一種中藥組合物及其用途的制作方法

本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種中藥組合物及其醫(yī)藥用途。

背景技術(shù)：

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，游離的癌細胞可以隨血液或淋巴液播散全身，形成遠端轉(zhuǎn)移如骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移，從而危及生命。迄今為止，并沒有很好的治療和控制乳腺癌增殖和復(fù)發(fā)的藥物。

在乳腺癌的綜合治療中，中醫(yī)藥治療在緩解術(shù)后癥狀和并發(fā)癥，減輕放、化療的毒副作用，抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方面優(yōu)勢顯著。

腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumorassociatedmacrophage，簡稱tam)泛指在腫瘤發(fā)生過程中浸潤于腫瘤并影響其發(fā)展轉(zhuǎn)移的巨噬細胞，是眾多腫瘤浸潤免疫細胞中重要的一個亞群，參與了腫瘤發(fā)生演進的整個過程，具有高度的可塑性和異質(zhì)性，約占所有腫瘤炎性細胞的50％。臨床研究證實m2型tam浸潤的數(shù)量與腫瘤患者的預(yù)后呈負相關(guān)性，腫瘤組織中的m2型巨噬細胞的大量存在提示預(yù)后不良，抑制m2型巨噬細胞是防治腫瘤增殖轉(zhuǎn)移改善預(yù)后的新策略。

研究證實，抑制破骨細胞分化是防治骨質(zhì)疏松和腫瘤骨轉(zhuǎn)移的治療策略之一。

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草hedyotisdiffusawilld.[oldenlandiadiffusa(willd.)roxb.]的全草，味甘、淡，性涼，歸胃、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、利尿消腫、活血止痛之效。臨床常用于咽喉腫痛、腸癰、癤腫瘡瘍、毒蛇咬傷以及腫瘤等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，白花蛇舌草能增強機體的免疫力，抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，殺菌，抗炎，乃“清熱解毒”之良藥。

半枝蓮為唇形科黃芩屬多年生本草植物半枝蓮scutellariabarbatad.don的干燥全草，味辛、苦，性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有清熱解毒，散瘀活血等功效。常用于治療腫瘤、黃疸型肝炎、胃腸炎、闌尾炎、扁桃體炎、肺炎等疾病?，F(xiàn)代藥理研究證實，半枝蓮具有調(diào)節(jié)機體免疫力，增強免疫活性，抗腫瘤，抗炎等作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的旨在提供一種中藥組合物及其用途。

具體地說，本發(fā)明的第一方面是提供了一種中藥組合物，所述中藥組合物由下列重量比的原料藥制成：白花蛇舌草:半枝蓮＝1:1，所述白花蛇舌草和半枝蓮經(jīng)粉碎，用水煎煮3～5次后合并提取液，濃縮得浸膏，將所得浸膏用石油醚脫脂，再用乙酸乙酯萃取1～6次即得。

本發(fā)明的第二方面是提供了上述中藥組合物在制備防治乳腺癌的藥物或保健品中的用途。

本發(fā)明的第三方面是提供了上述中藥組合物在制備抗炎藥物或保健品中的用途。

本發(fā)明的第四方面是提供了上述中藥組合物在制備抑制腫瘤相關(guān)巨噬細胞活性的藥物或保健品中的用途。

本發(fā)明的第五方面是提供了上述中藥組合物在制備抑制破骨細胞分化的藥物或保健品中的用途。

本發(fā)明各個方面的細節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過下文以及權(quán)利要求的描述，本發(fā)明的特點、目的和優(yōu)勢將更為明顯。

