小駁骨提取物作為神經(jīng)保護(hù)劑的應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體說，涉及小駁骨提取物作為神經(jīng)保護(hù)劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中樞神經(jīng)變性疾病是一組以中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元逐漸發(fā)生變性、凋亡所導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病或神經(jīng)病癥。其病因大多不明，發(fā)病機(jī)制和病理表現(xiàn)復(fù)雜，臨床表現(xiàn)各異。該組疾病多見于中老年，呈慢性或亞急性起病，進(jìn)行性加重，病程較長(zhǎng)，且多數(shù)疾病和病癥之間相互重疊，如10％左右的帕金森病合并癡呆，太平洋關(guān)島的阿爾茨海默、帕金森綜合征等。由于缺乏特異的生化、影像學(xué)和病理生理學(xué)特征，往往主要依靠臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)作出診斷。除少數(shù)疾病(如帕金森病)依靠藥物或手術(shù)可能暫時(shí)改善臨床癥狀外，對(duì)大多數(shù)疾病目前尚無特效的治療方法。例如缺血性中風(fēng)的治療策略主要包括溶栓治療和神經(jīng)保護(hù)治療。溶栓藥物阿替普酶（rt-pa）是首個(gè)也是迄今為止唯一被fda批準(zhǔn)用于治療中風(fēng)的溶栓藥物。盡管rt-pa已經(jīng)被證實(shí)能有效治療急性缺血性中風(fēng)，但其治療時(shí)間窗窄，作用機(jī)理不明確，有出血風(fēng)險(xiǎn)，因此只有少數(shù)病人能夠及時(shí)接受rt-pa的有效治療。復(fù)方左旋多巴是治療pd的首選藥物，但患者長(zhǎng)期服用會(huì)出現(xiàn)開關(guān)現(xiàn)象、劑末惡化等嚴(yán)重并發(fā)癥。因此開展神經(jīng)保護(hù)性治療，可能推遲發(fā)病時(shí)間或延緩病情的發(fā)展，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

神經(jīng)保護(hù)治療是通過阻礙缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)涉及的一種或多種機(jī)制，在初始階段保護(hù)缺血引起的半暗帶神經(jīng)元損傷，從而阻止或延遲神經(jīng)細(xì)胞死亡。可以通過藥物實(shí)現(xiàn)血液迅速回流入缺血組織，從而抑制缺血所引起的生化水平、代謝水平和細(xì)胞水平上的損害。腦缺血觸發(fā)了復(fù)雜的病理生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，神經(jīng)保護(hù)治療的途徑多樣，環(huán)節(jié)不同，神經(jīng)保護(hù)的前景是很可觀的。實(shí)際中，仍需要更為有效且副作用小的神經(jīng)保護(hù)劑。

小駁骨為雙子葉植物爵床科小駁骨屬植物小駁骨gendarussavulgarisnee.的干燥地上部分，全年均可采收。小駁骨又名接骨草、烏骨黃藤、裹籬樵等。其味辛、苦，性平，歸肝、腎、肺經(jīng)，具有祛瘀陣痛，續(xù)筋接骨之功效，用于跌打損傷、筋傷骨折、風(fēng)濕骨痛、血瘀經(jīng)閉及產(chǎn)后陣痛。小駁骨在我國(guó)民間應(yīng)用廣泛，內(nèi)服多用水簡(jiǎn)或研末沖服，外用則取鮮品搗爛，或用酒調(diào)后熱敷患處，《本草綱目拾遺》、《生草藥性備要》、《嶺南采藥錄》《陸川本草》等醫(yī)藥古籍中均有記載。因其續(xù)筋接骨之力特強(qiáng)，故有“小駁骨丹”之稱。它生于屋前屋后，村過村旁，山下池邊等陰濕處，常栽培為綠蘺。它的主要產(chǎn)地為廣東、香港、海南和廣西等地。

小駁骨為民間常用藥，易栽培，常常用做綠化景觀植物，夏季和秋季均可采收，具有原料易得的優(yōu)勢(shì)。小駁骨作為傳統(tǒng)中藥，具有使用時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)其毒副作用有相應(yīng)認(rèn)知，有相應(yīng)的病例可查詢。目前，尚無資料表明其對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明一方面提供一種小駁骨提取物作為神經(jīng)保護(hù)劑的應(yīng)用，其中所述小駁骨提取物的制備方法包括以下步驟：（1）將小駁骨全草用溶劑提取，所述溶劑選自水、甲醇、乙醇、異丙醇、1-丁醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、丙酮、乙酸乙酯或其組合；（2）分離提取液和殘?jiān)?，將獲得提取液濃縮；（3）將濃縮后的提取液干燥后得到所述的小駁骨提取物。

