用于治療心力衰竭的藥物及其篩選方法和制備方法與流程

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種以mirna-665為藥物作用靶點的用于治療心衰的藥物及其篩選方法和制備方法。

背景技術(shù)：

microrna(mirna,mir)是一類新近發(fā)現(xiàn)的來源于內(nèi)源性發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄本的長度大約為22個核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼單鏈rna，通過與靶mrna的3’非翻譯區(qū)(3’untranslatedregion,3’utr)特異性結(jié)合，促進(jìn)靶mrna降解，或者抑制靶mrna翻譯，降低編碼蛋白質(zhì)水平，從而實現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控。mirna與機體的多種疾病聯(lián)系緊密，包括神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、腎病以及腫瘤等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，mirna在心臟的生成、發(fā)育和功能方面均有著重要作用。

心力衰竭是我國年死亡率最高的疾病之一，是多種心臟疾病發(fā)展的終末階段，如冠心病、心律失常和高血壓等，導(dǎo)致社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)加重。關(guān)于心力衰竭的預(yù)防、診斷和治療工作，目前仍存在巨大的不足，治療率、控制達(dá)標(biāo)率低，心功能iii-iv級的心力衰竭患者其年死亡率達(dá)到40％。

心力衰竭的病因和發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種信號通路。目前世界衛(wèi)生組織推薦的藥物治療方案包括：利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(acei)、β受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑、血管緊張素ii受體拮抗劑(arb)、洋地黃和伊伐布雷定，但尚不能達(dá)到讓人滿意的效果。mirna參與許多重要病理生理過程，由于單一mirna可調(diào)控多個靶基因的表達(dá)，因此針對疾病關(guān)鍵mirna靶點的藥物可參與多種信號通路調(diào)控，從而為心力衰竭的治療帶來新的希望。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，mir-208a可導(dǎo)致肌肉生長抑素和甲狀腺激素相關(guān)蛋白等與心肌生長和肥厚相關(guān)的負(fù)調(diào)節(jié)因子減少，導(dǎo)致心肌肥厚甚至心力衰竭。但是目前為止尚未見關(guān)于mir-665在心力衰竭中的治療作用及相關(guān)的治療藥物用途的報道。

目前多采用腺病毒和慢病毒作為mirna的表達(dá)載體，但腺病毒載體表達(dá)時間短、對機體有免疫原性，慢病毒多由白血病病毒或hiv改造而來，生物安全性堪憂，均不適合將來的臨床應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明人根據(jù)本領(lǐng)域客觀存在的上述問題和不足，偶然發(fā)現(xiàn)了hsa-mir-665與心衰發(fā)生機制之間的關(guān)系，并進(jìn)一步進(jìn)行分子實驗，開放出一種以hsa-mir-665為藥物靶點的抗心衰藥物，同時進(jìn)行動物實驗驗證其效果，發(fā)現(xiàn)以hsa-mir-665為藥物作用靶點，且下調(diào)表達(dá)hsa-mir-665的分子能顯著改善小鼠心臟功能，治療心力衰竭。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明首先提供了一種用于治療心力衰竭的藥物，其特征在于，所述藥物的藥效成分以hsa-mir-665為藥物靶點，且通過結(jié)合、降解、和/或下調(diào)表達(dá)所述hsa-mir-665起到所述治療心力衰竭的藥效。本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，心力衰竭患者外周血中hsa-mir-665的表達(dá)水平增高(圖1a)，且與心臟射血分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)性(圖1b)，這表明hsa-mir-665可能在心力衰竭病理生理過程中起到破壞作用，并進(jìn)一步進(jìn)行小鼠實驗，通過結(jié)合(例如，反義互補)、降解hsa-mir-665、和/或降低hsa-mir-665的表達(dá)，均可明顯改善tac小鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)(圖5a)，并能有效改善冠脈儲備功能(圖5b)，從而實現(xiàn)增強心臟功能，達(dá)到心衰治療的目的。

在進(jìn)一步的實施例中，所述藥物的藥效成分包括可降解、和/或下調(diào)表達(dá)所述hsa-mir-665的物質(zhì)；所述藥物的藥效成分優(yōu)選為可下調(diào)表達(dá)所述hsa-mir-665的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，hsa-mir-665做為動物體內(nèi)的一段微小rna，可以通過分子生物學(xué)手段使其表達(dá)下調(diào)、抑制從而達(dá)到降低其水平進(jìn)而起到治療作用，也可采用其它手段，例如某些化學(xué)分子，使其降解，也可同樣達(dá)到降低其水平的目的。

