一種甲殼素?兩親離子/季銨鹽天然敷料及其制備方法與應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于藥物制備領(lǐng)域，具體地說，涉及一種甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

對(duì)于大面積嚴(yán)重皮膚缺損的病人而言，急需通過各種手段快速有效的封閉創(chuàng)面從而防止細(xì)菌入侵，同時(shí)防止體液、水電解質(zhì)和能量的流失。創(chuàng)面敷料可以重建皮膚屏障，加速創(chuàng)面愈合，為后期手術(shù)做好準(zhǔn)備。理想的創(chuàng)面敷料應(yīng)該有以下一些特點(diǎn)：良好的力學(xué)性能、適當(dāng)?shù)乃畾馔ㄍ感院蛢?yōu)異的生物相容性。更為重要的是，感染、炎癥反應(yīng)失調(diào)等會(huì)引起創(chuàng)面的愈合減慢甚至不愈合，理想的創(chuàng)面敷料還應(yīng)當(dāng)能為創(chuàng)面局部提供一個(gè)無菌適宜生長(zhǎng)的微環(huán)境。而天然材料如甲殼素與殼多糖、葡聚糖類、纖維素類、海藻酸鹽、蠶絲蛋白等，由于取材方便，具有良好的生物相容性，被認(rèn)為是用作制備創(chuàng)面敷料的很好的材料。因此，天然材料負(fù)載各種抗菌制劑、生長(zhǎng)因子或者其他化學(xué)物質(zhì)促進(jìn)感染性創(chuàng)面的愈合已成為創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)及重點(diǎn)。

甲殼素，又名甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)等，是由n-乙酰-2-氨基-2-脫氧-d-葡萄糖以13-1，4糖苷鍵形式連接而成的天然多糖，廣泛存在于低等動(dòng)物特別是甲殼動(dòng)物的外殼及低等植物菌藻類的細(xì)胞壁中，是一種天然的生物高分子，在自然界的產(chǎn)量?jī)H次于纖維素。甲殼素由于具有良好的生物相容性，且具有無毒性、成本低、易改質(zhì)、機(jī)械強(qiáng)度好、廣譜抗菌性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。它可作為醫(yī)用生物材料，如吸收性手術(shù)縫合線、止血?jiǎng)?、免疫促進(jìn)劑、腫瘤抑制劑和愈合劑等。但甲殼素分子之中具有規(guī)則的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和其分子之間(內(nèi))存在很強(qiáng)的氫鍵作用，從而使得其結(jié)晶度高，導(dǎo)致它的溶解性能變差，不溶于水、稀堿、稀酸和一般的有機(jī)溶劑中，使其應(yīng)用受到很大的限制。為了克服甲殼素溶解性能不足的缺點(diǎn)，可以對(duì)甲殼素進(jìn)行季銨鹽化，這是甲殼素化學(xué)改性的重要領(lǐng)域之一。

甲殼素季銨鹽具有良好的溶解性能，具有良好的生物相容性，具有無毒性，具有簡(jiǎn)單的制備方法，并且其制備成本低以及應(yīng)用范圍極為廣泛。作為一種常用的殺菌劑，季銨鹽與甲殼素的脫乙酰基衍生物殼聚糖的聚合研究同樣較為成熟。殼聚糖引入親水性季銨鹽基團(tuán)得到的一類水溶性殼聚糖衍生物，不僅繼承了殼聚糖的成膜性、抗菌性、絮凝性、生物可降解性等特性，還具有更好的水溶性，更強(qiáng)的正電性，更廣的ph值。而兩親離子作為同時(shí)具有親水性以及親脂性的化合物，具有較好的抗污染作用，目前在創(chuàng)面敷料領(lǐng)域已有初步應(yīng)用。

因此，將甲殼素與季銨鹽/兩親離子相結(jié)合已成為一個(gè)熱門的研究領(lǐng)域，其不僅可以有效的利用天然甲殼素來源廣泛、低廉環(huán)保的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)可有效的結(jié)合季銨鹽的抑菌作用及兩親離子的抗污染作用。因此，我們特制備甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料，并研究其體外抗污染抗菌活性以及對(duì)小鼠創(chuàng)面愈合的影響，為天然敷料的進(jìn)一步研究提供參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)上述的問題，提供了一種甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料及其制備方法與應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、預(yù)處理：將貝殼浸入hcl溶液中3天，制備得到預(yù)處理后的貝殼；

步驟2、合成抗菌單體：將n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基溶于乙腈，得到n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基的乙腈溶液，然后向n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基的乙腈溶液中加入己基溴并進(jìn)行攪拌處理，然后使用真空過濾將混合物過濾，最后在冷凍干燥后得到白色固體，即為抗菌單體n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基己基-1-銨；

步驟3、制備凍干貝殼：將氨丙基硅油加入到稀酸性酸和乙醇溶液的混合物中，得到混合溶液，然后將預(yù)處理后的貝殼浸入混合溶液中浸泡；用水洗浸泡后的貝殼15次，然后進(jìn)行凍干，制備得到凍干貝殼；

