗生物膜活性。填充的圓圈表示不存在nac和/或粘菌素的生物膜(即，對(duì)照)。符號(hào)上面的黑色實(shí)線(xiàn)表示中位數(shù)值。x軸設(shè)定在檢測(cè)限處(即，20cfu/peg)。使用帶有dunn氏校正的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。****,p<0.0001。cfu：菌落形成單位。
11、圖5.n-乙酰半胱氨酸(nac)8000mg/l(灰色方塊)、粘菌素64mg/l(空心方塊)和nac/粘菌素組合(帶有黑色邊框的灰色方塊)在asm生物膜模型中對(duì)銅綠假單胞菌z154(a)和銅綠假單胞菌z34(b)的抗生物膜活性。填充的圓圈表示不存在nac和/或粘菌素的生物膜(即，對(duì)照)。符號(hào)上面的黑色實(shí)線(xiàn)表示中位數(shù)值。x軸設(shè)定在檢測(cè)限處(即，100cfu/ml)。使用帶有dunn氏校正的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001。cfu：菌落形成單位。
12、圖6.殺滅曲線(xiàn)，其顯示無(wú)氧(a)和有氧(b)條件對(duì)n-乙酰半胱氨酸(nac)8000mg/l(灰色方塊)、粘菌素0.25mg/l(空心方塊)、和nac/粘菌素組合(帶有黑色邊框的灰色方塊)治療指數(shù)生長(zhǎng)的銅綠假單胞菌z154的浮游培養(yǎng)物的差異影響。填充的圓圈表示不存在nac和/或粘菌素的浮游培養(yǎng)物(即，對(duì)照)。繪制帶有范圍的中位數(shù)值。虛線(xiàn)指示檢測(cè)限(即，17cfu/ml)。cfu：菌落形成單位。