本發(fā)明屬于中藥學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種藥物組合物及其制備方法和在制備防治神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerativediseases，ndd)是以神經(jīng)元進(jìn)行性變性、死亡為基礎(chǔ)的一類慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以影響患者的認(rèn)知功能或運(yùn)動功能為主，主要包括阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)、帕金森病(parkinson’sdisease，pd)、亨廷頓病病(huntingtondisease)、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(spinalcerebellarataxias)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis)及脊髓肌萎縮癥(spinalmuscularatrophy)等。這類疾病的臨床表現(xiàn)、病變特征雖不盡相同，但它們均有的共同特征是：神經(jīng)元的進(jìn)行性變性壞死，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞顯著增殖活化，至今無理想的防治藥物，患者致殘、致死率高。目前該類疾病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，老化、炎癥、遺傳、環(huán)境毒素等多種復(fù)合因素是該類疾病的共同致病因素，病理機(jī)制均包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能受損、軸突傳遞功能障礙、谷氨酸興奮性毒性、活性氧(ros)水平過高、代謝通路受損、線粒體能量產(chǎn)生減少、錯誤折疊蛋白質(zhì)形成增加或降解不充分等。神經(jīng)退行性疾病嚴(yán)重危害人類健康，給患者、家屬和社會帶來了極大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，發(fā)展防治神經(jīng)退行性疾病的藥物備受重視。曼地亞紅豆杉(taxusmadia)原產(chǎn)于美國、加拿大，是一種天然雜交品種。在我國大部分地區(qū)可以栽種，生長快，高度年生長實(shí)測40～90cm，最高可60～70cm，是國內(nèi)紅豆杉(中國紅豆杉、云南紅豆杉等)的300～700％生長量。3～4年生生物量積累為600～800/株·年，5年生時產(chǎn)鮮原料1.5kg以上，可用于提煉紫杉醇。曼地亞紅豆杉葉中除含紫杉醇等小分子活性物質(zhì)外，還發(fā)現(xiàn)曼地亞紅豆杉葉中含有的活性黃酮成分，目前尚未有曼地亞紅豆杉葉中黃酮防治神經(jīng)退行性疾病的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種藥物組合物及其制備方法和在制備防治神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述藥物組合物具有治療神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerativediseases，ndd)的作用，對細(xì)胞的毒副作用小，具有廣泛的應(yīng)用前景。為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：第一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括曼地亞紅豆杉葉提取物和藥學(xué)上可接受的載體，其中，所述曼地亞紅豆杉葉提取物的重量百分比為0.1-99.9％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.8％、1％、2％、5％、8％、10％、13％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％、99％或99.9％。優(yōu)選地，所述曼地亞紅豆杉葉提取物含有黃酮類成分，不含有紫杉烷類成分。本發(fā)明中，曼地亞紅豆杉葉提取物化學(xué)成分眾多，主要富含黃酮類成分，幾乎無紫杉烷類成分，有著傳統(tǒng)中藥復(fù)方配伍使用的效果，作為一種天然藥，相比于單一的藥物，毒副作用小。首次發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述曼地亞紅豆杉提取物具有治療神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerativediseases，ndd)的作用。優(yōu)選地，所述曼地亞紅豆杉葉提取物的重量百分比為1-90％，優(yōu)選為20-85％，進(jìn)一步優(yōu)選為40-80％。優(yōu)選地，所述曼地亞紅豆杉葉提取物為醇提取物和/或中藥浸膏。