生物可降解交聯(lián)納米藥物凍干粉的制備方法與流程

本發(fā)明屬于聚合物納米藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于交聯(lián)納米藥物凍干粉的制備方法，得到的凍干粉制劑再分散性能優(yōu)異。

背景技術(shù)：

隨著近幾十年納米技術(shù)的發(fā)展，交聯(lián)納米藥物憑借其腫瘤選擇性和低毒副作用成為治療癌癥的常見藥物。但是多數(shù)納米藥物以液態(tài)形式存在，長期保存可能會引起藥物性質(zhì)的改變和泄漏。為了克服交聯(lián)納米藥物制劑長期儲存時的物理化學(xué)不穩(wěn)定性問題，可將其冷凍干燥，給藥前再以適當(dāng)介質(zhì)水化重新分散成納米藥物懸液。然而，冷凍和干燥工藝可能會影響凍干產(chǎn)品的性狀，比如將導(dǎo)致納米藥物聚集與融合，同時也可能伴隨著藥物的泄漏。為了有效抑制納米藥物的聚集與融合，防止藥物在再分散過程中的泄漏，加入凍干保護(hù)劑是最直接有效的方法。

另一方面，側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的碳酸酯單體可以與其他單體共聚結(jié)合或者不結(jié)合靶向分子形成藥物載體，用于藥物循環(huán)輸送；但是現(xiàn)有技術(shù)僅有液體藥物的報道，因?yàn)榫酆衔锾赜械慕Y(jié)構(gòu)導(dǎo)致常規(guī)方式無法制得凍干制劑，尤其是采用現(xiàn)有加入凍干劑的方式，雖然會形成粉劑，但是再次分散后會極大破壞載體，包括載藥能力、循環(huán)能力等，實(shí)際無法應(yīng)用；因此現(xiàn)有技術(shù)沒有有關(guān)生物可降解交聯(lián)納米藥物凍干粉制備方法的報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于交聯(lián)納米藥物系統(tǒng)凍干粉的制備方法，通過冷凍干燥即可得到物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的凍干粉制劑，有效抑制納米藥物的聚集與融合，防止藥物在再分散過程中的泄漏，解決現(xiàn)有納米藥物儲存時間短、使用不便等缺陷。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種生物可降解交聯(lián)納米藥物凍干粉的制備方法，包括以下步驟，將小分子加入交聯(lián)納米藥物懸浮液中；然后在液氮中冷卻后冷凍干燥，得到生物可降解交聯(lián)納米藥物凍干粉；所述小分子包括甘露醇，還包括蔗糖、葡萄糖、海藻糖中的一種或幾種；所述小分子與交聯(lián)納米藥物的質(zhì)量比為（7.5～20）∶100；所述交聯(lián)納米藥物包括生物可降解聚合物以及藥物；所述生物可降解聚合物由側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的碳酸酯單體制備得到。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種納米藥物凍干制劑的制備方法，包括以下步驟，將小分子加入交聯(lián)納米藥物懸浮液中；然后在液氮中冷卻后冷凍干燥，得到生物可降解交聯(lián)納米藥物凍干粉；將生物可降解交聯(lián)納米藥物凍干粉進(jìn)行包裝，比如包裝袋、包裝瓶，得到納米藥物凍干制劑；所述小分子包括甘露醇，還包括蔗糖、葡萄糖、海藻糖中的一種或幾種；所述小分子與交聯(lián)納米藥物的質(zhì)量比為（7.5～20）∶100；所述交聯(lián)納米藥物包括生物可降解聚合物以及藥物；所述生物可降解聚合物由側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的碳酸酯單體制備得到。

上述技術(shù)方案中，所述交聯(lián)納米藥物懸浮液為交聯(lián)納米藥物水懸浮液或者交聯(lián)納米藥物緩沖液懸浮液；所述交聯(lián)納米藥物懸浮液的濃度為5～15mg/ml，優(yōu)選10mg/ml。

上述技術(shù)方案中，所述小分子為甘露醇與蔗糖；優(yōu)選甘露醇與蔗糖的質(zhì)量比為1∶（1～1.5），進(jìn)一步優(yōu)選1。

上述技術(shù)方案中，所述小分子與交聯(lián)納米藥物的質(zhì)量比為（14～18）∶100。

上述技術(shù)方案中，液氮冷卻時間為30～45分鐘；冷凍干燥的冷阱溫度為-53℃，時間為8～48小時。本發(fā)明限定原料比例結(jié)合制備工藝，得到的側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的生物可降解聚合物負(fù)載的藥物凍干粉性能優(yōu)異，無泄漏，再分散能力優(yōu)異。