在優(yōu)選的實施例中，所述藥物的藥效成分包含與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665。分子生物學(xué)中最便捷簡單的方式就是利用反義互補鏈與目的序列片段結(jié)合，使目的片段的數(shù)量減少，從而起到降低其表達(dá)水平，進(jìn)一步治療的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，分子生物學(xué)意義上的反向互補序列，可以在目標(biāo)片段全長上進(jìn)行反向互補，也可以部分長度地反向互補，也可以與目標(biāo)片段全長反向互補后再長出一小段序列，具體地，在本發(fā)明中，目的片段hsa-mir-665的全長序列為20個堿基，其反義互補序列片段anti-hsa-mir-665可以是與hsa-mir-665的20個堿基全長互補的片段，也可以是與hsa-mir-665的20個堿基序列中某一段部分互補，長度在10-19個堿基之間的反義片段，也可以是除了與hsa-mir-665的20個堿基全長互補之外多出1-5個堿基的反義片段。因此，在本文中，所述反義互補具體指：所述anti-hsa-mir-665與所述hsa-mir-665的全長或部分序列呈反向互補，且所述anti-hsa-mir-665是長度為10-25個堿基的序列片段。

在更為優(yōu)選的實施例中，所述藥物的藥效成分為可表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組質(zhì)粒。

在本發(fā)明最具體的一個實施例中，所述藥物的藥效成分為表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒paav-d(+)-anti-mir-665；本發(fā)明采用的重組腺相關(guān)病毒載體(raav)克服了其他基因表達(dá)載體所難以克服的缺點，它可以攜帶目的基因轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細(xì)胞(即具有廣泛的轉(zhuǎn)基因范圍)、無副作用(無免疫源性)、感染效率高、能驅(qū)動目的基因在體內(nèi)長期表達(dá)，而且成功地解決了無腺病毒污染的體外大量復(fù)制問題，從而成為基因治療最有前途的載體。本發(fā)明最具體的實施例構(gòu)建的paav-d(+)-anti-mir-665表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染率可高達(dá)90％以上，使治療效果更好。

更具體地，所述與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665可通過將如seqidno.1和seqidno.2所示的引物對插入至腺病毒表達(dá)載體paav-d(+)中構(gòu)建出paav-d(+)-anti-mir-665質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)。兩段引物退火成雙鏈核苷酸，且與hsa-mir-665序列互補，即為anti-hsa-mir-665，當(dāng)與mir-665互補結(jié)合后，使得mir-665表達(dá)下降。

在另一些實施例中，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的輔料，和/或，用于緩沖、培養(yǎng)、和/或擴繁所述重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒paav-d(+)-anti-mir-665的試劑；所述hsa-mir-665的序列如seqidno.3所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)客觀需求，將本發(fā)明的抗心衰藥物添加各種藥學(xué)上可接受的輔劑/輔料，制成各類劑型，便于銷售或推廣。

本發(fā)明的另一方面提供了可降解、和/或下調(diào)表達(dá)所述hsa-mir-665的物質(zhì)；和/或，與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665；和/或，表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組質(zhì)粒；和/或，表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒paav-d(+)-anti-mir-665，在制備抗心衰藥物方面的用途。任何規(guī)模的出于商業(yè)目的將上述各物質(zhì)裝入標(biāo)有抗心衰用途的商品包裝內(nèi)的行為均落入本發(fā)明請求保護(hù)的范圍。

本發(fā)明第三方面提供一種抗心衰藥物的篩選方法，其特征在于，檢測待選物質(zhì)是否能結(jié)合、降解、和/或下調(diào)表達(dá)hsa-mir-665，并篩選出能對hsa-mir-665的表達(dá)起抑制作用的物質(zhì)。

本發(fā)明第四方面提供一種抗心衰藥物的制備方法，其特征在于，包括：

將可降解、和/或下調(diào)表達(dá)所述hsa-mir-665的物質(zhì)；和/或，與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665；和/或，表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組質(zhì)粒；和/或，表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒paav-d(+)-anti-mir-665作為所述抗心衰藥物的活性成分。

在進(jìn)一步的實施例中，所述制備方法還包括：將可表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的引物對插入表達(dá)載體，從而制備得到可穩(wěn)定表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組質(zhì)粒。

在具體的實施例中，所述可表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的引物對如seqidno.1和seqidno.2所示；所述表達(dá)載體為腺相關(guān)病毒表達(dá)載體paav-d(+)。