步驟4、具有抗菌表面的殼的制備：

將n,n-二甲基甲酰胺、n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基和gedc-hcl加入燒杯中，然后將凍干貝殼浸入混合物中，浸泡3天；然后使用n,n-二甲基甲酰胺和水清洗凍干貝殼，凍干后得到raft-shell；將raft-shell浸入n，n-二甲基甲酰胺、抗菌單體和偶氮二異丁腈的溶液中，然后使用n2將混合物脫氣，過夜反應(yīng)；然后使用n，n-二甲基甲酰胺和水清洗反應(yīng)后的貝殼并進(jìn)行凍干處理，得到具有抗菌表面的殼；

步驟5、甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的制備：

將n,n-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈混合攪拌，然后加入甲殼素+雙親離子材料，冰鎮(zhèn)條件下n2除氣，然后將燒瓶放入反應(yīng)過夜；反應(yīng)結(jié)束后用氯仿、n，n-二甲基甲酰胺和水依次清洗殼并凍干，即為甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料。

進(jìn)一步地，步驟1中的hcl溶液的濃度為3％-8％。

進(jìn)一步地，步驟2中的n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基的乙腈溶液的濃度為10％-20％；n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基與己基溴的摩爾比為1:1-1:1.5；攪拌處理溫度為75-85℃，攪拌處理時(shí)間為12-20小時(shí)，攪拌處理轉(zhuǎn)速為50-80r/min；真空過濾溫度為35-40℃，真空過濾時(shí)間為45-75min；冷凍干燥溫度為-25℃--15℃，冷凍干燥時(shí)間為45-75min。

進(jìn)一步地，步驟3中的稀酸性酸的體積濃度為8％-12％；氨丙基硅油、稀酸性酸和乙醇的體積比為1-5：4-8:100；浸泡時(shí)間為12-18分鐘。

進(jìn)一步地，步驟4中的n,n-二甲基甲酰胺、n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基和gedc-hcl的配比為10ml：36.4g:28.7g；n，n-二甲基甲酰胺、抗菌單體和偶氮二異丁腈的配比為8-12ml：0.1-0.3g：8-12mg；脫氣時(shí)間為15-25分鐘，反應(yīng)溫度為55-65℃。

進(jìn)一步地，步驟6中的n，n-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈的配比為8-12ml：0.1-0.3g：8-12mg；脫氣時(shí)間為15-25分鐘，反應(yīng)溫度為55-65℃。

本發(fā)明還公開了一種由上述的制備方法制備得到的甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料。

本發(fā)明還公開了一種上述的甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料在制備治療創(chuàng)面愈合藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明的甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料具有高效抗菌性：季銨鹽抗菌活性強(qiáng)，抗菌譜廣，不易產(chǎn)生耐藥菌株，在防治創(chuàng)面感染方面有獨(dú)特的優(yōu)越性。殼聚糖引入親水性季銨鹽基團(tuán)得到的一類水溶性殼聚糖衍生物，不僅繼承了殼聚糖的成膜性、抗菌性、絮凝性、生物可降解性等特性，還具有更好的水溶性，更強(qiáng)的正電性，更廣的ph值。而本發(fā)明體外實(shí)驗(yàn)表明，甲殼素/季銨鹽能有效抑制和殺滅細(xì)菌和真菌，將其制成納米復(fù)合材料后抗菌活性更高。

2)本發(fā)明的甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料具有高效抗粘附性：兩親離子作為同時(shí)具有親水性以及親脂性的化合物，具有較好的抗污染作用，其機(jī)制可能在于通過降低了蛋白質(zhì)和細(xì)菌、微生物與表面的相互作用，從而降低了附著物的黏附強(qiáng)度。也有研究認(rèn)為，兩親離子可通過改變表面的形貌、電荷、表面基團(tuán)的移動(dòng)性和機(jī)械性能也能達(dá)到降低表面能的效果。本發(fā)明中，將具有親水性抗生物黏附性能的聚合物和具有疏水性聚合物或低表面能的物質(zhì)相結(jié)合，即兩親離子與甲殼素結(jié)合，研制具有高效抗生物黏附的兩親性表面。

3)本發(fā)明的甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料具有高生物相容性：本發(fā)明中，細(xì)胞毒性來看僅當(dāng)?shù)降?日時(shí)，d組對(duì)細(xì)胞有輕微增值抑制。這與殼聚糖及殼聚糖季銨鹽、兩親離子均具有安全、無毒的特點(diǎn)，所以它們可以被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中作為食品的保鮮劑、添加劑有關(guān)。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品必不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的制備及評(píng)價(jià)指標(biāo)簡(jiǎn)示示意圖；