上述技術(shù)方案中，所述生物可降解聚合物由側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的碳酸酯單體、其他單體、親水高聚物、靶向分子制備得到；或者所述生物可降解聚合物由側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的碳酸酯單體、其他單體、親水高聚物制備得到。

上述技術(shù)方案中，所述親水高聚物為親水鏈段，碳酸酯單體、其他單體鏈段為疏水鏈段；親水高聚物為聚乙二醇或者端基官能化的聚乙二醇，比如聚乙二醇單甲醚（meo-peg-oh，mn=5.0kg/mol，mw/mn=1.03）、馬來酰亞胺活化的聚乙二醇（mal-peg-oh，mn=7.5kg/mol，mw/mn=1.04）；其他單體為三亞甲基碳酸酯（tmc）、丙交酯（la）和己內(nèi)酯（cl）；側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的碳酸酯單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

上述技術(shù)方案中，所述藥物為親水藥物比如鹽酸阿霉素、硫酸長春新堿、鹽酸伊立替康，也可以為疏水藥物比如紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素。

上述技術(shù)方案中，所述生物可降解聚合物為聚合物膠束或者聚合物囊泡結(jié)構(gòu)，優(yōu)選聚合物囊泡結(jié)構(gòu)；本發(fā)明通過調(diào)節(jié)親水/疏水鏈段比例可得到囊泡結(jié)構(gòu)的交聯(lián)納米藥物，活性藥物被包裹，結(jié)合冷凍干燥工藝，得到的凍干粉可避免出現(xiàn)聚集或藥物的泄漏。

本發(fā)明中，由側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的碳酸酯單體與其他單體共聚，或者再結(jié)合靶向分子或者親水高聚物，得到側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的生物可降解聚合物；得到的聚合物結(jié)構(gòu)中，疏水鏈段包括側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的碳酸酯單體結(jié)構(gòu)單元與其他單體結(jié)構(gòu)單元，親水高聚物構(gòu)成親水鏈段，限定疏水鏈段的總分子量與親水鏈段分子量的比例以及疏水鏈段中不同結(jié)構(gòu)單元的比例，可以得到不同結(jié)構(gòu)的納米藥物。當(dāng)疏水鏈段的總分子量為親水鏈段分子量的0.3～1.5倍，側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的碳酸酯單體結(jié)構(gòu)單元的總分子量為其他單體結(jié)構(gòu)單元的總分子量與側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的碳酸酯單體結(jié)構(gòu)總分子量之和的15%～60%，得到納米膠束結(jié)構(gòu)；當(dāng)疏水鏈段的總分子量為親水鏈段分子量的1.6～7倍，側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的碳酸酯單體結(jié)構(gòu)單元的總分子量為其他單體結(jié)構(gòu)單元的總分子量與側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的碳酸酯單體結(jié)構(gòu)總分子量之和的8%～30%，得到納米囊泡結(jié)構(gòu)。

上述技術(shù)方案中，所述靶向分子為多肽（如crgd、cngq、cpp44）、抗體、葉酸等；親水聚合物為聚乙二醇，包括端基為甲氧基的和活性官能團(tuán)修飾的。在親水聚合物存在下，制備的聚合物中，親水鏈段的分子量為3000-10000da；比如本發(fā)明的聚合物可以為以下結(jié)構(gòu)：

上述技術(shù)方案中，在室溫空氣下將小分子加入交聯(lián)納米藥物懸浮液中。

本發(fā)明通過限定條件冷凍干燥后得到納米藥物的凍干粉制劑解決了現(xiàn)有納米藥物需要復(fù)雜和苛刻的條件，比如保質(zhì)期短、使用不便等缺陷；而且得到的凍干粉制劑沒有出現(xiàn)聚集或藥物的泄漏。

本發(fā)明首次公開了一種交聯(lián)納米藥物凍干粉的制備方法，通過限定交聯(lián)納米藥物懸浮液濃度以及小分子與藥物的比例，可以制備凍干粉制劑，凍干粉可以長期穩(wěn)定儲存，加水或者其他緩沖液重新分散即可使用，粒徑變化小、藥物無泄漏，符合醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

附圖說明

圖1為實(shí)施例一中共聚物peg-p(tmc-dtc)的核磁共振譜圖；

圖2為實(shí)施例一中共聚物cpp44-peg-p(tmc-dtc)核磁共振譜圖；

圖3為實(shí)施例一中共聚物peg-p(tmc-dtc)的gpc圖；

圖4為實(shí)施例一中共聚物cpp44-peg-p(tmc-dtc)的gpc圖；

圖5為實(shí)施例一中納米藥物cpp44-ps-vcr的粒徑分布圖；

圖6為實(shí)施例一中納米藥物cpp44-ps-vcr的穩(wěn)定性測試圖；

圖7為實(shí)施例一中納米藥物cpp44-ps-vcr的電子透射電鏡圖；

圖8為聚合物囊泡對k562細(xì)胞的流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（a）和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果（b）圖；