為了實現(xiàn)心力衰竭的基因治療目的，本發(fā)明將hsa-mir-665和anti-hsa-mir-665分別與重組腺相關(guān)病毒載體重組構(gòu)建，并經(jīng)檢測獲得滿足治療要求的高滴度，在動物實驗中證實了其可以有效改善心力衰竭小鼠的心功能。因此，本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)和結(jié)果，提供一種以hsa-mir-665為治療靶點的用于臨床心力衰竭治療的藥物。

本發(fā)明基于hsa-mir-665的堿基序列，分別設(shè)計并合成了表達(dá)hsa-mir-665和反義互補anti-hsa-mir-665的序列，并成功分別插入真核表達(dá)載體paav-d(+)中構(gòu)成重組質(zhì)粒paav-d(+)-mir-665和paav-d(+)-anti-mir-665。之后，將以下三種質(zhì)粒：1)pxx8或pxx9質(zhì)粒、2)phelper質(zhì)粒、3)paav-d(+)-mir-665或paav-d(+)-anti-mir-665質(zhì)粒，用鈣磷共轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)入293細(xì)胞包裝制備能分別表達(dá)hsa-mir-665和反義互補anti-hsa-mir-665的兩種血清型重組腺相關(guān)病毒(raav8和raav9)，經(jīng)純化后，real-timepcr法測定滴度。下一步將包裝制備的同一血清型的兩種重組腺相關(guān)病毒(raav-mir-665和raav-anti-mir-665)分別經(jīng)尾靜脈注射至主動脈結(jié)扎術(shù)(tac)導(dǎo)致心力衰竭的小鼠中，發(fā)現(xiàn)小鼠心臟中hsa-mir-665的長期表達(dá)發(fā)生明顯變化，說明重組腺相關(guān)病毒能介導(dǎo)hsa-mir-665/anti-hsa-mir-665的長期有效表達(dá)，從而促進(jìn)/抑制心臟hsa-mir-665的表達(dá)。并且發(fā)現(xiàn)tac小鼠的心功能受到明顯調(diào)控，重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的anti-hsa-mir-665表達(dá)能明顯改善tac小鼠的心功能，并且改善冠狀動脈功能。而hsa-mir-665則破壞tac小鼠的心功能，進(jìn)一步支持anti-hsa-mir-665的抗心力衰竭作用。

附圖說明

圖1顯示了心力衰竭患者心功能水平與外周血hsa-mir-665表達(dá)水平的相關(guān)性；a：real-time法檢測心力衰竭患者和正常對照人群外周血中hsa-mir-665的表達(dá)水平；b外周血hsa-mir-665表達(dá)水平與心臟射血分?jǐn)?shù)的相關(guān)性。

圖2是顯示paav-d(+)-mir-665和paav-d(+)-anti-mir-665的質(zhì)粒構(gòu)成。

圖3是純化后的病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察gfp(40x，綠色顯示的是轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞)，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90％以上。

圖4是real-timepcr檢測不同處理的tac小鼠心臟中hsa-mir-665的表達(dá)情況：其中，檢測結(jié)果顯示raav-mir-665和raav-anti-mir-665可明顯調(diào)控tac小鼠心臟hsa-mir-665的表達(dá)(前者升高h(yuǎn)sa-mir-665水平，后者降低hsa-mir-665水平)。

圖5是心臟超聲監(jiān)測不同microrna治療對tac小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)的影響以及不同microrna治療對tac小鼠冠脈儲備功能的影響；其中結(jié)果顯示raav-anti-mir-665可明顯改善tac小鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)(a)，并改善冠脈儲備功能(b)；而raav-mir-665則明顯降低tac小鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)(a)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

儀器設(shè)備

nd-1000

試劑與耗材

rnaseyminikit試劑盒購自qiagen；

trizolls購自invitrogen公司；

mirna檢測試劑盒購自廣州銳博公司；

瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒takaraagarosegeldnapurificationkitver.2.0購自takara公司；

endo-freeplasmidmaxikit質(zhì)粒提取試劑盒購自omega公司；

easypureplasmidminiprepkit質(zhì)粒提取試劑盒購自北京全式金公司；

真核表達(dá)載體paav-d(+)由合作的美國北卡大學(xué)肖嘯教授構(gòu)建并贈予，在中國專利zl201210069224.9“表達(dá)hsa-mir-21^＊的重組腺相關(guān)病毒的制備方法及其在高血壓病治療中的用途”一文中有記載，是已知的載體；申請人承諾自本發(fā)明申請日起20年內(nèi)可向公眾提供用于驗證本發(fā)明的效果。