附圖說明

圖1本發(fā)明的藥物組合物ydw11抗乳腺癌研究

圖1a顯示ydw11對正常乳腺上皮細胞10a1體外增殖無影響(n＝3)；

圖1b顯示ydw11呈劑量和時間依賴性抑制mda-mb-231的體外增殖(n＝3)；

圖1c顯示ydw11呈劑量和時間依賴性抑制hs578t的體外增殖(n＝3)；

圖1d顯示ydw11呈劑量和時間依賴性抑制bt549的體外增殖(n＝3)；

圖2本發(fā)明的中藥組合物ydw11對mda-mb-231中p21表達影響

圖2a顯示ydw11抑制mda-mb-231中p21的基因表達(n＝2)；

圖2b顯示ydw11抑制mda-mb-231中p21的蛋白表達的wb條帶圖；

圖2c顯示ydw11抑制mda-mb-231中p21的蛋白表達(n＝3)；

圖3本發(fā)明的中藥組合物ydw11抗炎活性研究

圖3a顯示ydw11對靜息態(tài)巨噬細胞m0活力無影響(n＝3)；

圖3b顯示ydw11對細胞上清液中亞硝酸鹽含量的影響(n＝3)；

圖4本發(fā)明的中藥組合物ydw11抗炎機制研究

圖4a顯示ydw11抑制巨噬細胞炎癥模型中inos致炎基因的表達(n＝3)；

圖4b顯示ydw11抑制巨噬細胞炎癥模型中il-1β致炎基因的表達(n＝2)；

圖4c顯示ydw11抑制巨噬細胞炎癥模型中ho-1抗炎基因的表達(n＝2)；

圖5本發(fā)明的中藥組合物ydw11抗炎機制研究

圖5a顯示ydw11對巨噬細胞炎癥模型中inos，ho-1，ppar-γ蛋白表達的wb條帶圖；

圖5b顯示ydw11抑制巨噬細胞炎癥模型中inos的蛋白表達(n＝3)；

圖5c顯示ydw11提高巨噬細胞炎癥模型中ho-1的蛋白表達(n＝3)；

圖5d顯示ydw11提高巨噬細胞炎癥模型中ppar-γ的蛋白表達(n＝2)；

圖6本發(fā)明的中藥組合物ydw11抗炎機制研究

圖6a顯示ydw11對巨噬細胞炎癥模型中jnk/mapk信號通路的wb條帶圖；

圖6b顯示ydw11抑制巨噬細胞中jnk/mapk信號通路即抑制jnk磷酸化(n＝2)；

圖6c顯示ydw11對巨噬細胞炎癥模型中p38/mapk信號通路的wb條帶圖；

圖6d顯示ydw11對巨噬細胞中p38/mapk信號通路無影響(n＝3)；

圖6e顯示ydw11對巨噬細胞炎癥模型中erk/mapk信號通路的wb條帶圖；

圖6f顯示ydw11對巨噬細胞中erk/mapk信號通路無影響(n＝3)；

圖7本發(fā)明的中藥組合物ydw11抑制巨噬細胞炎癥模型中mir155表達(n＝2)

圖8本發(fā)明的中藥組合物ydw11抑制腫瘤相關(guān)巨噬細胞活性研究

圖8a顯示m2型巨噬細胞促乳腺癌4t1細胞的體外遷移及ydw11干預(yù)的細胞遷移圖；

圖8b顯示m2型巨噬細胞促乳腺癌4t1細胞的體外遷移及ydw11干預(yù)的影響；

圖9本發(fā)明的中藥組合物ydw11抑制腫瘤相關(guān)巨噬細胞機制研究

圖9a顯示ydw11對m2型巨噬細胞中arg-1蛋白表達的wb條帶圖；

圖9b顯示ydw11對m2型巨噬細胞中arg-1蛋白表達的影響(n＝3)；

圖10本發(fā)明的中藥組合物ydw11抑制破骨細胞分化活性研究

圖10a顯示ydw11抑制srnakl誘導(dǎo)鼠源巨噬細胞raw264.7分化為破骨細胞；

圖10b顯示ydw11抑破骨細胞分化(n＝2)；

圖11本發(fā)明的中藥組合物ydw11抑制細胞內(nèi)抗酒石酸酸性磷酸酯酶的活性(n＝2)