圖9為聚合物囊泡對aml-2細(xì)胞的流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（a）和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果（b）圖；

圖10為ps-vcr和cpp44-ps-vcr對aml-2細(xì)胞(a)和mcf-7細(xì)胞(b)的毒性結(jié)果圖；

圖11為cpp44-ps-vcr、ps-vcr和游離vcr在荷aml-2瘤小鼠體內(nèi)的抗腫瘤結(jié)果圖；

圖12為荷aml-2瘤小鼠經(jīng)各組治療20天后各主要器官的h&e染色切片圖。

具體實(shí)施方式

原料與試劑

聚乙二醇單甲醚（meo-peg-oh，mn=5.0kg/mol，mw/mn=1.03，fluka），使用前經(jīng)甲苯共沸除水；馬來酰亞胺活化的聚乙二醇（mal-peg-oh，mn=7.5kg/mol，mw/mn=1.04，北京健凱科技有限公司），購買后直接使用；三亞甲基碳酸酯（tmc，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司），使用前經(jīng)甲苯重結(jié)晶；急性髓性白血病細(xì)胞aml-2和慢性髓性白血病細(xì)胞k562均從中科院上海細(xì)胞庫購買。磷酸二苯酯（dpp，>99.0%，tci）、硫酸長春新堿（98%，美侖生物技術(shù)有限公司）、cpp44多肽（98%，強(qiáng)耀生物有限公司）、谷胱甘肽（gsh，99%，roche）、4,6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi，碧云天）、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（mtt，碧云天生物技術(shù)公司）等購買后直接使用。二氯甲烷（dcm，ar，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）和甲苯（ar，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）經(jīng)溶劑純化系統(tǒng)（innovativetechnologyltd.）純化后使用。

儀器與表征

核磁共振氫譜（¹hnmr）由美國瓦里安（unityinova）600mhz超導(dǎo)核磁共振譜儀，采用氘代氯仿（cdcl3）或氘代二甲亞砜（dmso-d6）為溶劑，化學(xué)位移以溶劑峰為參考標(biāo)準(zhǔn)。共聚物的分子量和分子量分布使用waters1515凝膠滲透色譜儀（gpc）測定，以dmf為流動相，流動速率為1.0ml/min，溫度為30oc，采用一系列單分散線性聚甲基丙烯酸甲酯（pmma）作為標(biāo)樣。囊泡粒徑和粒徑分布通過zetasizernano-zs動態(tài)光散射儀（英國malvern公司）測定，采用波長為633nm的he/ne背散射激光光源。透射電子顯微鏡使用hitachiht7700tem，加速電壓為120kv。將10μl聚合物囊泡樣品溶液（0.2mg/ml）滴在碳支撐膜上，并用1wt.%磷鎢酸溶液染色1分鐘。納米藥物的載藥量用紫外分光光度計檢測硫酸長春新堿在296nm的吸收來測定。共聚焦激光顯微鏡（clsm）圖片使用tcssp5共聚焦系統(tǒng)（leica）拍攝。流式細(xì)胞術(shù)使用facscalibur流式細(xì)胞儀（美國bd公司）測量。

實(shí)施例一

cpp44-ps-vcr凍干粉制劑由聚合物囊泡納米藥物cpp44-ps-vcr懸浮液添加甘露醇和蔗糖后通過適當(dāng)?shù)睦鋬龈稍镏频?，該納米藥物由共聚物cpp44-peg-p(tmc-dtc)和peg-p(tmc-dtc)(w/w10/90)自組裝形成囊泡后通過ph梯度法裝載硫酸長春新堿得到。

本實(shí)施例涉及的聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下，表征如表1：

交聯(lián)納米藥物cpp44-ps-vcr由共聚物聚乙二醇-b-聚（三亞甲基碳酸酯-co-二硫三亞甲基戊環(huán)碳酸酯）（peg-b-p(tmc-co-dtc)）和cpp44修飾的共聚物（cpp44-peg-b-p(tmc-co-dtc)）在自組裝形成囊泡后通過ph梯度法主動裝載硫酸長春新堿（vcr）而形成。共聚物peg-b-p(tmc-co-dtc)和cpp44-peg-b-p(tmc-co-dtc)由三亞甲基碳酸酯（tmc）和二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯（dtc）通過開環(huán)聚合得到。