圖2是本發(fā)明甲殼素與甲殼素-兩親離子/季銨鹽在不同倍數(shù)鏡下的紋理結(jié)構(gòu)圖，其中，a1、a2和a3分別為2×10²倍，2×10³倍和2×10⁴倍下的甲殼素紋理結(jié)構(gòu)；b1、b2和b3分別為2×10²倍，2×10³倍和2×10⁴倍下的甲殼素-兩親離子/季銨鹽結(jié)構(gòu)；

圖3是本發(fā)明甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的接觸角測(cè)試結(jié)果，其中a為甲殼素，b為甲殼素+雙親離子，c為甲殼素+季銨鹽，d為甲殼素+季銨鹽/雙親離子；

圖4是本發(fā)明甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的抗菌測(cè)試結(jié)果；其中，control為不加任何材料，a為甲殼素，b為甲殼素+雙親離子，c為甲殼素+季銨鹽，d為甲殼素+季銨鹽/雙親離子；

圖5是本發(fā)明甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的抗粘附測(cè)試結(jié)果；其中，s-a為甲殼素，s-b為甲殼素+雙親離子，s-c為甲殼素+季銨鹽，s-d為甲殼素+季銨鹽/雙親離子，均為對(duì)金黃色葡萄球菌的影響；e-a為甲殼素，e-b為甲殼素+雙親離子，e-c為甲殼素+季銨鹽，e-d為甲殼素+季銨鹽/雙親離子，均為對(duì)大腸桿菌的影響；

圖6是本發(fā)明甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的抗粘附測(cè)試結(jié)果的柱狀圖；其中，control為不加任何材料，a為甲殼素，b為甲殼素+雙親離子，c為甲殼素+季銨鹽，d為甲殼素+季銨鹽/雙親離子；

圖7是本發(fā)明甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的細(xì)胞毒性結(jié)果，其中，control為不加任何材料，a為甲殼素，b為甲殼素+雙親離子，c為甲殼素+季銨鹽，d為甲殼素+季銨鹽/雙親離子；

圖8是本發(fā)明甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的創(chuàng)面愈合結(jié)果，其中control為不加任何材料，a為甲殼素，b為甲殼素+雙親離子，c為甲殼素+季銨鹽，d為甲殼素+季銨鹽/雙親離子；每組中左側(cè)代表直接0.6cm的標(biāo)準(zhǔn)化小圓片，右側(cè)代表小鼠創(chuàng)面面積；

圖9是本發(fā)明3天和7天時(shí)甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的創(chuàng)面愈合結(jié)果，其中control為不加任何材料，a為甲殼素，b為甲殼素+雙親離子，c為甲殼素+季銨鹽，d為甲殼素+季銨鹽/雙親離子；

圖10是本發(fā)明甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的新生上皮長(zhǎng)度結(jié)果的電鏡圖，其中control為不加任何材料，a為甲殼素，b為甲殼素+雙親離子，c為甲殼素+季銨鹽，d為甲殼素+季銨鹽/雙親離子；

圖11是本發(fā)明本發(fā)明甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的新生上皮長(zhǎng)度結(jié)果的柱狀圖，其中control為不加任何材料，a為甲殼素，b為甲殼素+雙親離子，c為甲殼素+季銨鹽，d為甲殼素+季銨鹽/雙親離子。

具體實(shí)施方式

以下將配合附圖及實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

本發(fā)明公開了一種甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、預(yù)處理：將貝殼浸入質(zhì)量百分含量為3％-8％的hcl溶液3天，制備得到預(yù)處理后的貝殼；

步驟2、合成抗菌單體：將n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基溶于乙腈(mecn)，得到質(zhì)量濃度為10％-20％的n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基的乙腈溶液，然后向n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基的乙腈溶液中加入己基溴(摩爾比：n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基己基溴＝1:1-1:1.5)，混合物在75-85℃的劇烈攪拌下反應(yīng)12-20小時(shí)；攪拌處理轉(zhuǎn)速為50-80r/min；反應(yīng)完成后，使用真空過濾將混合物過濾，最后在冷凍干燥后得到白色固體(a)，即為抗菌單體n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基己基-1-銨(admha，a)；其中，真空過濾溫度為35-40℃，真空過濾時(shí)間為45-75min；冷凍干燥溫度為-25℃--15℃，冷凍干燥時(shí)間為45-75min；

步驟3、將步驟1中制備得到的預(yù)處理后的貝殼表面增加氨基：將氨丙基硅油(apms)加入到稀酸性酸(8％-12％，體積濃度)和乙醇溶液中，得到混合溶液，然后將步驟1中制備得到的預(yù)處理后的貝殼浸入混合溶液中浸泡12-18分鐘；用水洗殼15次，然后進(jìn)行凍干，制備得到凍干貝殼(b)，其中，氨丙基硅油、稀酸性酸和乙醇的體積比為1-5：4-8:100；

步驟4、具有抗菌表面的殼的制備：

使用可逆的加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移(raft)來制備抗菌和防污表面；首先通過cooh-和nh2-基團(tuán)的反應(yīng)將n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基(raft試劑)加入到步驟3制備得到的凍干貝殼(b)表面上，然后使用raft試劑在表面上加入抗菌和防污分子，具體地，