圖12qrt-pcr考察本發(fā)明的中藥組合物ydw11對細胞內(nèi)trap、dc-stamp、nfatc1基因表達的影響

圖12a顯示ydw11抑制細胞內(nèi)trap的基因表達(n＝2)；

圖12b顯示ydw11抑制細胞內(nèi)dc-stamp的基因表達(n＝2)；

圖12c顯示ydw11抑制細胞內(nèi)nfatc1的基因表達(n＝2)；

圖13westernblot法檢測本發(fā)明的中藥組合物ydw11對細胞內(nèi)rank、traf6、nfatc1、cathepsink蛋白表達的影響

圖13a顯示ydw11對破骨細胞分化過程中關(guān)鍵蛋白的影響wb條帶圖；

圖13b顯示ydw11抑制破骨細胞分化過程中關(guān)鍵蛋白rank的表達(n＝2)；

圖13c顯示ydw11抑制破骨細胞分化過程中關(guān)鍵蛋白traf6的表達(n＝2)；

圖13d顯示ydw11抑制破骨細胞分化過程中關(guān)鍵蛋白nfatc1的表達(n＝3)；

圖13e顯示ydw11抑制破骨細胞分化過程中關(guān)鍵蛋白cathepsink的表達(n＝2)。

具體實施方式

本發(fā)明的問世部分是基于這樣一個意外發(fā)現(xiàn)：白花蛇舌草和半枝蓮以1：1配比進行水煎提取，經(jīng)石油醚脫脂后，用乙酸乙酯萃取獲得的提取物可抗乳腺癌、抗骨質(zhì)疏松、抗炎和抑制腫瘤相關(guān)巨噬細胞活性。

本發(fā)明中藥組合物的制備過程為將白花蛇舌草和半枝蓮打粉，用水多次煎煮后合并提取液，濃縮為浸膏。將所得浸膏經(jīng)石油醚脫脂后，用乙酸乙酯萃取獲得。

隨后的藥效實驗將證明，本發(fā)明的中藥組合物可替代化療藥物防治乳腺癌、骨質(zhì)疏松、炎癥和抑制腫瘤相關(guān)巨噬細胞活性。

本發(fā)明中藥組合物是藥食兼用的純天然的植物提取物，其同時對乳腺癌細胞增殖、腫瘤免疫應(yīng)答細胞活性、破骨細胞分化和炎癥發(fā)揮作用。

本發(fā)明的中藥組合物可以單獨使用或以藥物制劑的形式使用。藥物制劑包括作為本發(fā)明的中藥組合物及可藥用載體?！翱伤幱幂d體”不會破壞本發(fā)明的白花蛇舌草和半枝蓮或其提取物的藥學(xué)活性，同時其有效用量，即能發(fā)揮藥物載體作用時的用量對人體無害。

所述可藥用載體包括但不限于：軟磷脂、硬脂酸鋁、氧化鋁、離子交換材料、自乳化藥物傳遞系統(tǒng)、吐溫或其他表面活化劑、血清蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅酸鎂、飽和脂肪酸部分甘油酯混合物等。

其他常用的藥物輔料如粘合劑(如微晶纖維素)、填充劑(如淀粉、葡萄糖、無水乳糖和乳糖珠粒)、崩解劑(如交聯(lián)pvp、交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素)、潤滑劑(如硬脂酸鎂)以及吸收促進劑、吸附載體、香味劑、甜味劑、賦形劑、稀釋劑、潤濕劑等。

本發(fā)明的中藥組合物及其藥物制劑可按本領(lǐng)域常規(guī)方法制備并可以通過腸道或非腸道或局部途徑給藥?？诜苿┌z囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等；非腸道給藥制劑包括注射液等；局部給藥制劑包括霜劑、貼劑、軟膏劑、噴霧劑等。優(yōu)選為口服制劑。

本發(fā)明的中藥組合物以及其藥物制劑的給藥途徑可以為口服、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)肌肉或皮下、皮膚粘膜、靜脈、尿道、陰道等。

除了制成藥劑之外，亦可在本發(fā)明的中藥組合物中加入抗氧化劑、色素、酶制劑等各種食品添加劑，按本領(lǐng)域的常規(guī)方法制成保健食品。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數(shù)、比率、比例、或份數(shù)按重量計。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本專利說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。

實施例1本發(fā)明的中藥組合物(ydw11)的制備實施例

取白花蛇舌草500克和半枝蓮500克(以1:1重量比配伍)，粉碎，用水煎煮4次后合并提取液，濃縮得浸膏189.68克，將所得浸膏用純水溶解，經(jīng)等體積石油醚萃取6次進行脫脂，水相濃縮經(jīng)冷凍干燥至恒重為134.6克，將脫脂后水提取物用純水溶解，用乙酸乙酯萃取6次，得提取液，經(jīng)濃縮干燥得提取物0.28克(ydw11)

