本發(fā)明涉及一種生脈飲通過微生態(tài)研究方法制備的中藥復(fù)方組合物及其制備方法，以及該組合物在輔助治療病毒性心肌炎方面的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生脈飲由古方“參脈散”衍生而來。“參脈散”出自元代名醫(yī)李東垣所著的《內(nèi)外傷辨惑論》，由人參、麥冬、五味子三味藥組成。方中人參大補(bǔ)元?dú)?，麥冬養(yǎng)陰生津，五味子斂汗生津，三藥合用，共同發(fā)揮益氣生津、斂陰止汗的作用，適于氣陰兩虧、心悸氣短、脈微自汗等證。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥理作用研究表明（周軍.生脈飲注射液治療氣陰兩虛型冠心病心絞痛60例）：生脈飲處方中的人參能改善心肌的代謝，增加心肌能量儲(chǔ)備，促進(jìn)dna和rna的合成，提高機(jī)體耐缺氧能力，從而增強(qiáng)心肌收縮力，擴(kuò)張外周血管。人參還可以抑制na+-k+-atp酶的活性，影響na+-k+和na+-ca2+交換，使ca2+內(nèi)流增加，從而增加心肌收縮力，降低血管阻力，還可清除自由基，增加心肌抗缺氧能力，并兼有抗心律失常作用。麥冬可穩(wěn)定細(xì)胞膜，能夠提高機(jī)體的耐缺氧能力；擴(kuò)張周圍血管，減輕心臟負(fù)荷，具有正性肌力的作用。五味子能增強(qiáng)機(jī)體對各種刺激的非特異性抵抗能力。生脈飲主要藥理作用為抗缺氧，保護(hù)心肌細(xì)胞，同時(shí)能擴(kuò)張血管，降低血小板粘附率，故對改善受損心肌的微循環(huán)，增加心臟供血，心肌細(xì)胞的恢復(fù)，有很大的促進(jìn)作用，且沒有毒副作用，值得臨床推廣應(yīng)用。
2015年版《中國藥典》中生脈飲的制備方法為：人參100g、麥冬200g、五味子100g，以上三味藥，粉碎成粗粉，用65%乙醇作溶劑，浸漬24小時(shí)后進(jìn)行滲漉，收集滲漉液約4500ml．減壓濃縮至約250ml，放冷，加水400ml稀釋，濾過，另加60%糖漿300ml及適置防腐劑，并調(diào)節(jié)ph值至規(guī)定范圍，加水至1000ml．?dāng)噭?，靜置，濾過，灌封，滅菌，即得。此方法需用大量酒精提取并回收乙醇濃縮，操作繁瑣。且由于口感不佳，需加入大量的糖漿調(diào)口感，而現(xiàn)有的生脈飲主要用于具有高脂血癥、糖尿病和冠心病等慢性病的患者，這類患者本身的糖代謝和脂質(zhì)代謝就有一定障礙，且需長期服藥治療，由此可見長期服用這種含糖量高的生脈飲不利于患者健康的恢復(fù)。有專利（專利號：cn201510353909.x）制備了無糖型生脈飲口服液，但其制備方法也是傳統(tǒng)的醇提方法，操作繁瑣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
腸道菌群被喻為人體的“微生物器官”，參與、輔助宿主能量代謝，調(diào)節(jié)先天與獲得性免疫，構(gòu)成人體腸道的生物學(xué)屏障。研究表明，腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂不僅與消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、腫瘤等疾病有關(guān)，而且與心血管疾病的發(fā)生相關(guān)，腸道菌群可能通過參與調(diào)節(jié)宿主膽固醇代謝、氧化應(yīng)激和炎癥導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，從而促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。
為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種制備方法簡單，口感適中，狀態(tài)佳，吸收快，安全高效的生脈飲組合物。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生脈飲組合物，該組合物由復(fù)方生脈飲藥粉帶渣提取液經(jīng)復(fù)合腸道益生菌發(fā)酵后制得。采用的技術(shù)方案為：
將中藥復(fù)方生脈飲藥粉混合水浸后加熱，高溫淀粉酶酶解后加入不同配比的營養(yǎng)物、無機(jī)鹽，調(diào)節(jié)ph值，高溫高壓滅菌，接入腸道益生菌帶渣發(fā)酵完成后加熱煮沸，離心，離心液中加入?；撬岷偷途酃菨{，穩(wěn)定化處理即得；