在20ml燒杯中加入10mln,n-二甲基甲酰胺，36.4gn-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基和28.7gedc-hcl，混合均勻后在室溫下泡入凍干貝殼(b)。三天后將凍干貝殼(b)取出，用n,n-二甲基甲酰胺和水清洗殼，凍干后得到raft-shell(a)，即為甲殼素。季銨鹽有很好的抗菌功效，因此使用季銨鹽分子為抗菌分子處理raft-shell(a)。將raft-shell(a)泡入含有n，n-二甲基甲酰胺、抗菌單體(a)和偶氮二異丁腈中，用n2去氣15-25min后，將燒瓶放在55-65℃下過夜反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后用n，n-二甲基甲酰胺和水清洗材料并凍干，得到甲殼素+季銨鹽材料(c)，其中，n，n-二甲基甲酰胺、抗菌單體和偶氮二異丁腈的配比為8-12ml：0.1-0.3g：8-12mg；

步驟5、具有抗粘連表面的殼的制備：將使用具有cf3-結(jié)構(gòu)的分子來執(zhí)行抗粘連性能，

首先，將n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈(aibn)加入20ml的燒瓶中，攪拌均勻后泡入raft-shell(a)，冰鎮(zhèn)條件下n2除氣15-25min，然后將燒瓶放入55-65℃的溫度條件下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后用氯仿、n，n-二甲基甲酰胺和水依次清洗殼并凍干，制備得到甲殼素+雙親離子材料(b)，其中，n，n-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈的配比為8-12ml：0.1-0.3g：8-12mg。

步驟6、甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的制備：

將n，n-二甲基甲酰胺、2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈加入燒瓶中，攪拌均勻后泡入甲殼素+雙親離子材料(b)，冰鎮(zhèn)條件下n2除氣15-25min，然后將燒瓶放入55-65℃的溫度條件下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后用氯仿,n,n-二甲基甲酰胺和水依次清洗殼并凍干，即為甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料(d)，其中，n，n-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈的配比為8-12ml：0.1-0.3g：8-12mg；本發(fā)明甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料材料的制備及評(píng)價(jià)簡(jiǎn)示如圖1所示。

實(shí)施例1

一種甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、預(yù)處理：將貝殼浸入質(zhì)量百分含量為5％的hcl溶液3天，制備得到預(yù)處理后的貝殼；

步驟2、合成抗菌單體：

將n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基溶于乙腈(mecn)，得到質(zhì)量濃度為15％的n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基的乙腈溶液，然后向n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基的乙腈溶液中加入己基溴(摩爾比：n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基己基溴＝1:1.2)，在80℃下混合物在劇烈攪拌下反應(yīng)16小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速為65r/min；反應(yīng)完成后，使用真空過濾(37℃，1小時(shí))將混合物過濾，最后在冷凍干燥(-20℃，1小時(shí))后得到白色固體(a)，即為抗菌單體n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基己基-1-銨(admha)；

步驟3、將步驟1中制備得到的預(yù)處理后的貝殼表面增加氨基：將0.3ml氨丙基硅油加入到0.6ml稀酸性酸(10％，體積濃度)和10ml乙醇溶液中，得到混合溶液，然后將貝殼浸入混合溶液中浸泡15分鐘；用水洗殼15次，然后進(jìn)行凍干，制備得到凍干貝殼(b)；

步驟4、具有抗菌表面的殼的制備：

在20ml燒杯中加入10mln,n-二甲基甲酰胺，36.4gn-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基和28.7gedc-hcl，混合均勻后在室溫下泡入凍干貝殼(b)。三天后將b取出，用n，n-二甲基甲酰胺和水清洗殼，凍干后得到raft-shell(a)。將c泡入含有10mln,n-二甲基甲酰胺，0.2g抗菌單體(a)和10mg偶氮二異丁腈中，用n2去氣20min后，將燒瓶放在60℃下過夜反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后用n,n-二甲基甲酰胺和水清洗材料并凍干，得到甲殼素+季銨鹽材料(c)。

步驟5、具有抗粘連表面的殼的制備：

將10mln,n-二甲基甲酰胺，0.2g2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和10mg偶氮二異丁腈加入20ml的燒瓶中，攪拌均勻后泡入raft-shell(a)，冰鎮(zhèn)條件下n2除氣20min，然后將燒瓶放入60℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后用氯仿、n,n-二甲基甲酰胺和水依次清洗殼并凍干，制備得到甲殼素+雙親離子材料(b)。

步驟6、甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的制備：

將10mln,n-二甲基甲酰胺，0.2g2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和10mg偶氮二異丁腈加入20ml的燒瓶中，攪拌均勻后泡入甲殼素+雙親離子材料(b)，冰鎮(zhèn)條件下n2除氣20min，然后將燒瓶放入60℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后用氯仿、n，n-二甲基甲酰胺和水依次清洗殼并凍干，得甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料(d)。