首先，mal-peg-b-p(tmc-co-dtc)是以mal-peg為大分子引發(fā)劑、由三亞甲基碳酸酯（tmc）和二硫戊環(huán)三亞甲基碳酸酯（dtc）開環(huán)聚合得到。具體地說，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將mal-peg-oh（mn=7.5kg/mol，75mg，10μmol），tmc（150mg，1.2mmol）和dtc（20mg，0.11mmol）溶在1.1ml無水二氯甲烷中，隨后加入磷酸二苯酯（dpp，25mg，100μmol）在密閉反應(yīng)器中30℃條件下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，在冰乙醚中沉淀兩次，抽濾并真空干燥過夜。產(chǎn)率：94%。¹hnmr(600mhz,cdcl3,ppm):peg:δ3.64;tmc:δ2.06,4.24;dtc:δ3.02,4.19;mal:δ7.0。mn(¹hnmr)=24.4kg/mol。mn(gpc)=30.9kg/mol,mw/mn=1.12。最后，得到的mal-peg-b-p(tmc-co-dtc)（100mg，4μmol）在5ml的dmf中與多肽cpp44（10mg，4.3μmol）室溫下反應(yīng)48h，最終用去離子水透析后得到產(chǎn)物cpp44-peg-b-p(tmc-co-dtc)。產(chǎn)率：98%。cpp44的接枝率由bca蛋白試劑盒（thermoscientific）檢測獲得，接枝率為96%。

cpp44-peg-b-p(tmc-co-dtc)是由馬來酰亞胺活化的聚乙二醇（mal-peg-oh）作為大分子引發(fā)劑、開環(huán)聚合tmc和dtc得到mal-peg-b-p(tmc-co-dtc)，然后與cpp44-sh邁克爾加成反應(yīng)得到。而peg-b-p(tmc-co-dtc)是由聚乙二醇單甲醚（ch3o-peg-oh）作為大分子引發(fā)劑聚合tmc和dtc得到，產(chǎn)率：92%。疏水鏈段p(tmc-co-dtc)的分子量可以通過¹hnmr來表征，參見圖1、圖2。從表1可以看出，peg-b-p(tmc-co-dtc)和mal-peg-b-p(tmc-co-dtc)的數(shù)均分子量跟設(shè)計的分子量都很接近，分子量分布也很窄，參見圖3、圖4，體現(xiàn)了很好的控制性。而且，共聚物的親水段和疏水段的比例為23wt.%，更傾向于形成囊泡。

表1peg-b-p(tmc-co-dtc)和mal-peg-b-p(tmc-co-dtc)的表征

^a由¹hnmr測得；^b由gpc測得。

往900μl的pb溶液（10mm，ph4.0）中注射100μl的按特定比例混合的peg-p(tmc-dtc)/cpp44-peg-p(tmc-dtc)的dmf溶液（10mg/ml）。靜置4小時后，用飽和磷酸氫二鈉溶液將囊泡溶液的ph調(diào)至7.4。然后立即分別加入10、20、30或40μl的濃度為10mg/ml的硫酸長春新堿溶液（對應(yīng)理論載藥量分別為9.1、16.7、23.1和28.6wt.%）。在37℃搖床中孵育5小時后，在pb介質(zhì)中透析5小時，更換介質(zhì)4次以上，整個過程中避光。dlc及dle通過紫外分光光度計（297nm）來測定。

納米藥物cpp44-peg-p(tmc-dtc)的粒徑以及粒徑分布通過動態(tài)光散射（dls）測得。其囊泡膜的結(jié)構(gòu)通過透射電子顯微鏡照片來確定，在制備聚合物囊泡時即在溶液中加入0.1mg/ml的磷鎢酸溶液為囊泡內(nèi)腔著色，樣品在碳支撐膜上揮發(fā)干燥之前再一次用1%的磷鎢酸溶液為囊泡膜著色，溶液中游離的磷鎢酸用二次水清洗兩次去除。

cpp44-peg-p(tmc-dtc)的穩(wěn)定性分別在pbs和加入10%的胎牛血清（fbs）中孵育6小時，并用dls記錄其粒徑的變化來表征。而在模擬細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境下的快速解交聯(lián)響應(yīng)性通過向用pb（ph7.4，10mm）稀釋后的聚合物囊泡溶液（0.1mg/ml）中加入谷胱甘肽（gsh，10mm），同樣孵育6小時后通過dls來表征其粒徑變化。聚合物囊泡納米藥物是利用上述得到的共聚物自組裝后通過ph梯度法主動裝載硫酸長春新堿而得到，該納米藥物的流體力學(xué)大小在90~100nm，而且分布較窄（多分散指數(shù)為0.11），見圖5。納米藥物在pbs中和含有10%牛血清蛋白（fbs）緩沖介質(zhì)中孵育6小時后依然保持較高的穩(wěn)定性，見圖6，同樣佐證了其交聯(lián)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。而在含有10mm谷胱甘肽（gsh）的還原環(huán)境中孵育6小時后，聚合物囊泡的粒徑和粒徑分布發(fā)生較大的變化，說明其具有還原敏感性。透射電子顯微鏡照片（tem）也證實(shí)了該納米前藥的膜/內(nèi)腔結(jié)構(gòu)，同時顯示囊泡尺寸也與dls結(jié)果相近，見圖7。