所述的中藥復(fù)方由以下重量份的中藥成分組成：人參60～180份、麥冬120～240份、五味子40～120份；
所述的營養(yǎng)物為葡萄糖、蛋白胨、酵母膏和酵母粉；
所述的腸道益生菌為雙歧桿菌和/或乳桿菌。
優(yōu)選的，所述的中藥復(fù)方由以下重量份的中藥成分組成：人參100份、麥冬200份、五味子100份。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的生脈飲組合物的制備方法，步驟如下：
1）將人參粉碎，過80-100目篩，麥冬冷凍后粉碎過40～65目篩，五味子粉碎過20～40目篩，按處方量稱取各藥粉混合，加入8～20倍量的水浸泡0.5～1.5小時(shí)，得藥粉浸泡液，加熱浸泡液至85～90℃；調(diào)節(jié)ph值至5.5～6.5，加入高溫淀粉酶，保持溫度在85～90℃，酶解10min，得中藥酶解液；
2）向上述中藥酶解液中加入營養(yǎng)物葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、酵母粉及無機(jī)鹽，使溶解并攪拌均勻，調(diào)節(jié)ph值至7.0，于115℃高溫高壓滅菌1小時(shí)，得無菌中藥提取物；
3）當(dāng)上述無菌中藥提取物溫度降至38℃時(shí)，接種預(yù)培養(yǎng)的各體積百分比為0.5%～2.0%的一種或兩種及以上雙歧桿菌菌液和/或一種或兩種及以上的乳桿菌菌液，37℃培養(yǎng)1～3天，當(dāng)ph值降至4.0～4.1，室溫下放置5～7天，得發(fā)酵液；
4）將上述發(fā)酵液加熱煮沸并保持微沸10分鐘后，離心，得發(fā)酵上清液，加入?；撬?，低聚果糖漿，攪勻后過濾，定容，于115℃高溫高壓滅菌40min，即得。
上述制備方法中，所述的雙歧桿菌選自短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌或嬰兒雙歧桿菌；所述的乳桿菌選自德氏乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌。
上述制備方法中，所述葡萄糖的加入量為0.50g/100ml，所述酵母膏的加入量為0.10g/100ml，所述酵母粉的加入量為0.05g/100ml，所述蛋白胨的加入量為0.20g/100ml。
上述制備方法中，所述的無機(jī)鹽為k2hpo4?3h2o0.10g/100ml、kh2po40.10g/100ml、硫酸亞鐵?7h2o5.0mg/100ml、硫酸鋅?7h2o4.4mg/100ml、硫酸鎂?7h2o70mg/100ml、亞硒酸鈉?5h2o24μg/100ml。
上述制備方法中，所述的?；撬峒尤肓繛?.01～0.05g/100ml，低聚果糖漿加入量為0～0.7g/100ml。
上述制備方法中，為了改善口感，在制備方法步驟2）中的調(diào)節(jié)ph值前或步驟4）中的定容前還加入了甜味劑，所述甜味劑為0～0.02g/100ml的三氯蔗糖。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述的生脈飲組合物在制備輔助治療抗病毒性心肌炎產(chǎn)品中的應(yīng)用。
可在生脈飲組合物中添加一種或多種具有相同、相似或不同生物學(xué)活性，并對基本活性成分表現(xiàn)有輔助或協(xié)同作用，但彼此間又互不拮抗的天然或合成的其他藥物成份或其混合物，配制成適于口服給藥的液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如合劑、乳劑、糖漿等；或:
將所述的生脈飲組合物通過適當(dāng)?shù)母稍锓椒?，制得固體粉末，添加一種或多種具有相同、相似或不同生物學(xué)活性，并對基本活性成分表現(xiàn)有輔助或協(xié)同作用，但彼此間又互不拮抗的天然或合成的其他藥物成份或其混合物，配制成適于口服給藥的膠囊、片劑、顆粒劑等固體劑型的藥物。