實(shí)施例2

一種甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、預(yù)處理：將貝殼浸入質(zhì)量百分含量為3％的hcl溶液3天，制備得到預(yù)處理后的貝殼；

步驟2、合成抗菌單體：將n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基溶于乙腈(mecn)，得到質(zhì)量濃度為20％的n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基的乙腈溶液，然后向n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基的乙腈溶液中加入己基溴(摩爾比：n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基己基溴＝1:1)，在75℃的劇烈攪拌條件下反應(yīng)20小時(shí)，攪拌處理轉(zhuǎn)速為50r/min；反應(yīng)完成后，使用真空過濾將混合物過濾，最后在冷凍干燥后得到白色固體(a)，即為抗菌單體n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基己基-1-銨(admha，a)；真空過濾溫度為35℃，真空過濾時(shí)間為75min；冷凍干燥溫度為-25℃，冷凍干燥時(shí)間為75min；

步驟3、將步驟1中制備得到的預(yù)處理后的貝殼表面增加氨基：將0.1ml氨丙基硅油(apms)加入到0.8ml稀酸性酸(8％，體積濃度)和10ml乙醇溶液中，得到混合溶液，然后將步驟1中制備得到的預(yù)處理后的貝殼浸入混合溶液中浸泡12分鐘；用水洗殼15次，然后進(jìn)行凍干，制備得到凍干貝殼(b)；

步驟4、具有抗菌表面的殼的制備：

在20ml燒杯中加入10mln,n-二甲基甲酰胺，36.4gn-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基和28.7gedc-hcl，混合均勻后在室溫下泡入凍干貝殼(b)。三天后將凍干貝殼(b)取出，用n,n-二甲基甲酰胺和水清洗殼，凍干后得到raft-shell(a)，即為甲殼素。季銨鹽有很好的抗菌功效，因此使用季銨鹽分子為抗菌分子處理raft-shell(a)。將raft-shell(a)泡入含有n，n-二甲基甲酰胺、抗菌單體(a)和偶氮二異丁腈中，用n2去氣15min后，將燒瓶放在65℃下過夜反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后用n，n-二甲基甲酰胺和水清洗材料并凍干，得到甲殼素+季銨鹽材料(c)，其中，n，n-二甲基甲酰胺、抗菌單體和偶氮二異丁腈的配比為8ml：0.3g：8mg；

步驟5、具有抗粘連表面的殼的制備：

首先，將n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈(aibn)加入20ml的燒瓶中，攪拌均勻后泡入raft-shell(a)，冰鎮(zhèn)條件下n2除氣15min，然后將燒瓶放入65℃的溫度條件下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后用氯仿、n，n-二甲基甲酰胺和水依次清洗殼并凍干，制備得到甲殼素+雙親離子材料(b)，其中，n，n-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈的配比為8ml：0.3g：8mg。

步驟6、甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的制備：

將n,n-二甲基甲酰胺、2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈加入燒瓶中，攪拌均勻后泡入甲殼素+雙親離子材料(b)，冰鎮(zhèn)條件下n2除氣15min，然后將燒瓶放入65℃的溫度條件下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后用氯仿,n,n-二甲基甲酰胺和水依次清洗殼并凍干，即為甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料(d)，其中，n，n-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈的配比為8ml：0.3g：12mg。

實(shí)施例3

一種甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、預(yù)處理：將貝殼浸入質(zhì)量百分含量為8％的hcl溶液3天，制備得到預(yù)處理后的貝殼；

步驟2、合成抗菌單體：將n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基溶于乙腈(mecn)，得到質(zhì)量濃度為10％的n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基的乙腈溶液，然后向n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基的乙腈溶液中加入己基溴(摩爾比：n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基己基溴＝1:1.5)，混合物在劇烈攪拌下在85℃下反應(yīng)12小時(shí)；反應(yīng)完成后，使用真空過濾將混合物過濾，最后在冷凍干燥后得到白色固體(a)，即為抗菌單體n-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基己基-1-銨(admha，a)；其中，攪拌處理溫度為85℃，攪拌處理時(shí)間為12小時(shí)，攪拌處理轉(zhuǎn)速為80r/min；真空過濾溫度為40℃，真空過濾時(shí)間為45min；冷凍干燥溫度為-15℃，冷凍干燥時(shí)間為45min；

步驟3、將步驟1中制備得到的預(yù)處理后的貝殼表面增加氨基：將0.5ml氨丙基硅油(apms)加入到0.4ml稀酸性酸(12％，體積濃度)和10ml乙醇溶液中，得到混合溶液，然后將步驟1中制備得到的預(yù)處理后的貝殼浸入混合溶液中浸泡18分鐘；用水洗殼15次，然后進(jìn)行凍干，制備得到凍干貝殼(b)；