實施例2本發(fā)明的中藥組合物(ydw11)抗乳腺癌的實驗研究

2.1.mtt法考察ydw11對人正常乳腺上皮細胞10a1、人乳腺癌細胞株mda-mb-231、bt549、hs578t體外增殖活力的影響

10a1和mda-mb-231細胞分別以5000/100μl種于96孔板中，bt549以2500/100μl種于96孔板中，hs578t以2000/100μl種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。ydw11以25，50μg·ml^-1劑量處理細胞，分別處理24h，48h，72h后，每孔加入mtt(用pbs溶解為5mg·ml^-1)10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清，加入dmso100μl后置于搖床上至結(jié)晶完全溶解，讀取490nm下的吸光度值a，計算ydw11各劑量處理組對細胞活力的影響。各組設(shè)3個復(fù)孔，獨立實驗重復(fù)3次。以對照組為100％，計算ydw11各劑量對不同細胞活力的影響。

實驗結(jié)果表明：ydw11在25-50μg/ml呈時間和劑量依賴性顯著抑制mda-mb-231(圖1b，表2)、hs578t(圖1c，表3)和bt549(圖1d，表4)的體外增殖，而該劑量對正常乳腺上皮細胞10a1體外增殖無明顯影響(圖1a，表1)。

表1

注：與對照組比較比較**p<0.01，*p<0.05

表2

注：與對照組比較比較**p<0.01，*p<0.05

表3

注：與對照組比較比較**p<0.01，*p<0.05

表4

注：與對照組比較比較**p<0.01，*p<0.05

2.2.qrt-pcr考察ydw11對mda-mb-231中p21基因表達影響

mda-mb-231細胞以1×10⁵/孔種于六孔板中，貼壁生長過夜后，無血清處理24h，ydw11以25，50μg·ml^-1劑量處理細胞，收取給藥處理24h的rna樣品。trizol法提取rna，并測定od260與od280，計算其od260與od280比值檢測rna純度后，計算rna濃度，并調(diào)整濃度至500ng·μl^-1。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)為cdna模板后，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。引物序列如下：

p21forward:5’-tgagccgcgactgtgatg-3’(seqidno.1)，

reverse:5’-gtctcggtgacaaagtcgaagtt-3’(seqidno.2)。

實驗結(jié)果表明：ydw11顯著提升mda-mb-231中p21基因表達(圖2a，表5)。

表5

注：與對照組比較比較，^**p<0.01，^*p<0.05

2.3.westernblotting法檢測ydw11對mda-mb-231中p21蛋白表達的影響

mda-mb-231細胞以1×10⁵/孔種于六孔板中，貼壁生長過夜后，無血清處理24h，ydw11以25，50μg·ml^-1劑量處理細胞，收取給藥處理24h的蛋白樣品。以100w功率超聲3次，每次3s，超聲后在提前預(yù)冷至4℃的低溫高速離心機中4℃，12000rpm/min離心15min，取上清，用bca蛋白測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。每孔上樣30μg蛋白在sds-page凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜后用5％牛奶封閉，檢測p21蛋白表達。獨立實驗重復(fù)3次。

實驗結(jié)果表明：ydw11顯著提升mda-mb-231中p21蛋白表達(圖2b；圖2c，表6)。

表6

注：與對照組比較比較，^**p<0.01，^*p<0.05

2.4.小結(jié)：ydw11通過上調(diào)p21的表達阻滯細胞周期而影響乳腺癌細胞增殖。

實施例3本發(fā)明的中藥組合物ydw11抗炎及其機制的研究

3.1.mtt法考察ydw11對巨噬細胞的細胞活力的影響

鼠源巨噬細胞raw264.7細胞以1×10⁴/100μl接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。ydw11以25，50μg/ml劑量處理細胞。刺激處理24h后，每孔加入mtt(用pbs溶解為5mg·ml^-1)10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清，加入dmso100μl后置于搖床上至結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀讀取490nm下的吸光度值a，計算ydw11各劑量處理組對細胞活力的影響。各組設(shè)3個復(fù)孔，獨立實驗重復(fù)3次。以對照組為100％，計算ydw11各劑量對細胞活力的影響。