紫外分光光度計的測試結(jié)果顯示該納米藥物具有較高的載藥量和載藥效率，理論載藥量為28.6wt.%時，實(shí)際載藥量達(dá)到21.3wt.%，見表2。

表2cpp44-ps-vcr納米藥物的表征

^a由紫外分光光度計測得；^b由動態(tài)光散射測得。

除最簡單的的細(xì)菌及微生物以外，絕大多數(shù)物質(zhì)凍干時都易于聚集或破壞，為了防止凍干物的聚集或破壞，必須加入保護(hù)劑來維持；但是現(xiàn)有技術(shù)針對表面修飾peg的納米粒子，冷凍干燥后會出現(xiàn)聚集而無法復(fù)溶。

將上述得到的納米藥物cpp44-ps-vcr濃縮至10mg/ml，然后加入小分子粉末，10分鐘內(nèi)溶解完全；最后在液氮中快速冷凍（15～30分鐘），后放冷凍干燥機(jī)-50℃干燥48小時后取出密封保存，全程避光。使用前加入1ml水溶解后用pb/pbs稀釋后使用。

設(shè)計添加的小分子量分別為5%、10%和15%，以凍干后外觀、再分散性和在分散后粒徑作為主要考察指標(biāo)，同時以不加任何小分子的樣品作為對照。由表3可知，小分子的加入對聚合物囊泡的凍干產(chǎn)品有明顯的影響，并且雖然幾種小分子性質(zhì)類似，但是依然存在明顯差別：蔗糖和海藻糖可以很好地保護(hù)囊泡，使其凍干后可以重新分散，而甘露醇不能保護(hù)囊泡使其再分散，但是它可以形成外觀蓬松的樣品。

研究甘露醇/蔗糖合用對凍干產(chǎn)品質(zhì)量的影響，同樣考察凍干樣品的外觀、再分散性和再分散后粒徑變化。表4研究結(jié)果表明，當(dāng)甘露醇/蔗糖比例接近1時，再分散后尺寸變化小，保護(hù)效果較好；表5結(jié)果顯示，甘露醇/蔗糖比例為1、小分子含量在14~18wt.%時，聚合物囊泡凍干樣品外觀蓬松而且再分散后粒徑變化最小，保護(hù)效果最好。在此條件下，聚合物囊泡納米藥物凍干后外觀蓬松，再分散后粒徑~116nm，由紫外分光光度計測得藥物泄漏量<2%。從而本發(fā)明通過限定條件，解決了較少量的凍干保護(hù)劑不能使囊泡再分散，而過多量的凍干保護(hù)劑將導(dǎo)致囊泡再分散后尺寸變化較大的問題；更主要解決了現(xiàn)有技術(shù)無法制備側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的聚碳酸酯聚合物交聯(lián)納米藥物凍干粉的缺陷。

表3單一小分子對聚合物囊泡凍干的影響

注：*代表1分鐘內(nèi)溶解，**代表3分鐘內(nèi)溶解，***代表10分鐘內(nèi)溶解，+代表粒徑增大值

表4甘露醇/蔗糖合用對聚合物囊泡凍干的影響

注：“+”代表粒徑增大值

表5甘露醇/蔗糖合用用量對聚合物囊泡凍干的影響

實(shí)施例二

根據(jù)實(shí)施例一，制備聚合物peg-p(tmc-dtc)和nhs-peg-p(tmc-dtc)，從后者制備靶向分子為ge11多肽的靶向聚合物ge11-peg-p(tmc-dtc)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

用peg-p(tmc-dtc)和ge11-peg-p(tmc-dtc)混合制備囊泡、通過ph梯度法裝載dox×hcl進(jìn)一步制備得到靶向交聯(lián)納米藥物ge11-ps-dox，為粒徑90-100納米左右的囊泡結(jié)構(gòu)；載藥量dlc可達(dá)10-20wt.%；研究結(jié)果顯示，ge11-ps-dox在甘露醇和蔗糖合用（質(zhì)量比為1，小分子用量為15wt.%）的條件下，凍干樣品呈蓬松粉末，用去離子水或緩沖介質(zhì)可快速溶解（小于2分鐘）重新分散為粒徑不超過130納米的囊泡。

