一種天然血紅蛋白類血液代用品的脫氧方法和制備工藝與流程

本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種天然血紅蛋白類血液代用品的脫氧方法和制備工藝。

背景技術(shù)：

血液是為組織輸送營養(yǎng)并從組織中移去排泄廢物的工具。血液由紅細(xì)胞(rbc或紅血球)、白細(xì)胞(wbc)、血小板和血漿組成。紅細(xì)胞約占血液中細(xì)胞的99％，其主要功能是為組織輸送氧氣并從中移去二氧化碳。紅細(xì)胞可逆的氧合功能(即輸送氧氣)是通過血紅蛋白實(shí)現(xiàn)的。哺乳動(dòng)物血紅蛋白的分子量約64000道爾頓，由約6％血紅素和94070珠蛋白組成。其天然形式包含兩對(duì)亞基(即其為四聚體)，各自包含血紅素基團(tuán)扣珠蛋白多肽鏈。血紅蛋白在水溶液中處于四聚體和二聚體形式之間的平衡；紅細(xì)胞外的二聚體由腎臟排出。

由于醫(yī)院及其它環(huán)境下的血液制品需求越來越大，近年來，醫(yī)藥領(lǐng)域已經(jīng)針對(duì)血液代用品(bloodsubstitute)進(jìn)行了廣泛而深入的研究。血液代用品是能夠攜帶并為組織供應(yīng)氧氣的血液制品。血液代用品具有多種用途，包括替代手術(shù)過程中和急性出血后的失血，以及創(chuàng)傷性損傷后的復(fù)蘇過程。

血紅蛋白(hemoglobin,hb)類的血液代用品hemoglobin-basedoxygencarriers,簡(jiǎn)稱(hbocs)與納米血紅蛋白氧載體，是當(dāng)前國內(nèi)外人造血液組織工程與納米載氧創(chuàng)新藥物研發(fā)的重點(diǎn)。而以天然血紅蛋白(包括成人外周血、人臍帶血和動(dòng)物血)為原料的研發(fā)最受關(guān)注。目前已有5個(gè)廠家的hbocs產(chǎn)品(含人源性的4種)完成或接近完成了iii期臨床研究，取得了令人振奮的進(jìn)展。然而，這些產(chǎn)品在臨床試用中都不同程度地出現(xiàn)了諸如血管收縮、血壓升高，心臟、腎臟、肝臟等器官受損等毒副作用，特別對(duì)心肌損傷的不良反應(yīng)較對(duì)照組高3倍以上。為此，美國fda未準(zhǔn)予上市。機(jī)理研究表明，產(chǎn)生這些毒副作用的主要原因與制品中高鐵血紅蛋白(methb)含量水平有關(guān)，2010年以前臨床試用品中的methb含量曾允許到5-10％，這不僅與臨床試用品所發(fā)生的上述不良反應(yīng)有關(guān)，而且也相應(yīng)的降低了制品給組織器官供氧的療效。近幾年國內(nèi)外對(duì)hbocs制品的methb的含量要求標(biāo)準(zhǔn)均已提高，要求低于3％，甚至1％以下。但要達(dá)到這個(gè)高標(biāo)準(zhǔn)要求，關(guān)鍵在于要使hb溶液與hbocs制品的制備過程，包括分離純化、交聯(lián)修飾hb等過程，和存儲(chǔ)過程，脫氧足夠徹底。

然而，以天然血紅蛋白為原料的血液代用品因hb的特性，在純化階段要徹底脫氧需要克服多重困難。天然血紅蛋白接觸空氣或氧氣后迅速被氧化成氧合血紅蛋白(hbo2)，其氧飽和度(so2)可達(dá)90％以上，而且使hb溶液中氧分壓(po2)升高，這就很容易使hb中fe²⁺迅速氧化成fe³⁺而使methb含量水平隨即相應(yīng)增加，因此脫氧速度要求快。此外，常規(guī)的脫氧方法，如充氮，會(huì)對(duì)天然血紅蛋白造成損害，破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，影響其活性。為了控制血液代用品中methb的含量，最大限度的減小甚至消除其毒副作用，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)研究了一些方法。

專利us2002/0137221采用將血紅蛋白制備成一氧化碳血紅蛋白(hbco)來穩(wěn)定hb，再將hbco轉(zhuǎn)換回hbo2，并向溶液中充入氮?dú)庖悦撗?。但是其中制備一氧化碳血紅蛋白使用的co對(duì)操作人員的人身安全是潛在的威脅，而且在使用中將hbco轉(zhuǎn)換回hbo2十分繁瑣，并且也沒有提供在天然血紅蛋白純化階段快速有效且不破壞蛋白結(jié)構(gòu)的脫氧方法。