優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的載體為甘露醇、山梨醇、山梨酸、山梨酸鉀、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素a、維生素c、維生素e、維生素d、氮酮、edta二鈉、edta鈣鈉、一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、一價(jià)堿金屬的醋酸鹽、一價(jià)堿金屬的磷酸鹽、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土溫60-80、司班-80、蠟、羊毛脂、液體石蠟、十六醇、沒食子酸酯類、瓊脂、三乙醇胺、堿性氨基酸、尿素、尿囊素、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、植物油、磷脂、聚乙二醇磷脂、聚乙二醇磷脂衍生物、油酸、油酸鹽、抗氧化劑、或離子絡(luò)合劑中的任意一種或至少兩種的混合物。優(yōu)選地，所述植物油為大豆油、中鏈油、橄欖油、茶油、棕櫚油、當(dāng)歸油、沙棘油、莪術(shù)油、川芎油、薏米仁油、紅花油、花椒油或大蒜油中的任意一種或至少兩種的混合物。優(yōu)選地，所述磷脂為蛋黃卵磷脂、大豆磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、氫化大豆磷脂或人工合成磷脂中的任意一種或至少兩種的混合物。優(yōu)選地，所述聚乙二醇磷脂為聚乙二醇-腦磷脂、聚乙二醇-膽固醇、聚乙二醇-二-脂肪酸甘油酯、聚乙二醇-脂肪酸酯、聚乙二醇-脂肪胺或聚乙二醇-脂肪醇中的任意一種或至少兩種的混合物。優(yōu)選地，所述抗氧化劑為維生素e。優(yōu)選地，所述藥物組合物的劑型為片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑或貼劑中的任意一種或至少兩種的組合。優(yōu)選地，所述曼地亞紅豆杉葉提取物的提取方法為醇提、層析、真空提取、超臨界流體萃取法、超聲提取法、酶法提取、微波提取法、荷電提取法或半仿生提取法中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為醇提與層析組合。優(yōu)選地，所述曼地亞紅豆杉葉提取物的提取方法包括以下步驟：取曼地亞紅豆杉葉進(jìn)行粗粉碎，加醇煎煮，冷卻至室溫，減壓回收至干；對提取物粗品以大孔樹脂柱層析，先以水洗脫去除糖類成分，再以乙醇洗脫；利用聚酰胺柱對乙醇洗脫濃縮物進(jìn)行層析分離，分別以水、30％乙醇、60％乙醇、90％乙醇的洗脫梯度進(jìn)行洗脫。取90％乙醇洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，即得所述曼地亞紅豆杉葉提取物。優(yōu)選地，所述加醇煎煮時，曼地亞紅豆杉葉與醇的重量比為1:(5-15)，例如可以是1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15，優(yōu)選為1:(9-12)，使用過少的醇對曼地亞紅豆杉葉進(jìn)行提取，不利于有效成分的浸出，而過多的醇也并不能繼續(xù)顯著增加有效成分的浸出，反而可能使得其他成分的浸出量增多，從而影響提取物中各成分的配比關(guān)系，進(jìn)而影響其作用效果。優(yōu)選地，所述煎煮的次數(shù)為2-5次，例如可以是2次、3次、4次或5次，優(yōu)選為3次。優(yōu)選地，所述每次煎煮的時間為1-3h，例如可以是1h、1.3h、1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.5h、2.8h或3h，優(yōu)選為2h，煎煮時間太短會使得有效成分不能浸出，影響提取物的作用效果，而煎煮時間太長會破壞有效成分，也會影響各成分的配比關(guān)系，從而影響提取物中各成分之間的君臣佐使的配合關(guān)系，進(jìn)而影響到對于神經(jīng)退行性疾病的治療效果。優(yōu)選地，所述加醇煎煮中醇為甲醇、甲醇水溶液、乙醇或乙醇水溶液中的任意一種或至少兩種的混合物，優(yōu)選甲醇、乙醇、80％甲醇水溶液或70％乙醇水溶液，進(jìn)一步優(yōu)選為70％乙醇水溶液；優(yōu)選地，所述每個洗脫梯度的洗脫體積為3-7倍柱體積，例如可以是3倍柱體積、3.5倍柱體積、4倍柱體積、4.5倍柱體積、5倍柱體積、5.5倍柱體積、6倍柱體積、6.5倍柱體積或7倍柱體積，優(yōu)選為5倍柱體積。優(yōu)選地，所述真空干燥的溫度為20-80℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、25℃、26℃、28℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃，優(yōu)選為30-60℃，進(jìn)一步優(yōu)選為50℃。第二方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的藥物組合物的制備方法，所述制備方法為：將曼地亞紅豆杉葉提取物和藥學(xué)上可接受的載體進(jìn)行混合，使得所述曼地亞紅豆杉葉提取物的重量百分比為0.1-99.9％，得到所述藥物組合物。