?；撬嵩谛呐K中的含量較為豐富，約占心臟全部游離氨基酸的一半以上，因而它對心臟的作用較為廣泛，且外源的補(bǔ)充之，可對抗心臟的多種病理狀態(tài)。?；撬嶙鳛橐粋€(gè)廣譜的細(xì)胞保護(hù)劑有以下功能：（1）維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡；（2）直接的膜穩(wěn)定作用；（3）鈣離子調(diào)節(jié)作用，可以調(diào)節(jié)鈣的代謝，維持正常心肌細(xì)胞的功能；（4）抗脂質(zhì)過氧化損傷，消除氧自由基；（5）調(diào)節(jié)內(nèi)皮舒張因子、內(nèi)皮素等血管活性物質(zhì)合成釋放的紊亂狀態(tài)。因此，細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)是?；撬嵩诳剐募∪毖?、抗心律失常、抗再灌注損傷、心肌保護(hù)等方面的作用基礎(chǔ)。?；撬徇€是人體腸道內(nèi)雙歧菌的促生因子，優(yōu)化腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)；還具有抗氧化、延緩衰老作用。
?；撬?tau)清除自由基作用突出。許多實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了tau能減少氧自由基的生成，使還原性谷胱甘肽(gsh)生成增加，保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。心肌損傷時(shí)，tau含量成倍增加，明顯地減輕心肌缺血再灌注損傷的程度。臨床上在小兒心臟畸形糾治術(shù)中，口服天然tau能有效地提高機(jī)體組織tau水平，預(yù)防心肌缺血損傷的效應(yīng)。心肌損傷的另一特征是細(xì)胞內(nèi)鈣超載，鈣作為第二信使，可激活胞漿內(nèi)多種效應(yīng)酶，破壞膜的完整性，使atp生成減少，并損害線粒體中atp的再生能力。tau對鈣具有雙向調(diào)節(jié)作用，在心肌高鈣時(shí)，可促進(jìn)鈣與線粒體、肌漿網(wǎng)膜等結(jié)合，減少鈣內(nèi)流和增加鈣與細(xì)胞的親合力。tau作用于心肌纖維膜，增加鈣與低親合位點(diǎn)的結(jié)合，并直接與鈉鉀泵相互作用，防止高鈣對鈉鉀atp酶的抑制作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)可交換鈣降低時(shí)，結(jié)合鈣又游離出來，增加心肌收縮力?？傊?，tau的心肌保護(hù)作用與它的抗脂質(zhì)過氧化損傷及抗心肌內(nèi)鈣的增加有關(guān)，因而影響了心肌的收縮力和細(xì)胞內(nèi)酶的漏出。
有益效果：
1、本發(fā)明的生脈飲組合物，與傳統(tǒng)方法制備的生脈飲比較，制備方法簡單，且口感酸甜，易于接受，不含大量糖漿，對于患有高脂血癥、糖尿病和冠心病等慢性病的患者也可長期服用，適用范圍更廣。
2、本發(fā)明的生脈飲組合物中的中藥藥材粉碎后帶藥渣直接通過益生菌發(fā)酵，可以充分利用中藥材中的營養(yǎng)物質(zhì)，提高了藥材的利用率。
3、本發(fā)明的生脈飲組合物通過益生菌發(fā)酵后將提取物中的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，可加快營養(yǎng)物質(zhì)在人體內(nèi)的吸收，快速發(fā)揮功效。
4、本發(fā)明的生脈飲組合物首先選用了治療心臟疾病療效顯著的生脈飲組方，保證了組合物的藥效基礎(chǔ)，同時(shí)通過益生菌發(fā)酵助力藥效的提升，最后加入益生元和?；撬幔龠M(jìn)腸道菌群的平衡，協(xié)助心臟功能的改善；共同協(xié)調(diào)改善受損心肌的微循環(huán)，消除炎癥，增加心臟供血，促進(jìn)心肌細(xì)胞的恢復(fù)。
5、本發(fā)明的生脈飲組合物與對應(yīng)的同濃度的傳統(tǒng)方法制備的生脈飲比較，清除自由基的能力顯著提高，有顯著的進(jìn)步意義。
6、本發(fā)明的制備方法制備的生脈飲組合物的輔助治療病毒性心肌炎的總有效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法制備的生脈飲，具有顯著的進(jìn)步意義。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1：生脈飲組合物a的制備