實(shí)施例三

根據(jù)實(shí)施例一，將tmc更換為cl，制備聚合物peg-p(cl-dtc)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

通過疏水作用力裝載dtx進(jìn)一步制備得到交聯(lián)納米藥物ms-dtx，為粒徑30-50納米左右的膠束結(jié)構(gòu)；載藥量dlc為5~15wt.%；研究結(jié)果顯示，ge11-ps-dox在甘露醇和蔗糖合用（質(zhì)量比為1，小分子用量為16wt%）的條件下，凍干樣品呈蓬松粉末，用去離子水或緩沖介質(zhì)可以快速溶解（小于2分鐘）重新分散為粒徑不超過60納米的囊泡。

實(shí)施例四

根據(jù)實(shí)施例一，將tmc更換為la制備聚合物peg-p(la-dtc)和mal-peg-p(la-dtc)，從后者制備靶向分子為anti-cd19抗體的靶向聚合物anti-cd19-peg-p(la-dtc)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

進(jìn)一步制備得到交聯(lián)納米藥物與靶向交聯(lián)納米藥物，為粒徑50-70納米左右的囊泡結(jié)構(gòu)；在甘露醇和蔗糖合用（質(zhì)量比為1，小分子用量為17%）的條件下，凍干樣品呈蓬松粉末，用去離子水或緩沖介質(zhì)可快速溶解（小于2分鐘）重新分散為粒徑不超過85納米的囊泡。

實(shí)施例五

根據(jù)實(shí)施例一，將tmc更換為cl，制備聚合物peg-p(cl-dtc)和mal-peg-p(cl-dtc)，從后者制備靶向分子為葉酸（使用巰基官能化的葉酸）的靶向聚合物fa-peg-p(cl-dtc)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

進(jìn)一步制備得到靶向納米藥物，為粒徑70-90納米左右的囊泡結(jié)構(gòu)；裝載疏水藥物ptx，載藥量dlc可達(dá)12wt.%；在甘露醇和蔗糖合用（質(zhì)量比為1∶1.5，小分子用量為15wt%）的條件下，凍干樣品呈蓬松粉末，用去離子水或緩沖介質(zhì)可快速溶解（小于2分鐘）重新分散為粒徑不超過110納米的囊泡。

以上可說明，本發(fā)明將交聯(lián)納米藥物通過限定條件進(jìn)行冷凍干燥，給藥前再以適當(dāng)介質(zhì)水化重新分散成納米藥物懸液，解決了現(xiàn)有技術(shù)針對側(cè)鏈含有二硫戊環(huán)結(jié)構(gòu)的聚碳酸酯聚合物的冷凍和干燥工藝會影響凍干產(chǎn)品的性狀，將導(dǎo)致納米藥物聚集與融合，同時也伴隨著藥物的泄漏的問題；還解決了納米藥物制劑長期儲存時的物理化學(xué)不穩(wěn)定性問題。以下以實(shí)施例一的生物可降解聚合物交聯(lián)納米藥物凍干粉（質(zhì)量比為1∶1，14wt.%）說明本發(fā)明制備的凍干粉再分散后取得的醫(yī)學(xué)效果。

流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡表征細(xì)胞內(nèi)吞及細(xì)胞內(nèi)釋放

用親水dox×hcl作為藥物模型考察細(xì)胞內(nèi)吞和釋放行為，dox×hcl通過ph梯度法裝載到囊泡親水內(nèi)腔，在流式細(xì)胞儀測試中，將aml-2細(xì)胞或k562細(xì)胞在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)（1×10⁶細(xì)胞/孔）培養(yǎng)24小時后，加入100μl的ps-dox或cpp44-ps-dox的pbs溶液（dox濃度為10μg/ml）孵育0.5小時。得到的細(xì)胞懸浮液在1000×g離心3分鐘，用pbs洗兩次，再次分散在500μlpbs中，1小時內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀（bdfacscalibur，bectondickinson)測試，用cellquest軟件圈取10000個細(xì)胞分析。

細(xì)胞內(nèi)吞及細(xì)胞內(nèi)藥物釋放行為通過clsm照片觀察得到。將aml-2或k562細(xì)胞鋪于含有細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板里（1×10⁵細(xì)胞/孔）培養(yǎng)24小時后，加入50μl的ps-dox或cpp44-ps-dox的pbs溶液（dox濃度為10μg/ml）。孵育2/4小時后，將培養(yǎng)基移除用pbs清洗兩遍。用dapi染細(xì)胞核15分鐘后用pbs清洗兩次。熒光圖片由clsm（tcssp5）拍攝獲得。