專利cn200810096698.6同樣將血紅蛋白制備成一氧化碳血紅蛋白，并進(jìn)一步制備成脂質(zhì)體，再通過氮?dú)夤呐萑パ?，該方法依然存在hbco轉(zhuǎn)換的缺陷，而且其脫氧方法不能直接用于天然血紅蛋白純化。

專利cn200980117711.4提供了一種將血紅蛋白制備成聚合戊二醛血紅蛋白的血液代用品，并添加葡萄糖和/或抗壞血酸，將其制備成凍干制劑，以保證高鐵血紅蛋白的含量低于5％。該方法只能保證高鐵血紅蛋白的含量低于5％，無法避免methb造成的毒副作用，且仍沒有提供在天然血紅蛋白純化階段快速有效且不破壞蛋白結(jié)構(gòu)的脫氧方法。

經(jīng)交聯(lián)和修飾后的血紅蛋白，具有類似紅細(xì)胞的特性，常規(guī)脫氧方法不易將其破壞，然而天然血紅蛋白的結(jié)構(gòu)在常規(guī)處理方式下容易被破壞，因此用天然來源的血紅蛋白制備脫氧徹底迅速、methb含量低的血液代用品具有很大的挑戰(zhàn)。

因此，本發(fā)明的發(fā)明人致力于天然血紅蛋白類血液代用品的脫氧工藝研究，經(jīng)過大量的試驗(yàn)，獲得了脫氧迅速、最大限度降低高鐵血紅蛋白含量(可為0％)，不破壞天然血紅蛋白結(jié)構(gòu)，并且成本較低的一種脫氧工藝和使用該脫氧工藝制備血液代用品的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明首先提供一種天然血紅蛋白類血液代用品的脫氧方法，該方法操作簡(jiǎn)便、安全、環(huán)保、成本低廉、高效，能在不破壞天然血紅蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上迅速降低氧分壓(po2)，最大限度降低高鐵血紅蛋白含量，甚至高鐵血紅蛋白含量可低至0％。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種天然血紅蛋白類血液代用品的脫氧方法，包括以下脫氧步驟：

①向含天然血紅蛋白的等滲體系中加入小分子抗氧劑和糖類保護(hù)劑；

②調(diào)整含天然血紅蛋白的等滲體系的ph值至5.0-8.0；

④將含天然血紅蛋白的等滲體系采用抽真空和通高純惰性氣體交替多次的方式脫氧。

進(jìn)一步地，上述天然血紅蛋白類血液代用品的脫氧方法，所述天然血紅蛋白來源于人外周血、臍帶血或者動(dòng)物血。

進(jìn)一步地，上述天然血紅蛋白類血液代用品的脫氧方法，所述小分子抗氧劑為維生素c。優(yōu)選步驟②采用維生素c調(diào)整ph值。根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，所述維生素c在等滲體系中的質(zhì)量濃度為0.05％～0.5％。

進(jìn)一步地，上述天然血紅蛋白類血液代用品的脫氧方法，所述糖類保護(hù)劑為單糖或二糖。優(yōu)選所述單糖為葡萄糖，優(yōu)選所述二糖為蔗糖。根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，糖類保護(hù)劑在等滲體系中的質(zhì)量濃度為0.05-3％。

進(jìn)一步地，上述天然血紅蛋白類血液代用品的脫氧方法，所述采用抽真空和通高純惰性氣體交替多次的方式脫氧具體是：真空泵抽真空15-30分鐘，通入高純惰性氣體15-30分鐘，交替多次進(jìn)行。

更進(jìn)一步地，所述通惰性氣體是用1μm-10μm的鈦棒將高純惰性氣體通入含天然血紅蛋白的等滲體系內(nèi)。

更進(jìn)一步地，上述高純惰性氣體為高純氮?dú)饣蚋呒儦鍤狻?/p>

優(yōu)選步驟③將含天然血紅蛋白的等滲體系采用抽真空和通高純惰性氣體交替3次以上脫氧。

基于上述天然血紅蛋白類血液代用品的脫氧方法，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種血紅蛋白類血液代用品的制備工藝，該工藝包括：