按下列處方量稱取藥材：人參600g、麥冬2400g、五味子400g。將人參粉碎，過80目；麥冬冷凍后粉碎過65目，五味子粉碎過20目。按處方量稱取各藥粉混合，加入8倍量的水浸泡1.5小時(shí)，得藥粉浸泡液，加熱浸泡液至85～90℃；調(diào)節(jié)ph值至5.5，加入高溫淀粉酶，保持溫度在85～90℃，酶解10min，得中藥酶解液；向上述中藥酶解液中加入葡萄糖50g，酵母膏10g，酵母粉5g，蛋白胨20g，k2hpo4?3h2o10g，kh2po410g，硫酸亞鐵?7h2o500mg，硫酸鋅?7h2o440mg，硫酸鎂?7h2o7g，亞硒酸鈉?5h2o2.4mg，使溶解并攪拌均勻，調(diào)節(jié)ph值至7.0，于115℃高溫高壓滅菌1小時(shí)，得無菌中藥提取物；當(dāng)上述無菌中藥提取物溫度降至38℃時(shí)，接種預(yù)培養(yǎng)的體積百分比為0.5%的短雙歧桿菌菌液和體積百分比為0.7%的德氏乳桿菌菌液，37℃培養(yǎng)2天后，測ph值降至4.07，室溫下放置7天，得發(fā)酵液；將上述發(fā)酵液加熱煮沸并保持微沸10分鐘后，離心后得發(fā)酵上清液，加入牛磺酸5g，低聚果糖漿70g，攪勻后過濾，定容至10000ml，于115℃高溫高壓滅菌40min，即得所述的生脈飲組合物a。
實(shí)施例2：生脈飲組合物b的制備
按下列處方量稱取藥材：：人參1000g、麥冬2000g、五味子1000g。將人參粉碎，過85目；麥冬冷凍后粉碎過50目，五味子粉碎過30目。按處方量稱取各藥粉混合，加入15倍量的水浸泡1小時(shí)，得藥粉浸泡液，加熱浸泡液至85～90℃；調(diào)節(jié)ph值至6.0，加入高溫淀粉酶，保持溫度在85～90℃，酶解10min，得中藥酶解液；向上述中藥酶解液中加入葡萄糖50g，酵母膏10g，酵母粉5g，蛋白胨20g，k2hpo4?3h2o10g，kh2po410g，硫酸亞鐵?7h2o500mg，硫酸鋅?7h2o440mg，硫酸鎂?7h2o7g，亞硒酸鈉?5h2o2.4mg，使溶解并攪拌均勻，調(diào)節(jié)ph值至7.0，于115℃高溫高壓滅菌1小時(shí)，得無菌中藥提取物；當(dāng)上述無菌中藥提取物溫度降至38℃時(shí)，接種預(yù)培養(yǎng)的體積百分比分別為0.5%的青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌菌液和干酪乳桿菌菌液，37℃培養(yǎng)1.5天后，測ph值降至4.09，室溫下放置6天，得發(fā)酵液；將上述發(fā)酵液加熱煮沸并保持微沸10分鐘后，離心后得發(fā)酵上清液，加入?；撬?g，低聚果糖漿50g，三氯蔗糖1g，攪勻后過濾，定容至10000ml，于115℃高溫高壓滅菌40min，即得所述的生脈飲組合物b。
實(shí)施例3：生脈飲組合物c的制備
按下列處方量稱取藥材：人參1800g、麥冬1200g、五味子1200g；將人參粉碎，過100目，麥冬冷凍后粉碎過40目，五味子粉碎過40目。按處方量稱取各藥粉混合，加入20倍量的水浸泡0.5小時(shí)，得藥粉浸泡液，加熱浸泡液至85～90℃；調(diào)節(jié)ph值至6.5，加入高溫淀粉酶，保持溫度在85～90℃，酶解10min，得中藥酶解液；向上述中藥酶解液中加入葡萄糖50g，酵母膏10g，酵母粉5g，蛋白胨20g，k2hpo4?3h2o10g，kh2po410g，硫酸亞鐵?7h2o500mg，硫酸鋅?7h2o440mg，硫酸鎂?7h2o7g，亞硒酸鈉?5h2o2.4mg，使溶解并攪拌均勻，調(diào)節(jié)ph值至7.0，于115℃高溫高壓滅菌1小時(shí)，得無菌中藥提取物；當(dāng)上述無菌中藥提取物溫度降至38℃時(shí)，接種預(yù)培養(yǎng)的體積百分比為1.0%的青春雙歧桿菌菌液和體積百分比分別為0.5%的干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌菌液，37℃培養(yǎng)1天后，測ph值降至4.05，室溫下放置5天，得發(fā)酵液；將上述發(fā)酵液加熱煮沸并保持微沸10分鐘后，離心后得發(fā)酵上清液，加入?；撬?g，低聚果糖漿30g，攪勻后過濾，定容至10000ml，于115℃高溫高壓滅菌40min，即得所述的生脈飲組合物c。
實(shí)驗(yàn)例1：生脈飲組合物清除自由基能力測定
本實(shí)驗(yàn)例通過水楊酸法測定本發(fā)明的生脈飲組合物的清除自由基的能力，來說明通過本發(fā)明的制備方法制備的生脈飲組合物與傳統(tǒng)方法制備的生脈飲在清除自由基方面的顯著性進(jìn)步。
1、試劑：
1.16mmol/lfeso4溶液：準(zhǔn)確稱取feso4·7h2o0.1668g，加水溶解，定容至100ml。
1.26mmol/lh2o2溶液：準(zhǔn)確吸取30%的h2o2溶液3.4ml，加水溶解，定容至50ml，再準(zhǔn)確吸取上述定容液1ml，加水稀釋定容至100ml。
