一種具有潛在治療帕金森病的藥物的制作方法

本發(fā)明涉及一種具有潛在治療帕金森病的藥物，屬于醫(yī)學(xué)神經(jīng)藥理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

帕金森病(parkinson’sdisease，pd)是最常見的運動神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為：靜止震顫、行動遲緩、站立不穩(wěn)以及姿勢反射障礙。帕金森病患者腦部的主要病變部位為黑質(zhì)及紋狀體，其中黑質(zhì)致密部內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的死亡和數(shù)量減少是造成投射到紋狀體內(nèi)多巴胺減少的直接原因。目前，pd的致病機制還不太明確，但與糖尿病并發(fā)腦病引起的氧化損傷、海馬神經(jīng)元細胞凋亡等疾病具有明顯的區(qū)別。

pd作為僅次于阿爾茨海默癥的第二大神經(jīng)退行性疾病，帕金森病隨年齡的增加其發(fā)病率和患病率均急劇增加，在60歲以上老年人中患病率達1％，85歲以上人群達5％-6％，目前我國的帕金森病患者數(shù)量超過200萬。pd的病因與老化、環(huán)境及遺傳因素有關(guān)，而pd發(fā)病機制目前仍不明確。但研究表明，氧化應(yīng)激損傷、免疫炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡等病理機制相互作用，可能引起了pd的發(fā)生和發(fā)展。目前我國已逐漸進入老齡化社會，隨著老齡人口的增加，pd患者的數(shù)量也將迅速增加。pd不僅在行動上給患者造成不便，有的患者可有精神和智能障礙，使成千上萬的家庭在精神上也備受折磨，因此，從多途徑治療pd已成為當今的研究熱點。

目前臨床針對帕金森病的治療主要有化學(xué)藥物治療和外科手術(shù)治療，以及仍處于實驗階段的細胞治療和基因治療。化學(xué)藥物治療將復(fù)方左旋多巴制劑作為治療pd的“金標準”，但這是以進一步傷害多巴胺能神經(jīng)元的功能狀態(tài)為代價，短期療效，在控制癥狀方面優(yōu)于中藥，但長期應(yīng)用，毒副作用大，不僅療效隨時間延長而逐漸減弱、終止，而且會加快患者現(xiàn)有多巴胺能神經(jīng)元的死亡速度，從長期效果觀察無異于飲鴆止渴。中藥單體以其毒副作用小、療效持久和整體調(diào)節(jié)好等優(yōu)勢，已成為近年來防治pd新藥的研究導(dǎo)向。

目前，已有報道一些用于防治pd的中藥組合物，但是這些組合物一般原料配方比較復(fù)雜、需要對原料進行浸提等復(fù)雜的處理而導(dǎo)致用藥繁瑣，而且具體是哪些成分發(fā)揮了相應(yīng)的作用也是不明確的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有臨床治療帕金森病藥物的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有潛在治療帕金森病作用的藥物。

本發(fā)明通過建立c57bl/6j小鼠帕金森病模型，觀察桃葉珊瑚苷對帕金森病小鼠運動障礙癥狀，通過實驗論證，桃葉珊瑚苷能改善帕金森病小鼠的運動遲緩癥狀，減少紋狀體多巴胺含量的降低以及改善黑質(zhì)致密部神經(jīng)元，從而證明桃葉珊瑚苷對帕金森病具有神經(jīng)保護作用。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種預(yù)防和/或緩解和/或輔助治療和/或治療帕金森病的藥物或者藥物組合物，所述藥物或者藥物組合物以桃葉珊瑚苷作為有效成分或者主要有效成分。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥物或者藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的賦型劑。所述藥學(xué)上可接受的賦型劑是指任何可用于藥學(xué)領(lǐng)域的稀釋劑、輔助劑和/或載體。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥物或者藥物組合物中含有質(zhì)量百分比大于99％的桃葉珊瑚苷和質(zhì)量百分比小于1％的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明的桃葉珊瑚苷可以與其他活性成分組合使用，只要它們不產(chǎn)生其他不利的作用，例如過敏反應(yīng)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明的藥物或者藥物組合物可配制成若干種劑型，其中含有藥學(xué)領(lǐng)域中常用的一些賦形劑；例如，口服制劑(如片劑，膠囊劑，溶液或混懸液)；可注射的制劑(如可注射的溶液或混懸液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制劑(例如軟膏或溶液)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，用于本發(fā)明藥物組合物的載體是藥學(xué)領(lǐng)域中可得到的常見類型，包括：口服制劑用的粘合劑、潤滑劑、崩解劑、助溶劑、稀釋劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、無色素、矯味劑等；可注射制劑用的防腐劑、加溶劑、穩(wěn)定劑等；局部制劑用的基質(zhì)、稀釋劑、潤滑劑、防腐劑等。藥物制劑可以經(jīng)口服或胃腸外方式(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或局部)給藥，如果某些藥物在胃部條件下是不穩(wěn)定的，可將其配制成腸衣片劑。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種改善運動能力的藥物，所述藥物以桃葉珊瑚苷作為有效成分或者主要有效成分。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種改善黑質(zhì)致密部的酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元細胞分布和形態(tài)的藥物，所述藥物以桃葉珊瑚苷作為有效成分或者主要有效成分。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種提高紋狀體內(nèi)酪氨酸羥化酶表達的藥物，所述藥物以桃葉珊瑚苷作為有效成分或者主要有效成分。