在一些實(shí)施方式中，其中所述小駁骨全草與提取的溶劑的重量比1:5~20，優(yōu)選重量比為1:10；所述溶劑為乙醇水溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30-95%，優(yōu)選為95%；所述提取的條件為30-90℃超聲提取15-60min，優(yōu)選為60℃超聲提取30min；所述濃縮為蒸發(fā)濃縮、減壓濃縮、膜濃縮，優(yōu)選的濃縮方式為減壓濃縮，更優(yōu)選為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)；所述干燥為常壓干燥、減壓干燥、真空冷凍干燥、噴霧干燥，優(yōu)選的干燥方式為常壓干燥。

本發(fā)明另一方面小駁骨提取物在制備治療、輔助治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述小駁骨提取物的制備方法包括以下步驟：（1）將小駁骨全草用溶劑提取，所述溶劑選自水、甲醇、乙醇、異丙醇、1-丁醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、丙酮、乙酸乙酯或其組合；（2）分離提取液和殘?jiān)?，將獲得提取液濃縮；（3）將濃縮后的提取液干燥后得到所述的小駁骨提取物。

在一些實(shí)施方式中，其中所述小駁骨全草與提取的溶劑的重量比1:5~20，優(yōu)選重量比為1:10；所述溶劑為乙醇水溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30-95%，優(yōu)選為95%；所述提取的條件為30-90℃超聲提取15-60min，優(yōu)選為60℃超聲提取30min；所述濃縮為蒸發(fā)濃縮、減壓濃縮、膜濃縮，優(yōu)選的濃縮方式為減壓濃縮，更優(yōu)選為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)；所述干燥為常壓干燥、減壓干燥、真空冷凍干燥、噴霧干燥，優(yōu)選的干燥方式為常壓干燥。

在一些實(shí)施方式中，所述神經(jīng)退行性疾病包括帕金森病、阿爾茲海默癥、腦中風(fēng)引起的神經(jīng)損傷。

在一些實(shí)施方式中，所述藥物為藥物組合物，所述藥物組合包含任選地藥學(xué)上可接受的載體或輔料。

本發(fā)明證實(shí)了小駁骨提取物具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)中樞神經(jīng)元逐漸發(fā)生變性、凋亡具有療效，從而為治療中樞神經(jīng)變性疾病提供良好的前景。

附圖說明

圖1顯示了mtt法檢測(cè)的小駁骨提取物對(duì)l-glutamate誘導(dǎo)ht-22細(xì)胞的保護(hù)作用。^**p<0.01,^***p<0.001與谷氨酸組比較(單因素方差分析，dunnett法)。trolox（10μm)作為陽性對(duì)照使用。

圖2顯示了顯微鏡下觀察的小駁骨提取物對(duì)l-glutamate誘導(dǎo)ht-22細(xì)胞的保護(hù)作用。

具體實(shí)施方式

神經(jīng)保護(hù)劑

本發(fā)明涉及的術(shù)語“神經(jīng)保護(hù)劑”是指有助于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受細(xì)胞損傷和/或抵抗神經(jīng)變性過程以及神經(jīng)元功能損害的治療劑或活性物質(zhì)。

藥學(xué)上可接受的載體和輔料

小駁骨提取物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿?、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。

此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。

小駁骨提取物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重及個(gè)體反應(yīng)，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥。

可改變藥物組合物中各活性成分的實(shí)際劑量水平，以便所得的活性化合物量能有效針對(duì)具體患者、組合物和給藥方式得到所需的治療反應(yīng)。劑量水平須根據(jù)具體化合物的活性、給藥途徑、所治療病況的嚴(yán)重程度以及待治療患者的病況和既往病史來選定。但是，本領(lǐng)域的做法是，化合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。

神經(jīng)退行性疾病

本發(fā)明涉及術(shù)語“神經(jīng)變性疾病”包括，但不限于，帕金森病、阿爾茲海默病、亨廷頓病、tau蛋白病（如，額顳癡呆、皮層基底節(jié)變性、皮克氏病、進(jìn)行性核上性麻痹）、威爾遜氏病、朊病毒病及其他癡呆包括血管性癡呆、肌萎縮側(cè)索硬化（als）、急性中風(fēng)（腦中風(fēng)引起的神經(jīng)損傷）及其他外傷性損傷；腦血管意外（如，年齡相關(guān)性黃斑變性）；腦和脊髓外傷、周圍神經(jīng)病、視網(wǎng)膜病和青光眼。