在本發(fā)明中，可以將所述藥物組合物經(jīng)過本領(lǐng)域已知的制劑工藝制備得到相應(yīng)的劑型。第三方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的藥物組合物在制備防治神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述神經(jīng)退行性疾病包括阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮脊髓側(cè)索硬化癥、亨廷頓病、多發(fā)性硬化癥、脊髓小腦萎縮癥或血管性癡呆病中的任意一種或至少兩種的組合。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)本發(fā)明利用曼地亞紅豆杉葉提取物與藥學(xué)上可接受的載體配合得到藥物組合物，對神經(jīng)退行性疾病具有良好的治療效果，對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的活性的抑制率可達(dá)50％以上，且對lps引起的神經(jīng)炎癥具有抑制作用，對lps引起的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用。(2)本發(fā)明提取的曼地亞紅豆杉葉提取物相比于曼地亞紅豆杉其他部位的提取物具有特定的防治神經(jīng)退行性疾病藥物的作用，經(jīng)過特定的提取工藝，使得提取物中有效成分以及其他輔助成分具有較佳的配合關(guān)系，使得各成分之間很好地發(fā)揮君臣佐使的配合關(guān)系，從而達(dá)到對神經(jīng)退行性疾病的良好治療效果。(3)本發(fā)明的藥物制備工藝簡單，藥效顯著，顯著改善神經(jīng)退行性疾病模型動物的行為障礙，抑制模型動物中腦多巴胺能神經(jīng)元的損傷，減輕膠質(zhì)細(xì)胞的活化，具有治療神經(jīng)退行性疾病的作用，為神經(jīng)退行性疾病的臨床治療提供了更多選擇，具有廣闊的應(yīng)用前景。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1在本實(shí)施例中，通過以下方法來制備藥物組合物：(1)曼地亞紅豆杉提取物的提取取曼地亞紅豆杉葉粗粉500g，每次加10倍量70％乙醇煎煮，每次1h，煎煮3次。煎煮后，冷卻至室溫，減壓回收至干。對提取物粗品以大孔樹脂柱層析，先以5倍柱體積水洗脫去除糖類成分，再以5倍柱體積乙醇洗脫。乙醇洗脫濃縮物再以聚酰胺進(jìn)行柱層析分離，分別以水、30％乙醇、60％乙醇、90％乙醇進(jìn)行洗脫，每個梯度的洗脫體積為5倍柱體積。取90％乙醇洗脫液，減壓濃縮，50℃真空干燥，即得所述曼地亞紅豆杉葉提取物。(2)將提取得到的曼地亞紅豆杉葉提取物與聚乙二醇混合，使得曼地亞紅豆杉葉提取物的重量百分比為60％，后制作成膠囊劑藥物，得到所述藥物組合物。實(shí)施例2在本實(shí)施例中，通過以下方法來制備藥物組合物：(1)曼地亞紅豆杉提取物的提取取曼地亞紅豆杉葉粗粉500g，每次加15倍量80％甲醇煎煮，每次1h，煎煮3次，煎煮后，冷卻至室溫，減壓回收至干。對提取物粗品以大孔樹脂柱層析，先以5倍柱體積水洗脫去除糖類成分，再以5倍柱體積乙醇洗脫。乙醇洗脫濃縮物再以聚酰胺進(jìn)行柱層析分離，分別以水、30％乙醇、60％乙醇、90％乙醇進(jìn)行洗脫，每個梯度的洗脫體積為7倍柱體積。取90％乙醇洗脫液，減壓濃縮，50℃真空干燥，即得所述曼地亞紅豆杉葉提取物。(2)將提取得到的曼地亞紅豆杉葉提取物與山梨醇混合，使得曼地亞紅豆杉葉提取物的重量百分比為80％，而后制作成膠囊劑藥物，得到所述藥物組合物。實(shí)施例3在本實(shí)施例中，通過以下方法來制備藥物組合物：(1)曼地亞紅豆杉提取物的提取取曼地亞紅豆杉葉粗粉500g，每次加5倍量70％乙醇煎煮，每次3h，煎煮2次，煎煮后，冷卻至室溫，減壓回收至干。對提取物粗品以大孔樹脂柱層析，先以5倍柱體積水洗脫去除糖類成分，再以5倍柱體積乙醇洗脫。乙醇洗脫濃縮物再以聚酰胺進(jìn)行柱層析分離，分別以水、30％乙醇、60％乙醇、90％乙醇進(jìn)行洗脫，每個梯度的洗脫體積為3倍柱體積。取90％乙醇洗脫液，減壓濃縮，50℃真空干燥，即得所述曼地亞紅豆杉葉提取物。(2)將提取得到的曼地亞紅豆杉葉提取物與甘露醇混合，使得曼地亞紅豆杉葉提取物的重量百分比為90％，而后制作成膠囊劑藥物，得到所述藥物組合物。實(shí)施例4在本實(shí)施例中，通過以下方法來制備藥物組合物：(1)曼地亞紅豆杉提取物的提取取曼地亞紅豆杉葉粗粉500g，每次加8倍量70％乙醇煎煮，每次2h，煎煮3次，煎煮后，冷卻至室溫，減壓回收至干。對提取物粗品以大孔樹脂柱層析，先以5倍柱體積水洗脫去除糖類成分，再以5倍柱體積乙醇洗脫。乙醇洗脫濃縮物再以聚酰胺進(jìn)行柱層析分離，分別以水、30％乙醇、60％乙醇、90％乙醇進(jìn)行洗脫，每個梯度的洗脫體積為6倍柱體積。取90％乙醇洗脫液，減壓濃縮，50℃真空干燥，即得所述曼地亞紅豆杉葉提取物。(2)將提取得到的曼地亞紅豆杉葉提取物與聚乙二醇磷脂混合，使得曼地亞紅豆杉葉提取物的重量百分比為20％，后制作成膠囊劑藥物，得到所述藥物組合物。