包含含有α-半乳糖苷酶A的融合蛋白的凍干制劑的制作方法

本發(fā)明涉及一種包含α-半乳糖苷酶a的融合蛋白的凍干制劑及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

1、溶酶體是參與蛋白質(zhì)、各種脂質(zhì)(例如糖脂和膽固醇)和碳水化合物的降解，以及降解產(chǎn)物再循環(huán)作為新蛋白質(zhì)、膜組分和其他分子的主要成分的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器。與其功能相關(guān)聯(lián)的疾病包括溶酶體貯積病(lysosomal?storage?disease,lsd)。

2、溶酶體貯積病(lsd)是由于編碼溶酶體中存在的降解糖脂或多糖廢物的酶的基因缺陷而引起的疾病，并且溶酶體酶的生物活性在患有溶酶體貯積病的個(gè)體的細(xì)胞和組織中顯著降低或缺失。這種降解酶的缺乏會(huì)造成物質(zhì)大量積聚，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能出現(xiàn)問題。

3、法布里病被認(rèn)為是溶酶體貯積病，是一種遺傳性糖脂(鞘糖脂)代謝疾患，由溶酶體中存在的水解酶α-半乳糖苷酶a缺陷或活性不足引起。法布里病作為α-半乳糖苷酶a缺乏癥的代表性疾病，是一種與x染色體相關(guān)聯(lián)的疾病，并且典型的法布里病患者一般具有與正常人相比小于1％的α-半乳糖苷酶a活性并且具有多種癥狀，包括四肢劇烈疼痛(肢端感覺異常)、少汗、角膜和晶狀體改變、皮膚病變(血管角化瘤)、腎衰竭、心血管疾病、肺衰竭、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和卒中。

4、法布里病會(huì)導(dǎo)致球形三酰神經(jīng)酰胺(globotriaosylceramide,gb3)在身體的大多數(shù)組織中逐漸積累。gb3的積累主要存在于血管內(nèi)皮中。gb3在血管內(nèi)皮中的這種逐漸積累會(huì)導(dǎo)致器官例如腎臟、心臟或大腦中的缺血和梗塞。

5、已經(jīng)對(duì)作為用于治療溶酶體貯積病的代表性方法的酶替代療法(enzyme-replacement?therapy,ert)進(jìn)行了大量研究(frances?m.platt等人,j?cell?biol.2012年11月26日；199(5):723-34)。特別地，由于溶酶體貯積病是由特定酶的基因缺陷引起的，因此替代缺陷酶的療法至關(guān)重要。酶替代療法是溶酶體貯積病的標(biāo)準(zhǔn)療法，并且通過替代缺陷酶可以具有緩解現(xiàn)有癥狀或延遲疾病進(jìn)展的效應(yīng)。因此，已經(jīng)對(duì)用于預(yù)防和治療α-半乳糖苷酶a缺乏癥的包含α-半乳糖苷酶a的各種制劑進(jìn)行了研究。

6、然而，在制劑的情況下，為了獲得穩(wěn)定性，制劑的組成根據(jù)活性成分(例如，蛋白質(zhì)藥物)的結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)、劑量等而顯著變化，并且因此至關(guān)重要的是開發(fā)適合于所述活性成分的特定組成，并且包含α-半乳糖苷酶a的制劑的開發(fā)是不足的。特別地，在包含高濃度α-半乳糖苷酶a融合蛋白的凍干制劑的情況下，由于例如蛋白質(zhì)沉淀的問題，存儲(chǔ)穩(wěn)定性會(huì)大大劣化，并且因此常規(guī)的凍干制劑包含濃度為5mg/ml或更低的α-半乳糖苷酶a融合蛋白。然而，需要開發(fā)一種包含高濃度α-半乳糖苷酶a融合蛋白的高度穩(wěn)定的制劑來提高功效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、技術(shù)問題

2、適合于長期存儲(chǔ)并且長時(shí)間具有α-半乳糖苷酶a活性的穩(wěn)定凍干制劑的開發(fā)是不足的，并且尚未開發(fā)出包含高濃度α-半乳糖苷酶a融合蛋白的凍干制劑，因此仍需要開發(fā)包含α-半乳糖苷酶a融合蛋白的新穎組合物的凍干制劑。

