一種基于PD?L1抗體的納米粒子及其制備方法與應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種納米粒子及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)劑型的化療藥物受限于其非特異性的生物分布而對腫瘤的療效有限，且對正常組織的副作用呈現(xiàn)出多樣性和普遍性。隨著人們對分子生物學(xué)和分子化學(xué)認(rèn)識的不斷深入，采用納米劑型優(yōu)化化療藥物的臨床應(yīng)用在近年來成為研究熱點。幾種紫杉類藥物的納米劑型已經(jīng)完成了臨床轉(zhuǎn)化，如白蛋白紫杉醇(商品名abraxane)已經(jīng)在美國等國家上市，聚合膠束型紫杉醇(商品名genexol-pm)已經(jīng)在韓國上市。然而，上述已上市的藥物均屬于被動靶向制劑，其靶向效應(yīng)多依賴于藥物或其載體的尺寸效應(yīng)，故上述藥物的靶向效果并不甚理想。為此，基于抗原－抗體反應(yīng)等原理的主動靶向劑型的藥物設(shè)計策略應(yīng)運而生，尋找合適的抗體對載藥納米材料的表面進(jìn)行修飾，從而進(jìn)一步提高納米劑型對化療藥物的腫瘤靶向性投遞效率，具有重要意義。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，程序性死亡受體-配體1(programmedcelldeath-ligand1,pd-l1)表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞表面的程序性死亡分子-1(programmedcelldeath-1,pd-1)與pd-l1結(jié)合后功能將被抑制，t細(xì)胞就不能發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和向腫瘤細(xì)胞發(fā)出攻擊信號，這是腫瘤免疫逃逸的重要機(jī)制之一。抑制pd-1/pd-l1這一負(fù)性免疫調(diào)控通路，提高抗腫瘤免疫應(yīng)答，促進(jìn)效應(yīng)t細(xì)胞對腫瘤殺傷的治療策略在近兩年中取得了長足的進(jìn)步。例如，2014年9月4日，一種pd-1單克隆抗體pembrolizumab(商品名keytruda)獲美國fda批準(zhǔn)上市，用于晚期黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療。2016年5月19日，fda提前四個月批準(zhǔn)了羅氏旗下基因泰克的pd-l1抗體atezolizumab(商品名tecentriq)，作為二線藥物用于治療最常見晚期膀胱癌中最常見的類型-尿路上皮癌。同時fda還批準(zhǔn)了ventana的pd-l1伴隨診斷試劑sp142。pd-1/pd-l1抗體自問世以來就備受藥物研發(fā)者熱切關(guān)注，據(jù)researchandmarkets2017年1月發(fā)布的報告顯示，pd-1/pd-l1抑制劑2016年的全球市場份額達(dá)到了49.26億美元，并且到2025年將以23.4％的復(fù)合年增長率增長，預(yù)計峰值能達(dá)到350億美元，龐大的市場引發(fā)了國內(nèi)外企業(yè)紛紛加入pd-1/pd-l1單抗的研究開發(fā)行列。但是，pd-l1單抗是單純依賴t細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞的，其能力畢竟有限，如何將pd-l1單抗與抗腫瘤化學(xué)藥物結(jié)合起來，綜合兩者的優(yōu)勢成為目前本領(lǐng)域的重要研究方向。

載藥納米粒子是一類微觀膠質(zhì)的納米微球和納米微囊，藥物分布在囊膜上的獨立小孔中。不連接任何單抗的納米粒子只能通過實體瘤的高通透性和滯留(enhancedpermeabilityandretentioneffect，epr)效應(yīng)達(dá)到“被動靶向”，為了進(jìn)一步提高載藥納米粒子的靶向性，可以對納米粒子的表面進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，例如在納米粒子的表面修飾上適合的抗體，利用抗原-抗體反應(yīng)，納米粒子可靶向性的聚集于表達(dá)相應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞，以實現(xiàn)“主動靶向”作用。但是該過程需要考慮納米粒子與抗體之間的相互影響以及修飾方法對抗體的性能、生物活性等方面的影響。目前關(guān)于pd-l1單抗與納米材料相結(jié)合的領(lǐng)域還未被充分認(rèn)識到，也缺乏有效的手段將pd-l1單抗與納米材料連接起來制備靶向性高的納米藥物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中單純依靠傳統(tǒng)劑型的抗腫瘤化療藥物或pd-l1抗體治療腫瘤效果有限的缺陷，從而提供一種基于pd-l1抗體的納米粒子。