生物材料的來源

慢性心衰患者外周血及正常人群外周血來自2012-2014年武漢同濟醫(yī)院住院患者，均簽署了知情同意書；

c57背景小鼠購自北京華阜康公司；

293t細(xì)胞來自美國atcc公司。

第1組實施例：

本發(fā)明第一組實施例提供了一種用于治療心力衰竭的藥物，在該組實施例中，都具有如下特征：所述治療心力衰竭的藥物的藥效成分以hsa-mir-665為藥物靶點，且通過結(jié)合、降解、和/或下調(diào)表達(dá)所述hsa-mir-665起到所述治療心力衰竭的藥效。本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，心力衰竭患者外周血中hsa-mir-665的表達(dá)水平增高(圖1a)，且與心臟射血分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)性(圖1b)，這表明hsa-mir-665可能在心力衰竭病理生理過程中起到破壞作用，并進(jìn)一步進(jìn)行小鼠實驗，通過結(jié)合(例如，反義互補)、降解hsa-mir-665、和/或降低hsa-mir-665的表達(dá)，均可明顯改善tac小鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)(圖5a)，并能有效改善冠脈儲備功能(圖5b)，從而實現(xiàn)增強心臟功能，達(dá)到心衰治療目的的作用。

進(jìn)一步地，所述藥物的藥效成分包括可降解、和/或下調(diào)表達(dá)所述hsa-mir-665的物質(zhì)；所述藥物的藥效成分優(yōu)選為可下調(diào)表達(dá)所述hsa-mir-665的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，hsa-mir-665做為動物體內(nèi)的一段微小rna，可以通過分子生物學(xué)手段使其表達(dá)下調(diào)、抑制從而達(dá)到降低其水平進(jìn)而起到治療作用，也可采用其它手段，例如某些化學(xué)分子，使其降解，也可同樣達(dá)到降低其水平的目的。

優(yōu)選地，所述藥物的藥效成分包含與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665。分子生物學(xué)中最便捷簡單的方式就是利用反義互補鏈與目的序列片段結(jié)合，使目的片段的數(shù)量減少，從而起到降低其表達(dá)水平，進(jìn)一步治療的作用。所述hsa-mir-665的序列如seqidno.3所示。

具體地，在本發(fā)明中的所述“反義互補”指：所述anti-hsa-mir-665與所述hsa-mir-665的全長或部分序列呈反向互補，且所述anti-hsa-mir-665是長度為10-25個堿基的序列片段。

本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，分子生物學(xué)意義上的反向互補序列，可以在目標(biāo)片段的全長上進(jìn)行反向互補，也可以部分長度地反向互補，也可以與目標(biāo)片段全長反向互補后再長出一小段序列，具體地，在本發(fā)明中，目的片段hsa-mir-665的全長序列為20個堿基，其反義互補序列片段anti-hsa-mir-665可以是與hsa-mir-665的20個堿基全長互補的片段，也可以是與hsa-mir-665的20個堿基序列中某一段部分互補，長度在10-19個堿基之間的反義片段，也可以是除了與hsa-mir-665的20個堿基全長互補之外多出1-5個堿基的反義片段。

在本發(fā)明一些可替換的實施例中，一些與hsa-mir-665序列呈全長或部分序列的反義互補的具有10-25個堿基長度的序列片段，和/或可表達(dá)“與hsa-mir-665序列呈全長或部分序列的反義互補的具有10-25個堿基長度的序列片段”的重組質(zhì)粒具有與下面實驗例3相類似或等同的抗心衰效果，鑒于篇幅有限，本文中不再一一贅述。

更優(yōu)選地，所述藥物的藥效成分為可表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組質(zhì)粒。

在本發(fā)明最具體的一個實施例中，所述藥物的藥效成分為表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒paav-d(+)-anti-mir-665；本發(fā)明采用的重組腺相關(guān)病毒載體(raav)克服了其他基因表達(dá)載體所難以克服的缺點，它可以攜帶目的基因轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細(xì)胞(即具有廣泛的轉(zhuǎn)基因范圍)、無副作用(無免疫源性)、感染效率高、能驅(qū)動目的基因在體內(nèi)長期表達(dá)，而且成功地解決了無腺病毒污染的體外大量復(fù)制問題，從而成為基因治療最有前途的載體。本發(fā)明最具體的實施例構(gòu)建的paav-d(+)-anti-mir-665表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染率可高達(dá)90％以上，使治療效果更好。