實驗結(jié)果表明：ydw11在25～50μg·ml^-1劑量對處于靜息態(tài)的m0細胞無影響(圖3a，表7)。

表7

注：給藥組與空白對照組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

3.2.griess反應(yīng)法檢測細胞上清液中亞硝酸鹽含量的變化

raw264.7細胞培養(yǎng)于30mm的培養(yǎng)皿中，貼壁生長過夜后，無血清處理24h，對照組采用無血清的rmpi1640培養(yǎng)細胞，模型組采用lps和ifn-γ(終濃度分別為100μg·l^－1和1×10⁴u·l^－1)協(xié)同刺激細胞，ydw11分別以10，50，100，200μg/ml劑量處理細胞。培養(yǎng)24h后，吸取上清100μl至96孔板中，加入等量的griess反應(yīng)試劑，反應(yīng)10min，在540nm下讀數(shù)。計算ydw11對細胞上清中亞硝酸鹽抑制率及ic50。各組設(shè)3個復(fù)孔，獨立實驗重復(fù)3次。

抑制率＝(a模型組-a給藥組)/(a模型組-a對照組)×100％。

實驗結(jié)果表明：ydw11可以顯著抑制細胞上清中亞硝酸鹽的含量，其ic50約為27.74μg·ml^-1。(圖3b，表8)

表8

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

3.3.qrt-pcr考察ydw11對細胞內(nèi)inos、il-1β、ho-1基因表達的影響

raw264.7細胞培養(yǎng)于30mm的培養(yǎng)皿中，分別設(shè)置對照組、模型組、ydw11組(25、50μg·ml^-1)，貼壁生長過夜后，無血清處理24h，用ydw11預(yù)處理24h后，加入lps和ifn-γ(終濃度分別為100μg·l^－1和1×10⁴u·l^－1)，收取誘導(dǎo)劑刺激4h和24h后各組的rna樣品，trizol法提取rna，根據(jù)樣品的吸光度值計算rna濃度，并調(diào)整rna濃度至500ng·μl^-1。按rt試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)成cdna樣品后根據(jù)pcr試劑盒說明書進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。引物序列如下：

inosforward:5’-ggagcgagttgtggattgtc-3’(seqidno.3)，

reverse:5’-gtgagggcttggctgagtgag-3’(seqidno.4)；

il-1βforward:5’-tgggaaacaacagtggtcagg-3’(seqidno.5)，

reverse:5’-ctgctcattcacgaaaaggga-3’(seqidno.6)；

ho-1forward:5’-cacagatggcgtcacttcgtc-3’(seqidno.7)，

reverse:5’-gtgaggacccactggaggag-3’(seqidno.8)；

gapdhforward:5’-aacggatttggtcgtattggg-3’(seqidno.9)，

reverse:5’-caggggtgctaagcagttgg(seqidno.10)。

獨立實驗重復(fù)3次。

實驗結(jié)果表明：ydw11下調(diào)m1炎癥模型中致炎基因inos(圖4a，表9)、il-1β的基因(圖4b，表10)表達，上調(diào)抗炎基因ho-1的基因表達(圖4c，表11)。

表9

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

表10

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

表11

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

3.4.westernblot法檢測ydw11對inos、ho-1、ppar-γ蛋白表達的影響

raw264.7細胞培養(yǎng)于30mm的培養(yǎng)皿中，分別設(shè)置對照組、模型組、ydw11組(25、50μg·ml^-1)，貼壁生長過夜后，無血清處理24h，用ydw11預(yù)處理1h后，加入lps和ifn-γ(終濃度分別為100μg·l^－1和1×10⁴u·l^－1)，收取誘導(dǎo)劑分別刺激6h和24h的蛋白樣品。功率100w，超聲3次，每次超聲3s，間歇2s，超聲后在提前預(yù)冷至4℃的低溫高速離心機中4℃，12000rpm/min離心15min，取上清，用bca蛋白測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。每孔上樣15μg蛋白在sds-page凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜后用5％牛奶封閉，6h的樣品檢測inos和ppar-γ蛋白表達，24h樣品檢測ho-1蛋白表達。獨立實驗重復(fù)3次。

實驗結(jié)果表明：ydw11下調(diào)巨噬細胞炎癥模型中inos蛋白表達(圖5a；圖5b，表12)，上調(diào)ho-1(圖5c，表13)和ppar-γ(圖5d，表14)蛋白表達。