實(shí)施例5在本實(shí)施例中對本發(fā)明的藥物組合物對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用進(jìn)行驗(yàn)證，方法如下：bv2細(xì)胞為小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系；griess試劑：以蒸餾水配制0.1％萘乙二胺，以5％磷酸配制1％對氨基苯磺酸，兩者在臨用前以1:1等體積混合；姜黃素，用dmso配制；脂多糖lps，用無菌pbs配制，終濃度為300ng/ml；實(shí)驗(yàn)方法：(1)bv2細(xì)胞于含10％新生牛血清的dmem-f12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37℃，5％co2，95％空氣，100％相對濕度下生長；(2)對數(shù)生長期的bv2細(xì)胞，經(jīng)消化計(jì)數(shù)后，以2×104個/孔接種到96孔板中，24小時后加入受試物，1小時后加入lps，終濃度為300ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)基上清液；(3)取細(xì)胞培養(yǎng)液上液清100μl，加入等體積griess試劑，室溫靜置20min，蒸餾水調(diào)零，于酶標(biāo)儀上在540nm處測定od值，同時以硝酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)品，測定od值，計(jì)算待測樣品中no2-的濃度反映no的濃度。結(jié)果如下表1所示。表1由表中結(jié)果可見，給藥濃度100μg/ml時，本發(fā)明制備的藥物組合物表現(xiàn)出了明顯的抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的活性，抑制率>50％。實(shí)施例6在本實(shí)施例中，對本發(fā)明的藥物組合物對lps引起的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷的抑制作用進(jìn)行考察，方法如下：脂多糖，用無菌pbs配制，終濃度為100ng/ml；姜黃素用dmso配制；實(shí)驗(yàn)方法：(1)原代海馬神經(jīng)元/膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系的建立：孕18d的sd大鼠胚胎，在解剖鏡下分離海馬，用移液管進(jìn)行吹打，直至看不到組織塊為止，過濾后接種于24孔板中；(2)細(xì)胞給藥處理：上述原代細(xì)胞培養(yǎng)7d后，分別與受試物共孵育，3h后加入刺激劑lps100ng/ml，5h后取培養(yǎng)基用elisa試劑盒測il-1β和tnf-α；(3)細(xì)胞經(jīng)藥物處理7d后，收集培養(yǎng)基用ldh檢測試劑檢測ldh。結(jié)果如下表2所示。表2受試物劑量il-1β(pg/ml)tnf-α(pg/ml)ldh(pg/ml)實(shí)施例1的藥物組合物100μg/ml100.9143.1165.2實(shí)施例2的藥物組合物100μg/ml114.5135.6198.7實(shí)施例3的藥物組合物100μg/ml88.1156.1201.4實(shí)施例4的藥物組合物100μg/ml137.6127.5160.2姜黃素10-5m92.4122.3178.7模型組(lps)240.8268.7798.0空白組0046.2表中結(jié)果顯示，本發(fā)明藥物可明顯抑制在lps刺激下出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)，降低培養(yǎng)基中il-1β、tnf-α水平，在100μg/ml濃度下，對炎癥的抑制程度與陽性對照藥姜黃素(10-5m)相當(dāng)；海馬神經(jīng)元/膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系在lps的刺激下，ldh的釋放量明顯增加，神經(jīng)元出現(xiàn)了明顯損傷，本發(fā)明藥物可明顯抑制ldh的釋放，對神經(jīng)元有保護(hù)作用，在100μg/ml濃度下，對ldh釋放的抑制程度與陽性對照藥姜黃素相當(dāng)。綜上所述，本發(fā)明的紅豆杉葉提取物作為一種天然藥物，顯著改善神經(jīng)退行性疾病模型動物的行為障礙，抑制模型動物中腦多巴胺能神經(jīng)元的損傷，減輕膠質(zhì)細(xì)胞的活化，具有治療神經(jīng)退行性疾病的作用，為神經(jīng)退行性疾病的臨床治療提供了更多選擇，具有廣闊的應(yīng)用前景。申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用，但本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施例，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述實(shí)施例才能實(shí)施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12