更具體地，所述與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665可通過將如seqidno.1和seqidno.2所示的引物對插入至腺病毒表達(dá)載體paav-d(+)中構(gòu)建出paav-d(+)-anti-mir-665質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)。兩段引物退火成雙鏈核苷酸，且與hsa-mir-665序列互補，即為anti-hsa-mir-665，當(dāng)與mir-665互補結(jié)合后，使得mir-665表達(dá)下降。

進(jìn)一步地，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的輔料，和/或，用于緩沖、培養(yǎng)、和/或擴繁所述重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒paav-d(+)-anti-mir-665的試劑；所述hsa-mir-665的序列如seqidno.3所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)客觀需求，將本發(fā)明的抗心衰藥物添加各種藥學(xué)上可接受的輔劑/輔料，制成各類劑型，便于銷售或推廣。

第2組實施例：

本發(fā)明第2組實施例提供了：可降解、和/或下調(diào)表達(dá)所述hsa-mir-665的物質(zhì)；和/或，與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665；和/或，表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組質(zhì)粒；和/或，表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒paav-d(+)-anti-mir-665，在制備抗心衰藥物方面的用途。任何規(guī)模的出于商業(yè)目的將上述各物質(zhì)裝入標(biāo)有抗心衰用途的商品包裝內(nèi)的行為均落入本發(fā)明請求保護(hù)的范圍。

第3組實施例：

本發(fā)明第3組實施例提供一種抗心衰藥物的篩選方法，其特征在于，檢測待選物質(zhì)是否能結(jié)合、降解、和/或下調(diào)表達(dá)hsa-mir-665，并篩選出能對hsa-mir-665的表達(dá)起抑制作用的物質(zhì)。

本組實施例的具體實驗操作步驟可參看實驗例2和/或?qū)嶒灷?。

第4組實施例：

本發(fā)明第3組實施例提供一種抗心衰藥物的制備方法，其特征在于，包括：

將可降解、和/或下調(diào)表達(dá)所述hsa-mir-665的物質(zhì)；和/或，與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665；和/或，表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組質(zhì)粒；和/或，表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒paav-d(+)-anti-mir-665作為所述抗心衰藥物的活性成分。

進(jìn)一步地，將可表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的引物對插入表達(dá)載體，從而制備得到可穩(wěn)定表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的重組質(zhì)粒。

更進(jìn)一步的具體方案中，所述可表達(dá)與hsa-mir-665反義互補的序列片段anti-hsa-mir-665的引物對如seqidno.1和seqidno.2所示；所述表達(dá)載體為腺相關(guān)病毒表達(dá)載體paav-d(+)。

本組實施例的具體實驗操作步驟如下述的實驗例2所示。

實驗例1、慢性心力衰竭患者外周血mirnas檢測

1.收集200例慢性心力衰竭患者和200例正常對照人群外周血。取材后，室溫3,500rpm離心6min，取上層血漿，保存于-80℃冰箱。每0.25ml外周血血漿中加入1mltrizolls(invitrogen公司)，提取rna，rnaseyminikit(qiagen)處理樣品。使用nd-1000檢測rna質(zhì)量。

2.采用廣州銳博公司mirna檢測試劑盒對hsa-mir-665的表達(dá)進(jìn)行real-timepcr檢測：

mirnas逆轉(zhuǎn)錄：

逆轉(zhuǎn)錄引物(rtprimermix)配置：

mirnartprimer1μl

u6rtprimer1μl

rnasefreeh2o78μl

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：

rnatemplate2μg

rtprimermix4μl

rnasefreeh2oupto19μl

以上體系混勻后，瞬時離心，70℃孵育10min后，冰育2min，再加入以下試劑：

2×tsreactionbuffer25μl

tsenzyme2.5μl

rnasefreeh2o3.5μl

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：

42℃60min，70℃10min；停止后4℃?zhèn)溆?，產(chǎn)物保存于-20℃。

mirnasreal-timepcr：

反應(yīng)體系：2×sybrgreenmix9μl

rtproduct2μl

mirnaforwardprimer2μl

mirnareverseprimer2μl

rnase-freeh2o5μl

反應(yīng)程序：

95℃30sec--(95℃10sec--60℃20sec--70℃1sec)×40cycles--meltingcurve

結(jié)果顯示：心力衰竭患者外周血中hsa-mir-665的表達(dá)水平增高(圖1a)，且與心臟射血分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)性(圖1b)。表明hsa-mir-665可能在心力衰竭病理生理過程中起到破壞作用。