表12

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

表13

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

表14

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

3.5.westernblot法檢測ydw11對mapk信號通路的影響

raw264.7細胞培養(yǎng)于30mm的培養(yǎng)皿中，分別設(shè)置對照組、模型組、ydw11組(25、50μg·ml^-1)，貼壁生長過夜后，無血清處理24h，用ydw11預(yù)處理1h后，加入lps和ifn-γ(終濃度分別為100μg·l^－1和1×10⁴u·l^－1)，收取誘導(dǎo)劑刺激30min的蛋白樣品。功率100w，超聲3次，每次超聲3s，間歇2s，超聲后在提前預(yù)冷至4℃的低溫高速離心機中4℃，12000rpm/min離心15min，取上清，用bca蛋白測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。每孔上樣15μg蛋白在sds-page凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜后用5％牛奶封閉，檢測mapk信號通路中t-erk、p-erk、t-jnk、p-jnk、t-p38、p-p38蛋白表達。獨立實驗重復(fù)3次。

實驗結(jié)果表明：ydw11劑量依賴性抑制jnk的磷酸化(圖6a；6b，表15)，而對p38(圖6c；6d，表16)和erk(圖6e；6f，表17)的磷酸化沒有明顯影響。

表15

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

表16

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

表17

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

3.6.taqmanmicrornart-pcr法檢測ydw11對mir155表達的影響

raw264.7細胞培養(yǎng)于30mm的培養(yǎng)皿中，分別設(shè)置對照組、模型組、ydw11組(25、50μg·ml^-1)，貼壁生長過夜后，無血清處理24h，用ydw11預(yù)處理24h后，加入lps和ifn-γ(終濃度分別為100μg·l^－1和1×10⁴u·l^－1)，收取誘導(dǎo)劑刺激24h各組的rna樣品。采用trizol法提取總rna，根據(jù)taqmansmallrna試劑盒說明書，各樣品取10ng總rna逆轉(zhuǎn)成cdna后進行qpcr反應(yīng)，檢測各樣品中mir155表達情況。獨立實驗重復(fù)3次。

實驗結(jié)果表明：ydw11劑量依賴性抑制mir155表達(圖7，表18)。

表18

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

3.7.小結(jié)：ydw11在巨噬細胞炎癥模型中發(fā)揮抗炎作用一方面是通過抑制mapk中jnk通路的磷酸化和mir155的表達來下調(diào)炎癥因子inos的基因和蛋白表達，另一方面則通過上調(diào)抗炎因子ho-1和ppar-γ的表達來發(fā)揮作用。

實施例4.本發(fā)明的中藥組合物ydw11抑制腫瘤相關(guān)巨噬細胞活性及機制研究

4.1.trans-well小室遷移法考察m2型巨噬細胞對鼠源乳腺癌細胞4t1細胞的遷移力變化及ydw11干預(yù)的影響

raw264.7細胞在10％fbs1640條件下以1*10⁶/孔培養(yǎng)于24孔板中，分別設(shè)置對照組、模型組、ydw11組(25、50μg·ml^-1)，貼壁生長過夜，在無血清條件下加藥預(yù)處理24h后，對照組采用無血清的rmpi1640培養(yǎng)細胞，模型組和ydw11組采用il-4和il-13(終濃度均為20ng·ml^-1)協(xié)同刺激細胞，同時ydw11組以25，50μg·ml^-1劑量藥物處理細胞，24h后，收集細胞培養(yǎng)上清，取600μl置于24孔板下室后放入trans-well小室，在trans-well小室上室加入無血清培養(yǎng)基調(diào)整的細胞密度為5*10⁵/ml的4t1細胞，體積均為100μl，遷移24h。24h后，取出trans-well小室，以4％多聚甲醛固定30min，0.5％結(jié)晶紫染色30min，自來水漂洗后用棉簽輕輕拭去trans-well小室上層未遷移的細胞。400倍鏡下隨機5個視野觀察細胞并計數(shù)。