步驟4、具有抗菌表面的殼的制備：

在20ml燒杯中加入10mln,n-二甲基甲酰胺，36.4gn-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-n，n-二甲基和28.7gedc-hcl，混合均勻后在室溫下泡入凍干貝殼(b)。三天后將凍干貝殼(b)取出，用n,n-二甲基甲酰胺和水清洗殼，凍干后得到raft-shell(a)，即為甲殼素。季銨鹽有很好的抗菌功效，因此使用季銨鹽分子為抗菌分子處理raft-shell(a)。將raft-shell(a)泡入含有n，n-二甲基甲酰胺、抗菌單體(a)和偶氮二異丁腈中，用n2去氣15min后，將燒瓶放在65℃下過夜反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后用n，n-二甲基甲酰胺和水清洗材料并凍干，得到甲殼素+季銨鹽材料(c)，其中，n，n-二甲基甲酰胺、抗菌單體和偶氮二異丁腈的配比為12ml：0.1g：12mg；

步驟5、具有抗粘連表面的殼的制備：將使用具有cf3-結(jié)構(gòu)的分子來執(zhí)行抗粘連性能，

首先，將n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈(aibn)加入20ml的燒瓶中，攪拌均勻后泡入raft-shell(a)，冰鎮(zhèn)條件下n2除氣25min，然后將燒瓶放入55℃的溫度條件下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后用氯仿、n，n-二甲基甲酰胺和水依次清洗殼并凍干，制備得到甲殼素+雙親離子材料(b)，其中，n，n-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈的配比為12ml：0.1g：12mg。

步驟6、甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料的制備：

將n,n-二甲基甲酰胺、2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈加入燒瓶中，攪拌均勻后泡入甲殼素+雙親離子材料(b)，冰鎮(zhèn)條件下n2除氣25min，然后將燒瓶放入55℃的溫度條件下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后用氯仿,n,n-二甲基甲酰胺和水依次清洗殼并凍干，即為甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料(d)，其中，n，n-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二異丁腈的配比為12ml：0.1g：12mg。

下面結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來說明本發(fā)明的技術(shù)效果：

1、實(shí)驗(yàn)方法：

1.1、掃描電鏡觀察

將樣品(甲殼素(a)與甲殼素+雙親離子/季銨鹽材料(d))用去離子水小心清洗，烘干、噴金后，利用掃描電鏡真空條件下觀察膜的孔徑結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2、材料學(xué)表征

將材料(甲殼素(a)、甲殼素+雙親離子(b)、甲殼素+季銨鹽(c)與甲殼素+季銨鹽/雙親離子(d))用去離子水小心清洗，烘干后，利用接觸角測(cè)試儀檢測(cè)樣品的親疏水性。

1.3、細(xì)菌共培養(yǎng)

細(xì)菌來源于第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍燒傷研究所凍存staphylococcusaureus(s.aureus)和escherichiacoli(e.coli)菌株，擴(kuò)增細(xì)菌(搖菌過夜)至1*10⁹cfu/ml，用lb培養(yǎng)基稀釋菌液為1*10⁴cfu/ml，吸取100ml菌液酶標(biāo)儀檢測(cè)od值約0.07即符合標(biāo)準(zhǔn)。取2個(gè)96孔板，將各組材料放置孔中，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔加入200ul配制菌液，37℃搖床孵育24h后測(cè)各組od值變化，重復(fù)三次。

1.4、粘附細(xì)菌培養(yǎng)定量計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)

擴(kuò)增金黃色葡萄球菌和大腸桿菌(搖菌過夜)至10⁹cfu/ml，然后稀釋菌液為1*10⁴cfu/ml。材料75％酒精室溫浸泡20min滅菌后pbs洗3遍。向含膜片的孔內(nèi)加入200ul稀釋菌液，37℃孵育1.5hpbs后漂洗1遍。將膜材料貼于平皿的底部，展平，倒入預(yù)熱冷卻至45℃的lb瓊脂，凝固后，37℃培養(yǎng)過夜。取出平皿，拍照計(jì)數(shù)，重復(fù)三次。

1.5、細(xì)胞增值抑制

取普通原代新生小鼠，剝離培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞傳至第2和第3代時(shí)可使用。細(xì)胞計(jì)數(shù)，按96孔板每孔2000個(gè)細(xì)胞計(jì)算所需要量用dmem培養(yǎng)基配制。將各組材料放置孔中，每組12個(gè)復(fù)孔(測(cè)1，3，5，7日四次)，每孔加入150ul配置好的培養(yǎng)基，37℃孵箱放置，重復(fù)三次。

1.6、小鼠實(shí)驗(yàn)

1.6.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

balb/c小鼠(雄性，體重25g左右)購于第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物研究所，共25只，每組5只。動(dòng)物飼養(yǎng)于spf級(jí)飼養(yǎng)間，室溫25℃；相對(duì)濕度：50％；晝夜節(jié)律：12小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)開始前實(shí)驗(yàn)小鼠分單籠飼養(yǎng)，并提前適應(yīng)一周。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵從第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)倫理要求。