1.36mmol/l水楊酸溶液：準(zhǔn)確稱取水楊酸0.083g，加水溶解，定容至100ml。
2、供試溶液制備：分別取實(shí)施例制備的生脈飲組合物a、b、c(以下簡稱：a、b、c)以及其對應(yīng)的用傳統(tǒng)醇提方法制備的生脈飲（以下簡稱：a1、b1、c1）離心后，取上清液，即為供試品溶液a、b、c、a1、b1、c1，備用。
3、測量比較：
依次向（按表1）試管中加入6mmol/lfeso4溶液、供試品溶液、6mmol/lh2o2溶液各1ml，搖勻，靜置10min，加6mmol/l水楊酸溶液1ml，搖勻后，靜置30ml，加水稀釋至10ml，在510nm處測吸光度。
4、自由基清除率計(jì)算公式：
清除率（%）=
5、測定結(jié)果：見表2
6、結(jié)論：從表2可以看出本發(fā)明的生脈飲組合物與對應(yīng)的同濃度的傳統(tǒng)方法制備的生脈飲比較，自由基清除率有顯著性差異，有顯著的進(jìn)步意義。
實(shí)驗(yàn)例2：本發(fā)明的生脈飲組合物輔助治療病毒性心肌炎的臨床資料研究
病毒性心肌炎是一種病毒引起的心功能障礙，對患者的心功能造成一定損害，使患者各個(gè)部位表現(xiàn)不同的癥狀，如果不及時(shí)治療，會(huì)給患者帶來生命危險(xiǎn)。對這種疾病多采用藥物治療的方法，中藥、西藥和中西醫(yī)結(jié)合治療都被用于治療此病，不同的藥物療效不同。我們于2016年1月至2017年6月對本發(fā)明的生脈飲組合物進(jìn)行了臨床觀察研究，驗(yàn)證了本發(fā)明的生脈飲組合物輔助治療病毒性心肌炎的療效和安全性。
1、輔助治療樣品
選自實(shí)施例制備的生脈飲組合物a、b、c（以下簡稱：a、b、c)及其對應(yīng)的傳統(tǒng)醇提方法制備的生脈飲（以下簡稱：a1、b1、c1）
2、病例分組
經(jīng)診斷符合病毒性心肌診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者140例，隨機(jī)分成7組，根據(jù)治療樣品分為對照組和輔助治療組（a組、b組、c組、a1組、b1組、c1組）,每組20例。各組在性別、年齡、病程和病癥等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
3、方法
對照組：進(jìn)行極化液、維生素c和心肌營養(yǎng)劑等常規(guī)治療。治療15天后觀察患者的丙酮酸激酶（pk）、乳酸脫氫酶（ldh）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（ast）、肌酸激酶（ck）、肌酸激酶同工酶（ck-mb）情況。
輔助治療組：在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，分別給與各輔助治療樣品原液，每次10ml，每天3次，一個(gè)療程為15天。治療15天后，觀察患者的pk、ldh、ast、ck、ck-mb情況。
4、療效判斷標(biāo)準(zhǔn)
治愈：患者自覺癥狀消失，心電圖、胸片、心肌酶譜恢復(fù)正常；
有效：患者有下列兩項(xiàng)以上者，自覺癥狀基本消失，心肌酶譜接近正常，心電圖基本正常，胸片顯示心胸比值恢復(fù)正常；
無效：患者自覺癥狀無緩解，心電圖、胸片、心肌酶譜與治療前比較無明顯改善。
總有效率=治愈率+有效率。
5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
本臨床資料所用數(shù)據(jù)spss22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用例（n），百分?jǐn)?shù)（%）表示，組間比較采用x2檢驗(yàn)，以p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
6、結(jié)果（見表3）
從表3可以看出，輔助治療組a組、b組、c組和c1組與對照組比較，有顯著性差異，說明生脈飲可以輔助治療病毒性心肌炎。而a組與a1組相比，b組與b1組相比，c組與c1組相比，均有顯著性差異，說明通過本發(fā)明的制備方法制備的生脈飲組合物的輔助治療病毒性心肌炎的總有效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法制備的生脈飲，具有顯著的進(jìn)步意義。