實驗結(jié)果表明：yd顯著抑制m2巨噬細胞促進乳腺癌4t1細胞的遷移加劇(圖8a；8b，表19)。

表19

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較^**p<0.01，^*p<0.05

4.2.westernblot法檢測ydw11對m2型巨噬細胞中arg-1蛋白表達的影響

raw264.7細胞在10％fbs1640條件下以1*10⁶/皿培養(yǎng)于30mm培養(yǎng)皿中，分別設(shè)置對照組、模型組、ydw11組(25、50μg·ml^-1)，貼壁生長過夜，在無血清條件下加藥預(yù)處理24h后，對照組采用無血清的rmpi1640培養(yǎng)細胞，模型組和ydw11組采用il-4和il-13(終濃度均為20ng·ml^-1)協(xié)同刺激細胞，同時ydw11組以25，50μg·ml^-1劑量藥物處理細胞，48h后收集蛋白。功率100w，超聲3次，每次超聲3s，間歇2s，超聲后在提前預(yù)冷至4℃的低溫高速離心機中4℃，12000rpm/min離心15min，取上清，用bca蛋白測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。每孔上樣20μg蛋白在sds-page凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜后用5％牛奶封閉，檢測arg-1蛋白表達。獨立實驗重復(fù)3次。

實驗結(jié)果表明：ydw11劑量依賴性抑制m2型巨噬細胞中arg-1蛋白表達(圖9a；9b，表20)。

表20

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

4.3.小結(jié)：ydw11抑制m2促進乳腺癌細胞4t1的體外遷移加劇，部分通過抑制腫瘤相關(guān)巨噬細胞m2型中精氨酸酶1表達而達到的。

實施例5.本發(fā)明的中藥組合物ydw11抑制破骨細胞分化及其機制研究

5.1.trap染色考察ydw11對srnakl誘導(dǎo)鼠源巨噬細胞raw264.7分化為破骨細胞(ms)的影響

raw264.7細胞在10％fbs1640條件下以10000/孔培養(yǎng)于24孔板中，分別設(shè)置對照組、模型組(ms)、ydw11組(25、50μg·ml^-1)，貼壁生長過夜，第2天在10％fbs1640條件下加藥物預(yù)處理24h，第3天在10％fbs1640條件加入誘導(dǎo)劑srnakl(終濃度為100ng/ml)并加藥物處理，隔天換液并加誘導(dǎo)劑srnakl和藥物，srnakl誘導(dǎo)處理7天后根據(jù)抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色試劑盒說明書進行trap染色。200倍鏡下隨機5個視野觀察細胞分化情況，具有3個及以上細胞核的多核細胞認定為破骨樣細胞，進行多核細胞計數(shù)，并進行典型的破骨樣細胞圖像采集。獨立實驗重復(fù)3次。

實驗結(jié)果表明：ydw11呈劑量依賴性抑制trap陽性細胞的數(shù)量，抑制破骨細胞分化(圖10a；10b，表21)。

表21

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

5.2.抗酒石酸酸性磷酸酶檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)抗酒石酸酸性磷酸酯酶(trap)活性

raw264.7細胞在10％fbs1640條件下以10000/孔培養(yǎng)于24孔板中，分別設(shè)置對照組、模型組(ms)、ydw11組(25、50μg·ml^-1)，貼壁生長過夜，第2天在10％fbs1640條件下加藥物預(yù)處理24h，第3天在10％fbs1640條件加入誘導(dǎo)劑srnakl(終濃度為100ng/ml)并加藥物處理，隔天換液并加誘導(dǎo)劑srnakl和藥物，srnakl誘導(dǎo)處理7天后，棄去上清，pbs洗一遍后每孔分別加入100μlpbs，刮取細胞并收集細胞懸液，以150w功率超聲3次，每次超聲3s，間歇2s，超聲后在提前預(yù)冷至4℃的低溫高速離心機中4℃，12000rpm/min離心15min，取上清，根據(jù)抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒說明書檢測樣品中的抗酒石酸酸性磷酸酯酶的活性，同時采用bca蛋白測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。獨立實驗重復(fù)3次。