1.6.2小鼠皮膚全層感染缺損創(chuàng)面模型的制作

實(shí)驗(yàn)前一天小鼠1％戊巴比妥鈉溶液腹腔注射(70ul/g)后脫毛備皮,并分開單籠飼養(yǎng)。次日，小鼠背部麻醉消毒后，使用打孔器在小鼠背部中下部制備直徑約0.6mm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，左右對(duì)稱各一個(gè)。將同細(xì)菌共培養(yǎng)步驟制備的金葡和大腸桿菌菌液，每孔創(chuàng)面各滴入5ul，細(xì)菌濃度均為10⁸個(gè)/ml。材料用75％酒精消毒后，pbs緩沖液漂洗以徹底去除酒精，將材料貼于創(chuàng)面處，并用粘貼手術(shù)巾固定。傷后第0,1,3,5,7天對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照，更換新的同種材料。

1.6.3小鼠創(chuàng)面愈合率及he染色

創(chuàng)面愈合率：原始創(chuàng)面面積以及傷后各個(gè)時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面面積可通過ipp6.0軟件進(jìn)行測(cè)量，即用其aoi功能選定創(chuàng)面,利用“countsize”測(cè)量創(chuàng)面像素面積,通過比例尺的換算可得出創(chuàng)面的面積。創(chuàng)面愈合率＝(原始創(chuàng)面面積-傷后第n天殘余創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100％。

he染色：取傷后3天和7天小鼠創(chuàng)面組織標(biāo)本，制備石蠟切片，并選取高質(zhì)量圖片進(jìn)行he染色，由不同的病理專家采取盲法的方式測(cè)量新生上皮長(zhǎng)度。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1電鏡觀察

如圖2所示，a1-a3組甲殼素(制備中的a)在不同倍數(shù)鏡下基本保留紋理完整清晰的殼膜結(jié)構(gòu)；而b1-b3組甲殼素-兩親離子/季銨鹽組制備中的d)，b1下可見毛刷樣結(jié)構(gòu)層，b2可見規(guī)則紋理結(jié)構(gòu)改變，而b3可見析出鋪墊的兩親離子/季銨鹽晶層。

2.2材料學(xué)表征

如圖3所示，甲殼素-雙親離子/季銨鹽具有良好的親水性。

2.3體外抗菌

如表1，表2，圖4所示，金黃色葡萄球菌及大腸桿菌共培養(yǎng)12h和24h，抗菌活性d>c>b>a>control，僅ab組間差異不明顯(p>0.05)，其余組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，其中，control為不加任何材料，a為甲殼素材料，b為甲殼素+雙親離子材料，c為甲殼素+季銨鹽材料，d為甲殼素+季銨鹽/雙親離子材料，下同。

表1甲殼素-兩親離子/季銨鹽敷料與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)的od值變化

表2甲殼素-兩親離子/季銨鹽敷料與大腸桿菌共培養(yǎng)的od值變化

2.4體外抗污染

如圖5和圖6所示，抗污染活性d>b>c>a，且各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。具體地，如圖5所示，粘附細(xì)胞數(shù)量d<b<c<a，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；如圖6所示，粘附細(xì)胞數(shù)量d<b<c<a，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

2.5細(xì)胞毒性

由表3及圖7可知，1-5天，4組對(duì)細(xì)胞基本無增值抑制(p>0.05)，僅當(dāng)?shù)降?日時(shí)，d組對(duì)細(xì)胞有輕微增值抑制(p<0.05)。

表3甲殼素-兩親離子/季銨鹽敷料對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞增值抑制的od值變化

2.6感染創(chuàng)面愈合影響

如圖8和圖9所示，傷后3天，control，a，b，c，d組愈合率分別為17.9％，23.8％，29.3％，35.6％，39.7％，即d>c>b>a>control(p<0.05)；傷后7天分別為34.6％，44.7％，59.8％，62.2％，70.4％，即d>c>b>a>control，僅b、c組間差異不明顯(p>0.05)。具體地，如圖8所示，傷后7天創(chuàng)面愈合率分別為d>c≈b>a>control；如圖9所示，傷后3天，創(chuàng)面愈合率d>c>b>a>control(p<0.05)；傷后7天創(chuàng)面愈合率分別為d>c≈b>a>control，b、c組間差異不明顯(p>0.05)。

2.7新生上皮長(zhǎng)度

如圖10和圖11所示，傷后3天各組新生上皮長(zhǎng)度無差異(p>0.05)；而傷后7天，control組，a，b，c，d組創(chuàng)面新生上皮長(zhǎng)度分別為635.3μm，717.2μm，843.8μm，865.7μm和951.0μm，即d>c>b>a>control，b、c組間差異不明顯(p>0.05)。如圖11所示，傷后3天各組新生上皮長(zhǎng)度無差異(p>0.05)；而傷后7天新生上皮長(zhǎng)度d>c≈b>a>control(p<0.05)。