由流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，熒光強(qiáng)度隨囊泡中cpp44含量從0到10mol%增加而增強(qiáng)，但cpp44增加到20mol%、30mol%時并沒有比10mol%有更明顯的增強(qiáng)（圖8a），所以在接下來的試驗(yàn)中，靶向組cpp44-ps中cpp44的含量均為10mol%。激光共聚焦掃描顯微鏡（clsm）拍攝的照片顯示，孵育2/4小時后，cpp44-ps組細(xì)胞核內(nèi)dox·hcl熒光很強(qiáng)，明顯強(qiáng)于無靶向?qū)φ战Mps-dox（圖8b）。這些結(jié)果證實(shí)cpp44-ps能主動靶向到k562細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)快速釋放出藥物。

細(xì)胞cpp44-ps對急性髓性白血病細(xì)胞aml-2的體外抗腫瘤活性，與k562細(xì)胞類似，如圖9（為聚合物囊泡對aml-2細(xì)胞的流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（a）和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果（b）圖）所示，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果都顯示cpp44-ps可以主動靶向到aml-2細(xì)胞，攝取量更多。

毒性試驗(yàn)（mtt）

游離的硫酸長春新堿和納米藥物的mtt實(shí)驗(yàn)選用兩種細(xì)胞，一種是人急性髓系白血病細(xì)胞（aml-2），另外一種是人乳腺癌細(xì)胞（mcf-7）。aml-2或mcf-7細(xì)胞均在含有10%fbs、1%青鏈霉素（100iu/ml）的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鋪在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞密度分別為1.5×10⁴細(xì)胞/孔（aml-2）和5×10³細(xì)胞/孔（mcf-7）。細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，加入10μl樣品（vcr、ps-vcr或cpp44-ps-vcr）的pb溶液（10mm，ph7.4）。孵育4小時后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育44小時后，加入10μl的3-（4，5-二甲基-噻唑基）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（mtt）溶液（5mg/ml)孵育4小時后，除去培養(yǎng)基，加入150μldmso溶解活細(xì)胞產(chǎn)生的mtt-甲瓚。酶標(biāo)儀測定各孔在492nm的吸收，以加了mtt的培養(yǎng)基孔為零點(diǎn)。每個實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平行做四組（n=4）。

通過mtt實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評估cpp44-ps-vcr納米藥物的抗癌活性。如圖10（為ps-vcr和cpp44-ps-vcr對aml-2細(xì)胞(a)和mcf-7細(xì)胞(b)的毒性結(jié)果圖）所示，cpp44-ps-vcr納米藥物對aml-2細(xì)胞具有很強(qiáng)的抑制效果，毒性明顯強(qiáng)于非主動靶向?qū)φ战Mps-vcr。此外，還選取了mcf-7細(xì)胞作為陰性對照，結(jié)果顯示cpp44-ps-vcr與ps-vcr具有相近的細(xì)胞毒性。上述結(jié)果表明，對于mcf-7細(xì)胞，非靶向組和cpp44組的細(xì)胞內(nèi)吞和細(xì)胞毒性沒有明顯差別。而對于k562細(xì)胞和aml-2細(xì)胞，具有更高的細(xì)胞攝取量和更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，說明該靶向納米藥物具有細(xì)胞選擇性穿透效果。

納米藥物對荷瘤小鼠的治療實(shí)驗(yàn)

所有動物實(shí)驗(yàn)均遵守蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心和蘇州大學(xué)動物保護(hù)與使用條例。aml-2腫瘤模型通過在nude小鼠（18-20g，5周齡）右后背皮下注射20mm³的aml-2腫塊建立。大概十天過后，當(dāng)腫瘤體積生長至100-200mm³時，此天定義為第0天，并將荷aml-2腫瘤小鼠隨機(jī)分成4組（每組平行5只）。分別每四天尾靜脈注射200μl的cpp44-ps-vcr(1mgvcrequiv./kg)，ps-vcr(1mgvcrequiv./kg)，freevcr(1mg/kg)和pbs，其中cpp44-ps-vcr和ps-vcr總共給藥四次，freevcr組由于小鼠的耐受問題第二次給藥后停止治療。每兩天用游標(biāo)卡尺測量一次腫瘤體積，并由公式v=0.5×l×w²計算得到腫瘤體積，其中l(wèi)和w分別代表腫瘤的長和寬。相對腫瘤體積為v/v0（v0為腫瘤第0天時體積）。每兩天稱量一次小鼠體重，計算相對于最初體重的腫瘤相對體重變化。到第20天時，將腫瘤取出拍照稱量，并隨機(jī)解剖一只將心、肝和腎取出用于組織學(xué)分析。組織學(xué)分析時，組織用4%的福爾馬林溶液固定并包埋于石蠟中，載玻片上的厚度約4mm的組織切片用蘇木紫和伊紅（h&e）染色后由載玻片封片，用正置光學(xué)顯微鏡（olympusbx41）拍攝。