a、天然血紅蛋白純化步驟：獲取紅細(xì)胞，加入已脫氧的蒸餾水破膜，再加入氯化鈉使溶液體系為等滲體系；加入小分子抗氧劑和糖類保護(hù)劑，調(diào)節(jié)溶液ph為5.0～8.0，等滲體系中小分子抗氧劑的終濃度為0.05％～0.5％，糖類保護(hù)劑的終濃度為0.05-3％，天然血紅蛋白的終濃度為3-10％；將等滲體采用真空泵抽真空15-30分鐘、通入高純惰性氣體15-30分鐘，交替多次進(jìn)行脫氧，再將脫氧后的天然血紅蛋白在60℃下加熱10小時(shí)，1μm水系微孔濾膜過濾后，用截留分子量為10kd的超濾膜包超濾去除雜質(zhì)和小分子，得到純化的天然血紅蛋白生理鹽水體系；

b、交聯(lián)步驟：戊二醛與步驟a獲得的純化的天然血紅蛋白進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)結(jié)束，加入硼氫化鈉終止反應(yīng)，用1μm水系微孔濾膜過濾，并用截留分子量為100kd的超濾膜包超濾去除雜質(zhì)和小分子；

c、修飾步驟：依次用植酸、雙(3,5-二溴水楊基)延胡索酸酯與步驟b得到的聚合血紅蛋白反應(yīng)，硼氫化鈉終止反應(yīng)后，降至4℃，用1μm水系微孔濾膜過濾，用截留分子量為100kd的超濾膜包超濾去除雜質(zhì)和小分子；

d、終產(chǎn)品制備步驟：將步驟c得到的含修飾血紅蛋白的血液代用品進(jìn)行分裝和保存。

進(jìn)一步地，上述血紅蛋白類血液代用品的制備工藝，其步驟b在交聯(lián)反應(yīng)前，步驟c在修飾反應(yīng)前，步驟d在分裝前先按照前述脫氧步驟①②③進(jìn)行脫氧。

本發(fā)明提供了一種天然血紅蛋白類血液代用品的脫氧方法，該方法通過抽真空和通氣體交替多次的方式徹底脫氧，并在脫氧前添加適量小分子抗氧劑避免脫氧前后引入氧造成methb含量升高，相比于現(xiàn)有技術(shù)僅靠后續(xù)步驟通氣體脫氧而言，本發(fā)明的方法脫氧更為徹底，可快速使氧分壓(po2)降低至≤1mmhg，氧飽和度(so2)≤5％，高鐵紅蛋白(methb)含量≤1％，甚至低至0％；而且本發(fā)明的發(fā)明人在脫氧前加入適量的糖類保護(hù)劑充分保護(hù)天然血紅蛋白結(jié)構(gòu)在脫氧過程中不被破壞，以保證終產(chǎn)品的活性和療效。本發(fā)明的發(fā)明人基于該脫氧方法進(jìn)一步提供了血紅蛋白類血液代用品的制備工藝，在整個(gè)工藝過程中對(duì)含血紅蛋白的體系都進(jìn)行嚴(yán)格的脫氧處理，為生產(chǎn)低毒副作用、更適用于臨床的血紅蛋白類血液代用品提供了可靠的方法，而且該方法操作簡(jiǎn)單常規(guī)，使用試劑均安全環(huán)保，對(duì)于促進(jìn)血紅蛋白類血液代用品的研究發(fā)展具有重要的意義。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1純化后天然血紅蛋白變性圖；

圖2是對(duì)比例1純化后天然血紅蛋白變性圖；

圖3是對(duì)比例2純化后天然血紅蛋白變性圖。

具體實(shí)施方式

以下僅為本發(fā)明一些較佳的實(shí)施方式，不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，本發(fā)明的各個(gè)特征在不矛盾的情況下均可進(jìn)行任意的組合，這些均屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

天然血紅蛋白純化步驟：4-20℃條件下，通過生理鹽水洗滌人臍帶血得到壓積紅細(xì)胞400ml，加入1000ml無菌、無熱原且預(yù)先用孔徑1μm的鈦棒通高純氮?dú)獬醯恼麴s水開始破膜15分鐘，再加入9g氯化鈉使溶液體系為等滲體系；加入3％的vc調(diào)節(jié)溶液ph為6.0，且加入vc終濃度為0.5％，加入葡萄糖保護(hù)劑終濃度為3％，hb最終濃度為5％。繼續(xù)以抽真空15分鐘與鈦棒通高純氮?dú)?5分鐘相交替反復(fù)3次以上充分脫氧，分別在1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)取樣測(cè)其po2、so2和methb。再將脫氧后的hb60℃加熱10小時(shí)，冷卻到4℃，然后1μm水系微孔濾膜過濾后，用截留分子量為10kd的超濾膜包超濾去除雜質(zhì)和小分子后得到含純化hb的生理鹽水體系。進(jìn)一步檢測(cè)純化后天然血紅蛋白得率和血紅蛋白通過膜后變性程度(圖1)，結(jié)果見表1。