3、對(duì)問題的解決方案

4、本發(fā)明的目的是提供一種包含α-半乳糖苷酶a的融合蛋白的凍干制劑。

5、本發(fā)明的另一目的是提供一種用于制備所述凍干制劑的方法。

6、本發(fā)明的另一目的是提供一種用于重構(gòu)凍干制劑的方法。

7、發(fā)明的有益效應(yīng)

8、根據(jù)本發(fā)明的凍干制劑不僅通過包含為α-半乳糖苷酶a融合蛋白提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的組合物而具有存儲(chǔ)穩(wěn)定性，而且盡管包含高濃度的所述融合蛋白還具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。

技術(shù)特征：

1.一種凍干制劑，所述凍干制劑包含融合蛋白，在所述融合蛋白中α-半乳糖苷酶a連接至免疫球蛋白fc區(qū)，所述凍干制劑包含通過凍干水溶液制備的混合物，所述水溶液包含：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述緩沖劑包含組氨酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、乙酸或其鹽、磷酸或其鹽，或它們的任意組合。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述緩沖劑包含1mm至50mm的組氨酸。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述氨基酸選自由以下組成的組：絲氨酸、精氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸，以及它們的任意組合。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述水溶液進(jìn)一步包含濃度為0.5％(w/v)至4.0％(w/v)的糖。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的凍干制劑，其中所述糖是葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖，或它們的任意組合。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述水溶液進(jìn)一步包含濃度為0.5％(w/v)至4.0％(w/v)的糖醇。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的凍干制劑，其中所述糖醇是甘露醇、山梨醇，或它們的任意組合。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述水溶液進(jìn)一步包含濃度為0.002％(w/v)至0.1％(w/v)的非離子表面活性劑。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的凍干制劑，其中所述非離子表面活性劑選自由以下組成的組：泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80，以及它們的任意組合。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述水溶液進(jìn)一步包含濃度為5mm至300mm的等滲劑。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的凍干制劑，其中所述等滲劑是氯化鈉。

13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述α-半乳糖苷酶a包含氨基酸序列seq?idno:1。

14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述融合蛋白包含氨基酸序列seq?id?no:4。

15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述融合蛋白具有這樣的結(jié)構(gòu)，在所述結(jié)構(gòu)中兩個(gè)α-半乳糖苷酶a分子與二聚體形式的免疫球蛋白fc區(qū)的每個(gè)單體連接。

16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述凍干制劑包含通過凍干水溶液制備的混合物，所述水溶液包含：

17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述凍干制劑包含通過凍干水溶液制備的混合物，所述水溶液包含：

18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，其中所述凍干制劑用于預(yù)防或治療法布里病。

19.一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的凍干制劑的方法，所述方法包括凍干水溶液，所述水溶液包含α-半乳糖苷酶a融合蛋白，在所述α-半乳糖苷酶a融合蛋白中α-半乳糖苷酶a連接至免疫球蛋白fc區(qū)；緩沖劑；和氨基酸。

20.一種用于重構(gòu)根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的凍干制劑的方法，所述方法包括向根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的凍干制劑添加重構(gòu)溶液。

21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述重構(gòu)溶液是蒸餾水。

22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中通過所述方法制備的重構(gòu)制劑包含濃度為10mg/ml至100mg/ml的所述α-半乳糖苷酶a融合蛋白。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種包含α?半乳糖苷酶A的融合蛋白的凍干制劑及其制備方法，其中所述凍干制劑不僅通過包含為α?半乳糖苷酶A的融合蛋白提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的組合物而具有存儲(chǔ)穩(wěn)定性，而且盡管包含高濃度的所述融合蛋白還具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。

技術(shù)研發(fā)人員：金美羅,俞美離,孫載云,樸多義,李信愛,金真英,樸浚燮,張斗書,洪性熙,金尚允
受保護(hù)的技術(shù)使用者：株式會(huì)社綠十字
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9