在荷aml-2腫瘤的小鼠模型上評估了納米藥物和游離vcr的抗腫瘤活性。計劃每四天給一次藥，總共給藥四次，給藥劑量為1.0mg/kg。但是游離藥物組接受兩次治療后體重急劇下降，8天內(nèi)體重下降超過10%，同時皮膚脫落嚴(yán)重，健康狀況堪憂，表現(xiàn)出嚴(yán)重的毒副作用（圖11a），所以第二次給藥后決定放棄繼續(xù)治療。與此相反，ps-vcr和cpp44-ps-vcr治療組的小鼠在整個治療周期內(nèi)沒有出現(xiàn)明顯的體重下降，也未出現(xiàn)蛻皮等現(xiàn)象，說明有或者沒有cpp44主動靶向基團(tuán)，納米藥物的系統(tǒng)毒性都很小。同時，相對腫瘤體積結(jié)果顯示（圖11a），相同劑量下的主動靶向cpp-ps-vcr治療組的抑瘤效果顯著好于非主動靶向ps-vcr組。這說明在特異性細(xì)胞穿膜肽的作用下，納米藥物能夠被白血病細(xì)胞快速內(nèi)吞和釋放出化學(xué)藥物，從而增強(qiáng)治療效果。

從20天后取出的腫塊照片（圖11b）和稱取的腫塊質(zhì)量（圖11c）同樣可以看出cpp-ps-vcr具有更好的抑瘤效果，腫瘤體積較小。受系統(tǒng)性毒性影響，小鼠腫瘤體積隨體重減輕而增長不明顯，腫瘤大小并不能完全反應(yīng)藥效，所以對于游離vcr組的腫瘤大小不做過多的對比和討論。

圖11為cpp44-ps-vcr、ps-vcr和游離vcr在荷aml-2瘤小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性研究結(jié)果圖，vcr劑量均為1mg/kg，游離vcr分別在第0天和第4天給藥，ps-vcr和cpp44-ps-vcr分別在第0，4，8和12天給藥，圖中(a)腫瘤體積變化和小鼠體重變化圖；(b)第20天剝離的腫瘤照片；(c)第20天剝離的腫瘤質(zhì)量。

另外，小鼠主要器官的切片的h&e染色分析結(jié)果參見圖12，圖片通過奧林巴斯bx41正置熒光顯微鏡（olympusbx41）使用40倍物鏡拍攝，各治療組對主要器官都沒有表現(xiàn)出明顯的毒副作用，表明聚合物囊泡的存在形式并沒有引起長春新堿物對心、肝和腎等主要器官毒副作用的增強(qiáng)。

另外，采用甘露醇與葡萄糖或者海藻糖配合后，各種比例下，得到的凍干粉再分散性能較差，粒徑變化超過120nm，而且有不同程度的藥物泄露，不適于實(shí)際應(yīng)用；還采用其他冷凍條件作對比，比如液氮冷卻時間的變化、冷凍干燥參數(shù)的變化，得到的凍干粉再分散后粒徑變化稍大，超過80nm，存在不同程度的藥物泄露，也不適于實(shí)際應(yīng)用。

本發(fā)明通過ph梯度主動載藥法成功制備了生物可降解聚合物囊泡納米藥物，載藥量高達(dá)21.3wt.%，與現(xiàn)有藥物相比，該聚合物囊泡納米藥物具有明顯的優(yōu)勢：（1）該納米藥物在甘露醇/蔗糖合用條件下制備成凍干粉，方便儲存和使用；（2）該納米藥物凍干粉通過硫硫鍵交聯(lián)而具有很好的穩(wěn)定性，在10%血清中依然保持較高的穩(wěn)定性，極大抑制藥物的泄露，降低毒副作用；（3）該納米藥物凍干粉可以主動靶向到aml-2和k562兩種白血病細(xì)胞，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都證明本發(fā)明的凍干粉再分散后具有優(yōu)異的治療效果，特別是與新制備的納米藥物療效一致。因此，本發(fā)明的凍干粉已經(jīng)在諸多方面優(yōu)于臨床上的脂質(zhì)體藥物，特別是通過再分散醫(yī)學(xué)研究證實(shí)本發(fā)明制備的凍干粉沒有出現(xiàn)納米藥物聚集與融合，同時也沒有出現(xiàn)藥物的泄漏，有望作為一種靶向納米藥物用于疾病，比如白血病的治療。