本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題在于填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中缺少有效的手段將pd-l1單抗與納米材料連接起來制備靶向性高的納米藥物的空白，從而提供一種基于pd-l1抗體的納米粒子的制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種基于pd-l1抗體的納米粒子，所述納米粒子是由pd-l1抗體與nh2-peg-pcl納米粒子通過化學(xué)鍵連接而成。

優(yōu)選的是，所述pd-l1抗體與所述nh2-peg-pcl納米粒子的重量比為1:1～10。

優(yōu)選的是，所述基于pd-l1抗體的納米粒子的粒徑為120～180nm。

優(yōu)選的是，所述基于pd-l1抗體的納米粒子的xps圖譜中c-n鍵中氮的1s電子結(jié)合能特征峰為496ev。

所述的基于pd-l1抗體的納米粒子的制備方法，包括以下步驟：

s1、將nh2-peg-pcl納米粒子分散于非質(zhì)子性有機(jī)溶劑中得到懸浮液，將pd-l1抗體分散于ph＝8.0～9.0的硼酸鹽緩沖液中形成抗體溶液；

s2、將所述抗體溶液與所述懸浮液混合，并于不斷攪拌條件下緩慢加入戊二醛溶液以進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時間不少于10h；

s3、向步驟s2的反應(yīng)體系中加入乙醇胺以終止反應(yīng)，離心，收集沉淀物即可。

優(yōu)選的是，所述硼酸鹽緩沖液的ph值為8.4。

優(yōu)選的是，所述非質(zhì)子性有機(jī)溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺中的一種或幾種。

優(yōu)選的是，每100ml所述非質(zhì)子性有機(jī)溶劑中分散有1g的所述nh2-peg-pcl納米粒子。

優(yōu)選的是，每100ml所述硼酸鹽緩沖液中分散有1g的所述pd-l1抗體。

所述nh2-peg-pcl納米粒子的制備包括：將peg-pcl、三乙胺和對甲苯磺酰氯溶于非質(zhì)子性有機(jī)溶劑中，0～5℃下反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后收集沉淀，即為所述nh2-peg-pcl納米粒子。

所述基于pd-l1抗體的納米粒子在制備藥物制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明提供的基于pd-l1抗體的納米粒子，是由pd-l1抗體與nh2-peg-pcl納米粒子通過化學(xué)鍵連接而成，具體地講是通過pd-l1抗體中的羧基與nh2-peg-pcl納米粒子中的氨基形成酰胺鍵來實現(xiàn)二者的連接。本發(fā)明通過將pd-l1抗體修飾于peg-pcl納米粒子表面，不僅能夠進(jìn)一步提高納米載體的靶向性，而且還可發(fā)揮pd-l1抗體自身獨特的細(xì)胞毒免疫治療效果，所以說，本發(fā)明的納米粒子成功結(jié)合了pd-l1抗體及納米載體的優(yōu)勢，將其用于運載化療藥物、中藥單體、microrna等，可顯著增強(qiáng)藥物的靶向效應(yīng)，通過精準(zhǔn)地控制給藥時間、給藥部位和給藥劑量，從而降低組合用藥的復(fù)雜性，同時還可發(fā)揮化療藥物與免疫治療藥物潛在的協(xié)同作用，且毒副作用小。

(2)本發(fā)明提供的基于pd-l1抗體的納米粒子的制備方法，通過添加戊二醛溶液，有助于pd-l1抗體與nh2-peg-pcl納米粒子之間的化學(xué)鍵連接，且二者間的結(jié)合能較大，結(jié)合作用力較強(qiáng)，從而易于實現(xiàn)對化療藥物的靶向性運載以更好地發(fā)揮其療效。本發(fā)明所述的方法工藝簡單，可操作性強(qiáng)、可重復(fù)性高。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為peg-pcl材料的xps譜圖；