實驗結(jié)果表明：ydw11抑制破骨細胞中抗酒石酸酸性磷酸磷酸酯酶活性(圖11，表22)。

表22

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

5.3.qrt-pcr考察ydw11對細胞內(nèi)trap、dc-stamp、nfatc1基因表達的影響

raw264.7細胞在10％fbs1640條件下以10000/孔培養(yǎng)于24孔板中，分別設(shè)置對照組、模型組(ms)、ydw11組(25、50μg·ml^-1)，貼壁生長過夜，第2天在10％fbs1640條件下加藥物預(yù)處理24h，第3天在10％fbs1640條件加入誘導(dǎo)劑srnakl(終濃度為100ng/ml)并加藥物處理，隔天換液并加誘導(dǎo)劑srnakl和藥物，srnakl誘導(dǎo)處理7天后，收集rna樣品，trizol法提取rna，根據(jù)樣品的吸光度值計算rna濃度，并調(diào)整rna濃度至500ng·μl^-1。按rt試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)成cdna樣品后根據(jù)pcr試劑盒說明書進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。引物序列如下：

trapforward:5’-tgacaagaggttccagga-3’(seqidno.11)，

reverse:5’-agccaggacagctgagtg-3’(seqidno.12)；

dc-stampforward:5’-ctgtgttactgagggctctttg-3’(seqidno.13)，

reverse:5’-cagagaagtcttccaggatctc-3’(seqidno.14)；

nfatc1forward:5’-gtctctttccccgacatcat-3’(seqidno.15)，

reverse:5’-tctccaagtaaccgtgtagc-3’(seqidno.16)。

實驗結(jié)果表明：ydw11下調(diào)細胞內(nèi)trap(圖12a，表23)、dc-stamp(圖12b，表24)、nfatc1(圖12c，表25)基因表達。

表23

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

表24

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

表25

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

5.4.westernblot法檢測ydw11對細胞內(nèi)rank、traf6、nfatc1、cathepsink蛋白表達的影響。

raw264.7細胞在10％fbs1640條件下以10000/孔培養(yǎng)于24孔板中，分別設(shè)置對照組、模型組(ms)、ydw11組(25、50μg·ml^-1)，貼壁生長過夜，第2天在10％fbs1640條件下加藥物預(yù)處理24h，第3天在10％fbs1640條件加入誘導(dǎo)劑srnakl(終濃度為100ng/ml)并加藥物處理，隔天換液并加誘導(dǎo)劑srnakl和藥物，srnakl誘導(dǎo)處理7天后，收集蛋白樣品。功率100w，超聲3次，每次超聲3s，間歇2s，超聲后在提前預(yù)冷至4℃的低溫高速離心機中4℃，12000rpm/min離心15min，取上清，用bca蛋白測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。每孔上樣30μg蛋白在sds-page凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜后用5％牛奶封閉，檢測rank、traf6、nfatc1、cathepsink蛋白表達。獨立實驗重復(fù)3次。

實驗結(jié)果表明：ydw11下調(diào)細胞內(nèi)rank(圖13a；13b，表26)、traf6(圖13c，表27)、nfatc1(圖13d，表28)、cathepsink(圖13e)蛋白的表達。

表26

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

表27

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

表28

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

表29

注：與對照組比較，^##p<0.01，^#p<0.05；與模型組比較，^**p<0.01，^*p<0.05

5.5.小結(jié)：ydw11呈劑量依賴性抑制trap陽性細胞的數(shù)量，抑制破骨細胞特異酶trap的活性及其基因的表達，抑制破骨細胞的分化中關(guān)鍵蛋白rank、traf6、nfatc1和cathepsink蛋白的表達。

實驗總結(jié)：

1.白花蛇舌草半枝蓮等比配伍水提取物的乙酸乙酯組分(ydw11)在25-50μg·ml^-1對正常乳腺上皮細胞沒有毒性，具有抑制三陰性乳腺癌細胞(mda-mb-231、hs578t、bt549)體外增殖的活性。

2.基于脂多糖(lps)和干擾素γ(ifn-γ)聯(lián)合誘導(dǎo)鼠源巨噬細胞raw264.7為炎癥模型，ydw11具有抗炎活性。

3.基于白介素4(il-4)和白介素13(il-13)聯(lián)合誘導(dǎo)鼠源巨噬細胞raw264.7為腫瘤相關(guān)巨噬細胞模型，ydw11可抑制腫瘤相關(guān)巨噬細胞協(xié)助乳腺癌體外轉(zhuǎn)移的活性，有提高免疫的功能。

4.基于細胞因子srnakl誘導(dǎo)鼠源巨噬細胞raw264.7為破骨細胞分化模型(ms)，ydw11抑制破骨細胞分化，具有抗骨質(zhì)疏松、抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的活性。

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<120>一種中藥組合物及其用途

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