表1天然血紅蛋白純化步驟脫氧結(jié)果

由上表可見，本發(fā)明脫氧方法對(duì)天然血紅蛋白進(jìn)行純化時(shí)，脫氧迅速，氧分壓降低快，而且該方法對(duì)血紅蛋白有很好的保護(hù)作用，血紅蛋白變性產(chǎn)生的絮狀物非常少。

對(duì)比例

天然血紅蛋白純化步驟：設(shè)計(jì)對(duì)比例1和對(duì)比例2，對(duì)比例1不抽真空，對(duì)比例2不加糖類保護(hù)劑，其他條件與實(shí)施例1完全相同。分別檢測(cè)其po2、so2、methb、天然血紅蛋白得率和血紅蛋白通過膜后的變性程度。對(duì)比例1血紅蛋白通過膜后的變性情況見圖2，對(duì)比例2血紅蛋白通過膜后的變性情況見圖3。數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。

表2對(duì)比例天然血紅蛋白純化步驟脫氧結(jié)果

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)可知，僅靠充入氮?dú)夂吞砑涌寡趸瘎?，在天然血紅蛋白純化階段脫氧緩慢，氧分壓po2降低慢，不加糖類保護(hù)劑則會(huì)有大量天然血紅蛋白在脫氧過程中因受物理因素破壞而變性，導(dǎo)致蛋白變性程度高，純化產(chǎn)物得率低。

實(shí)施例2

交聯(lián)步驟：4℃條件下，將實(shí)施例1得到的含純化后hb的生理鹽水體系用vc調(diào)ph到7.5，加入vc終濃度為0.3％，加入蔗糖終濃度為3％，hb最終濃度為5.5％。繼續(xù)以抽真空15分鐘、孔徑1μm的鈦棒通高純氮?dú)?5分鐘相交替的方式，反復(fù)3次以上充分脫氧，分別在1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)取樣測(cè)其po2、so2和methb，結(jié)果見表3。再以3ml/min速度加入1％戊二醛于純化hb中，反應(yīng)30分鐘后，加入20倍摩爾比的硼氫化鈉終止反應(yīng)。最后通過1μm水系微孔濾膜過濾后，用截留分子量為100kd的超濾膜包超濾去除雜質(zhì)和小分子后得到聚合hb。

表3天然血紅蛋白交聯(lián)步驟脫氧結(jié)果

實(shí)施例3

修飾步驟：4℃條件下，將實(shí)施例2得到的聚合hb加入到0.1m的bis-tris溶液中，vc調(diào)ph到8.0，加入vc終濃度為0.3％，加入葡萄糖保護(hù)劑終濃度為3％，hb最終濃度為6.4％，體積2000ml。繼續(xù)以抽真空15分鐘、孔徑1μm鈦棒通高純氮?dú)?5分鐘相交替的方式，反復(fù)3次以上充分脫氧，分別在1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)取樣測(cè)其po2、so2和methb，結(jié)果見表4。再將溶液放于25℃水浴中，加入植酸(15mm)，反應(yīng)1小時(shí)，加入血紅蛋白6.0倍摩爾量的雙(3,5-二溴水楊基)延胡索酸酯(dbbf)，反應(yīng)2小時(shí)，加入血紅蛋白20倍摩爾量的硼氫化鈉終止反應(yīng)，溫度降至4℃。最后通過1μm水系微孔濾膜過濾后，用截留分子量為100kd的超濾膜包加入生理鹽水40l超濾去除雜質(zhì)和小分子后得到修飾hb。

表4天然血紅蛋白修飾步驟脫氧結(jié)果

實(shí)施例4

終產(chǎn)品制備步驟：將實(shí)施例3得到的修飾hb，4℃條件下，vc調(diào)ph到8.0，加入vc終濃度為0.05％，加入葡萄糖保護(hù)劑終濃度為3％，hbocs最終濃度為6％，體積600ml。繼續(xù)以抽真空15分鐘、孔徑1μm鈦棒通高純氮?dú)?5分鐘相交替的方式，反復(fù)3次以上充分脫氧，分別在1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)取樣測(cè)其po2、so2和methb，結(jié)果見表5。再7000rpm離心1小時(shí)，0.22μm水系微孔濾膜過濾后即得脫氧的hbocs，最后開始分裝于10ml西林瓶中4℃保存。

表5終產(chǎn)品制備步驟脫氧結(jié)果