圖2為本發(fā)明實施例1提供的基于pd-l1抗體的納米粒子的xps譜圖；

圖3為本發(fā)明實施例1提供的基于pd-l1抗體的納米粒子的電鏡圖；

圖4為本發(fā)明實施例1提供的基于pd-l1抗體的納米粒子、peg-pcl對胃癌細(xì)胞系bgc823的作用效果對比圖；

圖5為本發(fā)明實施例1提供的基于pd-l1抗體的納米粒子、peg-pcl對肺癌細(xì)胞系a549的作用效果對比圖。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。此外，下面所描述的本發(fā)明不同實施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互結(jié)合。

實施例1：基于pd-l1抗體的納米粒子的制備

(1)制備peg-pcl：將50gmpeg(mn＝5000，10mmol)、1.15gε-cl(購自美國fluka公司，10mmol)和0.05g辛酸亞錫置于聚合管中，并用150ml干燥的二氯甲烷溶解原料，真空下封管，130℃下反應(yīng)48小時，待反應(yīng)得到的粗產(chǎn)物凝固后再用150ml二氯甲烷溶解，后加入大量的無水乙醚至沉淀不再產(chǎn)生為止，用100ml冷乙醚反復(fù)洗滌沉淀三次后收集沉淀并減壓干燥，所得產(chǎn)品密封保存待用；

(2)取10.2gpeg-pcl(2mmol)、2.8ml三乙胺(20mmol)和3.8ml對甲苯磺酰氯(20mmol)溶于100ml二氯甲烷中，在冰水浴條件下反應(yīng)至tlc檢測反應(yīng)結(jié)果不再變化時停止反應(yīng)，后加入大量的無水乙醚至沉淀不再產(chǎn)生為止，用50ml冷乙醚反復(fù)洗滌沉淀三次后收集沉淀并常溫干燥得到nh2-peg-pcl，所得產(chǎn)品密封保存待用；

(3)取20mgnh2-peg-pcl充分溶于2ml二氯甲烷中制成重量百分濃度為10mg/ml的溶液；將10mgatezolizumab稀釋于1ml硼酸鹽緩沖液中(ph＝8.4)制成重量百分濃度為10mg/ml的溶液；

(4)加1ml上述稀釋得到的單克隆抗體溶液到1mlnh2-peg-pcl溶液混合；

(5)攪拌條件下，將200ul25wt％戊二醛溶液緩慢的加入上述溶液；

(6)反應(yīng)16h，加入1mol/l乙醇胺至體系不再發(fā)生變化為止；

(7)離心，收集納米粒子，用10ml硼酸鹽緩沖液(0.2mol/l，ph＝8.4)沖洗三次，凍干，得到基于pd-l1抗體的納米粒子。

實施例2：基于pd-l1抗體的納米粒子的制備

(1)制備peg-pcl：將50gmpeg(mn＝5000，10mmol)、1.15gε-cl(購自美國fluka公司，10mmol)和0.05g辛酸亞錫置于聚合管中，并用150ml干燥的無水甲苯溶解原料，真空下封管，130℃下反應(yīng)48小時，待反應(yīng)得到的粗產(chǎn)物凝固后再用150ml二氯甲烷溶解，后加入大量的無水乙醚至沉淀不再產(chǎn)生為止，用100ml冷乙醚反復(fù)洗滌沉淀三次后收集沉淀并減壓干燥，所得產(chǎn)品密封保存待用；

(2)取10.2gpeg-pcl(2mmol)、2.8ml三乙胺(20mmol)和3.8ml對甲苯磺酰氯(20mmol)溶于100ml二氯甲烷中，在冰水浴條件下反應(yīng)至tlc檢測反應(yīng)結(jié)果不再變化時停止反應(yīng)，后加入大量的無水乙醚至沉淀不再產(chǎn)生為止，用50ml冷乙醚反復(fù)洗滌沉淀三次后收集沉淀并常溫干燥得到nh2-peg-pcl，所得產(chǎn)品密封保存待用；