實驗例2、重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建

1.插入片段合成

依據(jù)hsa-mir-665的堿基序列(圖2)，分別設(shè)計并合成表達(dá)hsa-mir-665及反向互補anti-hsa-mir-665的兩條反向互補鏈，并用te溶解。序列如下：

hsa-mir-665核酸序列：accaggaggcugaggccccu(取自mirbase，accession登錄號:mimat0004952)(如seqidno.3)

hsa-mir-665上游引物：

5’gatccaggggcctcagcctcctggtttcaagagaaccaggaggctgaggcccctccgc3’(如seqidno.4)hsa-mir-665下游引物：

3’gtccccggagtcggaggaccaaagttctcttggtcctccgactccggggaggcgccgg5’(如seqidno.5)anti-hsa-mir-665上游引物：

5’gatccaccaggaggctgaggcccctttcaagagaaggggcctcagcctcctggtccgc3’(如seqidno.1)anti-hsa-mir-665下游引物：

3’gtggtcctccgactccggggaaagttctcttccccggagtcggaggaccaggcgccgg5’(如seqidno.2)

2.按照說明書中體系及溫度進(jìn)行反應(yīng)：

nuclease-freewater36μl

annealingbufferfordnaoligos(5x)10μl

dnaoligoa(50μm)2μl

dnaoligob(50μm)2μl

90℃3min，37℃1hr，4℃保存。

3.載體酶切

采用bamhi和noti對真核表達(dá)載體paav-d(+)在37℃下雙酶切2hr，體系如下：

10×kbuffer1μl

bsa1μl

bamhi1μl

noti1μl

paav-d(+)2μl

ddh2o14μl

4.瓊脂糖凝膠電泳膠回收

用1％的瓊脂糖電泳凝膠電泳雙酶切產(chǎn)物，然后使用takara公司瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒takaraagarosegeldnapurificationkitver.2.0回收雙酶切產(chǎn)物，具體操作步驟如下：

1.制作1×tae緩沖液瓊脂糖凝膠，然后對目的dna進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；

2.在紫外燈下切出含有目的dna的瓊脂糖凝膠；

3.稱量膠塊重量，計算膠塊體積，切碎膠塊；

4.向膠塊中加入3倍體積的膠塊融化液dr-ibuffer，75℃加熱融化膠塊；

5.向膠塊融化液中加入dr-ibuffer量的1/2體積量的dr-iibuffer，均勻混合。當(dāng)分離小于400bp的dna片段時，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20％的異丙醇；

6.將試劑盒中的spincolumn安置于collectiontube上；

7.將上述操作5的溶液轉(zhuǎn)移至spincolumn中，12,000rpm離心1min，棄濾液；

8.將500μl的rinsea加入spincolumn中，12,000rpm離心30sec，棄濾液；

9.將700μl的rinseb加入spincolumn中，12,000rpm離心30sec，棄濾液；

10.重復(fù)操作步驟9；

11.將spincolumn安置于collectiontube上，12,000rpm離心1min；

12.將spincolumn安置于新的1.5ml的離心管上，在spincolumn膜的中央處加入25μl的60℃預(yù)熱的elutionbuffer，室溫靜置1min；

13.12,000rpm離心1min洗脫dna。

5.載體連接

1.用t4連接酶連接回收的paav-d(+)載體和合成的dna片段，按照下述反應(yīng)體系16℃孵育過夜：

2.全量(25μl)加入至100μldh5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min；

3.42℃加熱45sec后，再在冰中放置1min；

4.加入500μl無抗生素lb培養(yǎng)基，37℃100rpm振蕩培養(yǎng)60min；

5.在amp⁺的lb平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選白色單克隆菌落鑒定。

6.質(zhì)粒小提

挑取單克隆菌落，加入到3mlamp⁺的lb液體培養(yǎng)基中，37℃280rpm振蕩培養(yǎng)過夜。使用北京全式金公司easypureplasmidminiprepkit提取質(zhì)粒，具體操作步驟如下：