3、結(jié)果：

本研究中金黃色葡萄球菌及大腸桿菌共培養(yǎng)12h和24h，抗菌活性d>c>b>a>control，僅ab組間差異不明顯(p>0.05)，其余組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，說明甲殼素季銨鹽抗菌活性明顯較強(qiáng)，而兩親離子起到了較好的協(xié)同作用?？刮廴净钚詃>b>c>a，且各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。說明兩親離子作為同時(shí)具有親水性以及親脂性的化合物，具有較好的抗污染作用，其機(jī)制可能在于通過降低了蛋白質(zhì)和細(xì)菌、微生物與表面的相互作用，從而降低了附著物的黏附強(qiáng)度。兩親離子可通過改變表面的形貌、電荷、表面基團(tuán)的移動(dòng)性和機(jī)械性能也能達(dá)到降低表面能的效果。因此，將具有親水性抗生物黏附性能的聚合物和具有疏水性聚合物或低表面能的物質(zhì)相結(jié)合，研制具有高效抗生物黏附的兩親性表面，越來越成為人們研究的熱點(diǎn)。

而由細(xì)胞毒性來看僅當(dāng)?shù)降?日時(shí)，d組對(duì)細(xì)胞有輕微增值抑制(p<0.05)。這與殼聚糖及殼聚糖季銨鹽、兩親離子均具有安全、無毒的特點(diǎn)，所以它們可以被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中作為食品的保鮮劑、添加劑有關(guān)。由于燒傷患者體內(nèi)和體表的防御屏障均遭到破壞，機(jī)體免疫能力顯著下降，廣泛組織壞死、體內(nèi)外菌群的侵襲等均會(huì)導(dǎo)致患者發(fā)生創(chuàng)面感染。創(chuàng)面感染是燒傷患者最主要的并發(fā)癥和死亡原因之一，約52％-70％燒傷患者因創(chuàng)面感染而死亡。本發(fā)明特采用較為成熟的小鼠創(chuàng)面感染模型，即混合滴入燒傷感染創(chuàng)面常見的革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭陰性菌大腸桿菌，細(xì)菌濃度均為10⁸個(gè)/ml。傷后3天，control，a，b，c，d組愈合率分別為17.9％，23.8％，29.3％，35.6％，39.7％，即d>c>b>a>control(p<0.05)；傷后7天分別為34.6％，44.7％，59.8％，62.2％，70.4％，即d>c>b>a>control，僅b、c組間差異不明顯(p>0.05)。說明對(duì)感染創(chuàng)面而言，初期(0-3天)的季銨鹽起主要的抗菌作用，即以控制感染為主。而后期(3-7天)兩親離子的抗污染作用逐步顯現(xiàn)，且其與季銨鹽的后期作用雖然原理不同，但效果基本一致。若兩者如d組協(xié)同作用，則可使細(xì)菌生長(zhǎng)受到最大化抑制。而創(chuàng)面愈合的進(jìn)程包含兩部分，即創(chuàng)面收縮和創(chuàng)面的上皮化，對(duì)于緊致型皮膚的物種而言(例如人類)，創(chuàng)面愈合主要靠創(chuàng)面的再上皮化完成。傷后3天各組新生上皮長(zhǎng)度無差異，這主要是因?yàn)閭?天創(chuàng)緣表皮仍主要處于細(xì)胞增殖和遷移的準(zhǔn)備期，新生上皮并不明顯。傷后3天各組新生上皮長(zhǎng)度無差異(p>0.05)；而傷后7天，control，a，b，c，d組創(chuàng)面新生上皮長(zhǎng)度分別為635.3μm，717.2μm，843.8μm，865.7μm和951.0μm，即d>c>b>a>control，b、c組間差異不明顯(p>0.05)。以上結(jié)果提示了在傷后晚期(傷后7天)，甲殼素復(fù)合季銨鹽/兩親離子可同時(shí)通過控制感染和抗細(xì)菌粘附，顯著的促進(jìn)創(chuàng)面的再上皮化從而加速創(chuàng)面的愈合,但其是否有其它促進(jìn)再上皮化機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

總而言之，本研究成功制備了甲殼素-兩親離子/季銨鹽天然敷料，且d組材料抗菌抗污染效果均較好，亦能促進(jìn)創(chuàng)面愈合，從而為天然敷料的創(chuàng)面應(yīng)用提供新的手段和思路。

如在說明書及權(quán)利要求當(dāng)中使用了某些詞匯來指稱特定成分或方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可理解，不同地區(qū)可能會(huì)用不同名詞來稱呼同一個(gè)成分。本說明書及權(quán)利要求并不以名稱的差異來作為區(qū)分成分的方式。如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的“包含”為一開放式用語，故應(yīng)解釋成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的誤差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問題，基本達(dá)到所述技術(shù)效果。說明書后續(xù)描述為實(shí)施本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃以說明本發(fā)明的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。

還需要說明的是，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統(tǒng)不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統(tǒng)所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個(gè)……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統(tǒng)中還存在另外的相同要素。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。