(3)取20mgnh2-peg-pcl充分溶于2mln,n-二甲基甲酰胺中制成重量百分濃度為10mg/ml的溶液；將10mgatezolizumab稀釋于1ml硼酸鹽緩沖液中(ph＝9.0)制成重量百分濃度為10mg/ml的溶液；

(4)加1ml上述稀釋得到的單克隆抗體溶液到5mlnh2-peg-pcl溶液混合；

(5)攪拌條件下，將200ul25wt％戊二醛溶液緩慢的加入上述溶液；

(6)反應(yīng)10h，加入1mol/l乙醇胺至體系不再發(fā)生變化為止；

(7)離心，收集納米粒子，用10ml硼酸鹽緩沖液(0.2mol/l，ph＝9.0)沖洗三次，凍干，得到基于pd-l1抗體的納米粒子。

實施例3：基于pd-l1抗體的納米粒子的制備

(1)制備peg-pcl：將50gmpeg(mn＝5000，10mmol)、1.15gε-cl(購自美國fluka公司，10mmol)和0.05g辛酸亞錫置于聚合管中，并用150ml干燥的無水二氯甲烷溶解原料，真空下封管，130℃下反應(yīng)48小時，待反應(yīng)得到的粗產(chǎn)物凝固后再用150ml二氯甲烷溶解，后加入大量的無水乙醚至沉淀不再產(chǎn)生為止，用100ml冷乙醚反復(fù)洗滌沉淀三次后收集沉淀并減壓干燥，所得產(chǎn)品密封保存待用；

(2)取10.2gpeg-pcl(2mmol)、2.8ml三乙胺(20mmol)和3.8ml對甲苯磺酰氯(20mmol)溶于100ml二氯甲烷中，在冰水浴條件下反應(yīng)至tlc檢測反應(yīng)結(jié)果不再變化時停止反應(yīng)，后加入大量的無水乙醚至沉淀不再產(chǎn)生為止，用50ml冷乙醚反復(fù)洗滌沉淀三次后收集沉淀并常溫干燥得到nh2-peg-pcl，所得產(chǎn)品密封保存待用；

(3)取20mgnh2-peg-pcl充分溶于2ml二氯甲烷中制成重量百分濃度為10mg/ml的溶液；將10mgatezolizumab稀釋于1ml硼酸鹽緩沖液中(ph＝8.0)制成重量百分濃度為10mg/ml的溶液；

(4)加1ml上述稀釋得到的單克隆抗體溶液到10mlnh2-peg-pcl溶液混合；

(5)攪拌條件下，將200ul25wt％戊二醛溶液緩慢的加入上述溶液；

(6)反應(yīng)20h，加入1mol/l乙醇胺至體系不再發(fā)生變化為止；

(7)離心，收集納米粒子，用10ml硼酸鹽緩沖液(0.2mol/l，ph＝8.0)沖洗三次，凍干，得到基于pd-l1抗體的納米粒子。

實驗例1：連接的驗證

應(yīng)用x射線光電子能譜分析(xps)的方法，比較peg-pcl原材料與實施例1連接抗體后的基于pd-l1抗體的納米粒子材料中n元素的變化，比較圖1和圖2可發(fā)現(xiàn)，抗體連接成功。如圖3所示，顯示基于pd-l1抗體的納米粒子為球形，形態(tài)較均一，粒徑150nm左右。

實驗例2：peg-pcl-pd-l1抗體與peg-pcl對腫瘤細(xì)胞的毒作用

將peg-pcl-pd-l1ab與peg-pcl分別作用于胃癌細(xì)胞系bgc823(見圖4)和肺癌細(xì)胞系a549(見圖5)，除低濃度(50ug/ml)時，peg-pcl和peg-pcl-pd-l1mab的細(xì)胞毒作用不具有統(tǒng)計學(xué)差異，其余4個濃度時，peg-pcl-pd-l1mab的細(xì)胞毒作用明顯強(qiáng)于peg-pcl(p<0.01)，表明通過本發(fā)明的方法制備得到的基于pd-l1抗體的納米粒子能發(fā)揮正常的生物學(xué)活性。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。