1.取1.5ml過夜培養(yǎng)的細(xì)菌10,000g離心1min，盡量吸盡上清；

2.加入250μl無色溶液rb(含rnasea)，震蕩懸浮細(xì)菌沉淀；

3.加入250μl藍(lán)色溶液lb，溫和地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，使菌體充分裂解，形成藍(lán)色透亮的溶液；

4.加入350μl黃色溶液nb，輕輕混合5-6次，直至形成緊實的黃色凝集塊，室溫靜置2min；

5.15,000g離心5min，小心吸取上清加入吸附柱中；

6.15,000g離心1min，棄流出液；

7.加入650μl溶液wb，15,000g離心1min，棄流出液；

8.15,000g離心2min，徹底去除殘留的wb；

9.將吸附柱置于新ep管中，在柱中央加入20μl70℃預(yù)熱的eb，室溫靜置1min；

10.10,000g離心1min，洗脫dna，洗脫出的dna于-20℃保存。

7.質(zhì)粒鑒定

采用雙酶切和測序?qū)λ鶚?gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，得到真核表達(dá)質(zhì)粒paav-d(+)-mir-665和paav-d(+)-anti-mir-665，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。

8.質(zhì)粒大提

準(zhǔn)備1l的無菌錐形瓶，加入300ml無菌lb培養(yǎng)基，加氨芐青霉素溶液至終濃度為100μg/ml。分別加入50μl所需質(zhì)粒(pxx8、pxx9、phelper、paav-d(+)、paav-d(+)-mir-665和paav-d(+)-anti-mir-665)，280rpm，37℃過夜培養(yǎng)。按照omega公司endo-freeplasmidmaxikit說明書操作，提取質(zhì)粒，具體步驟如下：

1.室溫下5000g離心10min收集細(xì)菌；

2.棄培養(yǎng)基，加入10mlsolutioni/rnasea混合液，漩渦震蕩完全重懸；

3.重懸混合液中加入10mlsolutionii，輕輕顛倒混勻10-15次后，室溫放置2min；

4.加入5ml冰浴的buffern3，并溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀；

5.將hibind柱套在收集管中，加入5mlbuffergps，室溫靜置3-10min，5,000g離心5min，棄濾液，將柱子重新放回收集管中；

6.將細(xì)菌裂解液倒入針筒過濾器中，靜置2min，插入并推動活塞，收集過濾的裂解液；

7.過濾裂解液中加入1/10體積的etr，顛倒7-10次后，冰浴10min；

8.42℃水浴5min后，室溫5,000g離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管，加入0.5倍體積無水乙醇，混勻后室溫靜置2min；

9.轉(zhuǎn)移混合液至已激活hibind柱中，室溫5,000g離心5min，棄去濾液；

10.將結(jié)合柱重新裝回收集管，加入10mlhbbuffer，室溫5,000g離心5min，棄去濾液；

11.將結(jié)合柱重新裝回收集管，加入15mldnawashbuffer，室溫5,000g離心5min，棄去濾液；

12.重復(fù)上一步驟；

13.棄去濾液，結(jié)合柱重新裝回收集管，6,000g離心15min；

14.取出結(jié)合柱，65℃干燥10min；

15.結(jié)合柱裝入新離心管，加入70℃預(yù)熱的1-3mlendotoxinfreeelutionbuffer，室溫靜置2min后，6,000g離心5min以洗脫dna。

9.raav介導(dǎo)的病毒包裝

293t細(xì)胞生長至90％，鈣磷轉(zhuǎn)染前1-2hr，每個培養(yǎng)皿換新鮮培養(yǎng)基(含血清)12-15ml，在50ml離心管內(nèi)先加入氯化鈣(cacl2)，再加入質(zhì)粒，形成ca-dna混合液，充分混勻，向ca-dna混合液中緩慢滴加2xhebsbuffer，形成ca-dna-p混合液，一邊加2xhebs一邊振蕩離心管，充分混勻形成鈣磷顆粒。8-12hr后，換18-20ml無血清培養(yǎng)基，72hr后，吸棄培養(yǎng)基，用pbs洗3遍，每個培養(yǎng)皿中加入tris+nacl(ph8.5)1ml，用刮匙刮取細(xì)胞，收集于干凈離心管，-80℃凍存。

10.病毒純化

將凍存于-80℃的細(xì)胞取出，在37℃解凍溶解，反復(fù)凍融4次，8,000g離心15min，將上清放至干凈離心管，棄細(xì)胞沉淀。

用-20℃預(yù)冷的無水乙醇與raav以3：1的體積比充分混勻，-20℃冰箱放置2hr后，4℃，13,000rpm離心15min，棄上清；乙醇揮發(fā)后，加入相應(yīng)體積tris+nacl(ph8.5)溶解沉淀。用millipore小濾器(0.22μm)過濾。