提取物

實(shí)施例1

小駁骨提取物的制備

稱取小駁骨（30.11g），置于三角瓶中，加入300毫升95%乙醇，60℃超聲提取30min，濾過，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏狀后置于蒸發(fā)皿中蒸干，于恒溫烘箱內(nèi)（50℃）烘至恒重。稱重，得0.84g。產(chǎn)率為2.79%。密封后置于冰箱冷凍儲(chǔ)存，備用。

實(shí)施例2

小駁骨提取物的神經(jīng)保護(hù)測(cè)試

ht-22神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)

將（三批）ht-22細(xì)胞用胰酶（0.25%,1ml）從中皿消化下來（1min內(nèi)），吹散成單細(xì)胞懸液，加入少量胎牛血清fbs（100μl），1000rpm離心5min，去上清，將細(xì)胞沉淀分散在3ml完全培養(yǎng)基中，取1ml細(xì)胞懸液加入到24ml完全培養(yǎng)基中，來回顛倒10次混勻，取0.1ml用于計(jì)數(shù)。稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度（8×10⁴cell/ml）后，48孔板先加50μl培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基徹底分布于孔板邊緣。種植在48孔板中（三批細(xì)胞三塊板，100μl，8×10⁴cell/ml）。邊種邊旋轉(zhuǎn)離心管，種一半孔用力吹打細(xì)胞，使之均勻，同時(shí)讓細(xì)胞懸液鋪滿孔板底部，全部種完后在顯微鏡下觀察細(xì)胞分散是否均勻，十字搖勻使細(xì)胞在孔板底部分散均勻。放置24小時(shí)（細(xì)胞融合度約為30~40%）用于實(shí)驗(yàn)。

(1)mtt法測(cè)試

將實(shí)施例1中獲得小駁骨提取物200μg分散于2ml完全培養(yǎng)基中，用于3×48孔板換液，做mtt實(shí)驗(yàn)。取種好細(xì)胞的48孔板，分為control（對(duì)照組），glutamate（谷氨酸）組，nac（n-acetylcysteine）（n-乙酰半胱氨酸），trolox（水溶性維生素e）組和樣品組(小駁骨提取物組)，每組三個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)基換液，每孔200μl，每次換液前，吹打培養(yǎng)基，使藥物分散均勻。換液完37℃孵育1h后加入谷氨酸使終濃度達(dá)到3mm（6μl）。搖勻后放置在37℃培養(yǎng)24h。觀察細(xì)胞形態(tài)，并檢測(cè)細(xì)胞存活率（mtt法）,然后用20μlmtt（5mg/ml）避光37℃孵育2h，輕輕吸去液體，每孔加200μldmso，搖床5min搖勻。然后用多功能酶標(biāo)儀計(jì)算490nm下各吸光值（下面圖中數(shù)據(jù)均為490nm下測(cè)得,損傷組細(xì)胞存活率約為control組的20%）。取三孔o(hù)d值，求平均值，減去空白dmso的od值，然后除以對(duì)照組的平均值標(biāo)準(zhǔn)化。三批細(xì)胞的mtt的od值的平均值用sigmaplot12.5軟件做統(tǒng)計(jì)差異。如圖1所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小駁骨提取物對(duì)于ht-22細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用。

(2)顯微鏡下觀察的小駁骨提取物的保護(hù)作用

將實(shí)施例1中獲得小駁骨提取物20μg分散于2ml完全培養(yǎng)基中，用于3×48孔板換液。取種好細(xì)胞的48孔板，分別是control組，glutamate組，glu（glutamate）+nac（n-acetylcysteine）組，glu+trolox和glu+樣品組(小駁骨提取物組)，每組三個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)基換液，每孔200μl，每次換液前，吹打培養(yǎng)基，使藥物分散均勻。換液完37℃孵育1h后加入谷氨酸使終濃度達(dá)到3mm（6μl）。搖勻后放置在37℃培養(yǎng)24h。最后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照，結(jié)果如圖2所示，小駁骨提取物可以使細(xì)胞保持健康形態(tài)和增殖，抑制了l-glutamate（l-谷氨酸）引起的細(xì)胞凋亡。