11.病毒滴度測定

樣品處理：raav病毒液40μl

蛋白酶k(20mg/ml)5μl

55℃，反應(yīng)1hr；

酚：氯仿：異戊醇45μl

4℃，12,000g離心5min回收水相；

氯仿45μl

4℃，12,000g離心5min回收水相。

real-timepcr：

primer1(10μm)0.4μl

primer2(10μm)0.4μl

sybrgreenimix10μl

ddh2o8.2μl

template1μl

95℃30sec---(95℃5sec---60℃5sec---72℃20sec)×40個循環(huán)---meltingcurve

12.病毒轉(zhuǎn)染效率

純化后的病毒轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞48小時后，熒光顯微鏡觀察被轉(zhuǎn)染細(xì)胞比例，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90％以上(圖4)。

實驗例3、以raav9型表達(dá)hsa-mir-665/hsa-anti-mir-665的重組腺相關(guān)病毒為例檢測其對心力衰竭的治療作用

1.tac小鼠心臟mir-665表達(dá)的檢測：

我們采用8周齡的c57小鼠，通過尾靜脈分別注射raav-mir-665和raav-anti-mir-665，病毒滴度1×10¹¹pfu/每只，2周后行tac手術(shù)：胸主動脈結(jié)扎術(shù)(transverseaorticconstriction，tac)，至實驗終點(4周后)時采用real-timepcr法檢測tac小鼠心臟中mir-665的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：raav-mir-665處理可明顯增加心臟mir-665的表達(dá)，而raav-anti-mir-665處理可明顯降低心臟mir-665的表達(dá)(圖5)。

2.tac小鼠心功能檢測：

實驗終點時采用心臟超聲檢測tac小鼠心功能，方法如下：

使用儀器為配有30mhz高頻探頭的超聲儀。在使用異氟烷麻醉小鼠后，將小鼠仰臥放置于檢測平臺，沿小鼠胸骨旁左室乳頭肌水平短軸和長軸切面采集左室二維圖像，同時在二維圖像引導(dǎo)下分別獲取5個以上連續(xù)心動周期m型超聲影像，根據(jù)采集的影像使用軟件分析結(jié)果，得到心臟超聲檢測心臟血流動力學(xué)指標(biāo)，經(jīng)相關(guān)軟件分析后計算出下列指標(biāo)：包括心率(heartrate,hr)、左室舒張期內(nèi)徑(leftventricularinternaldimension，diastole，lvidd)、左室收縮期內(nèi)徑(leftventricularinternaldimension，systole，lvids)、左室后壁舒張期厚度(leftventricularposteriorwall，diastole，lvpwd)、左室后壁收縮期厚度(leftventricularposteriorwall，systole，lvpws)、室間隔舒張期厚度(interventricularseptalthickness，diastole，ivsd)、室間隔收縮期厚度(interventricularseptalthickness，systole，ivss)、射血分?jǐn)?shù)(ejectionfraction，ef)以及縮短分?jǐn)?shù)(fractionalshortening，fs)等。

結(jié)果顯示：raav-anti-mir-665處理可明顯改善tac小鼠的心臟功能(圖5a)，并且能顯著改善tac小鼠的冠脈儲備(圖5b)。而raav-mir-665處理可明顯損傷tac小鼠的心臟功能(圖5a)。

sequencelisting

<110>汪道文

陳琛

李華萍

<120>用于治療心力衰竭的藥物及其篩選方法與制備方法

<130>p1740050/wht/hb

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>58

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>artificialsequence

<400>1

gatccaccaggaggctgaggcccctttcaagagaaggggcctcagcctcctggtccgc58

<210>2

<211>58

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>artificialsequence

<400>2

gtggtcctccgactccggggaaagttctcttccccggagtcggaggaccaggcgccgg58

<210>3

<211>20

<212>rna

<213>artificialsequence

<220>

<223>小鼠musmusculus

<400>3

accaggaggcugaggccccu20

<210>4

<211>58

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>artificialsequence

<400>4

gatccaggggcctcagcctcctggtttcaagagaaccaggaggctgaggcccctccgc58

<210>5

<211>58

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>artificialsequence

<400>5

gtccccggagtcggaggaccaaagttctcttggtcctccgactccggggaggcgccgg58