發(fā)明的第五個目的是提供桃葉珊瑚苷的新應(yīng)用。所述應(yīng)用，是制備預(yù)防和/或緩解和/或輔助治療和/或治療帕金森病的藥物、保健食品、飲品、腸內(nèi)營養(yǎng)制劑、膳食補充劑、獸藥或者飼料添加劑。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明通過建立小鼠帕金森病模型，通過實驗論證，桃葉珊瑚苷能改善帕金森病模型小鼠的運動遲緩癥狀，減少紋狀體多巴胺含量的降低以及改善黑質(zhì)致密部神經(jīng)元，從而證明桃葉珊瑚苷對帕金森病具有神經(jīng)保護作用。本發(fā)明采用桃葉珊瑚苷，而不需要復(fù)雜的原料配方、也不需要對原料復(fù)雜的處理，非常簡便。

附圖說明

圖1：桃葉珊瑚苷對mptp誘導(dǎo)帕金森模型小鼠的爬竿實驗行為學(xué)實驗結(jié)果圖；

圖2：桃葉珊瑚苷對mptp誘導(dǎo)帕金森模型小鼠紋狀體多巴胺含量實驗結(jié)果圖；

圖3：桃葉珊瑚苷對mptp誘導(dǎo)帕金森模型小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺神經(jīng)元細胞的影響圖；

圖4：桃葉珊瑚苷對mptp誘導(dǎo)帕金森模型小鼠紋狀體westernblot蛋白印記圖；

圖5：桃葉珊瑚苷對mptp誘導(dǎo)帕金森模型小鼠紋狀體westernblot蛋白印記的灰度統(tǒng)計分析圖。

具體實施方案

下面通過具體實施進一步闡述本發(fā)明方法，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1：動物模型的建立和分組

體重20-25g，8周齡，雄性c57bl/6小鼠，隨機分為空白組，mptp模型組(先給mptp后給生理鹽水)，桃葉珊瑚苷給藥組(先給mptp后給桃葉珊瑚苷)，每組20只。置于23±2℃，照明時間為12h/day，動物適應(yīng)環(huán)境一周后開始給予藥物。mptp模型組每日腹腔注射mptp(30mg/kg)一次，連續(xù)5天，后每日腹腔注射生理鹽水一次，連續(xù)7天。給藥組每日腹腔注射mptp(30mg/kg)一次，連續(xù)5天，后每日腹腔注射桃葉珊瑚苷(50mg/kg)溶液一次，連續(xù)7天?？瞻捉M全程給予生理鹽水，連續(xù)12天。隨后通過爬桿實驗對小鼠的行為學(xué)進行評價，然后通過免疫熒光檢測黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的變化，紋狀體hplc檢測紋狀體內(nèi)多巴胺的含量，westernblot檢測酪氨酸羥化酶表達情況。通過以上方法來評價桃葉珊瑚苷對帕金森病小鼠的神經(jīng)保護作用。

一、行為學(xué)評價

各組小鼠分別在給予行為學(xué)檢測前三天進行訓(xùn)練，每天一次，于給藥結(jié)束后第一天進行行為學(xué)檢測。

爬桿實驗(poletest)：自制爬桿架：選擇長55cm，直徑lcm的金屬管，外緊裹紗布防滑，上端覆以直徑2cm的球形突起(實驗時作為小鼠的附著點)，然后將其固定于金屬底座，放置在鼠籠中，底座用敷料覆蓋。測試時將小鼠頭朝上置于球形突起，記錄其自放置桿至爬至桿底后肢著地的時間，測3次取平均值，每次間隔10分鐘以上。如小鼠出現(xiàn)中途停頓或反向攀爬，則重新測量。該實驗動物要經(jīng)過提前訓(xùn)練3天。

利用爬桿實驗檢測小鼠運動能力，如圖1所示。檢測結(jié)果顯示，空白組、模型組、給藥組的小鼠的爬桿所需時間分別為4.055s、4.868s、3.921s。與空白組小鼠比較，模型組小鼠爬桿所需時間增加20.05％，運動的速度減慢。結(jié)果證實注射mptp的模型組小鼠活動能力減弱。桃葉珊瑚苷給藥組的小鼠較模型組小鼠所需時間減少，速度較快，與模型組比較具有極顯著性差異(p<0.001)，而且比空白組還略有減少。結(jié)果證實桃葉珊瑚苷能改善帕金森病小鼠的運動能力。

二、hplc-fld檢測紋狀體內(nèi)多巴胺的含量

(1)樣品處理

每組取8只小鼠，使用異氟烷吸入式麻醉，剪破右心耳，從左心室進針灌注生理鹽水，取大腦剝離雙側(cè)紋狀體，所有操作均在冰浴上進行，所得取材立即轉(zhuǎn)移到-80℃保存。紋狀體加入0.1mol/l高氯酸0.2ml勻漿，13000r/min，4℃離心5min，0.2μm濾膜過濾，-20℃儲存?zhèn)溆?。采用hplc-fld法檢測小鼠腦紋狀體da含量。

(2)hplc-fld檢測

(a)色譜柱：美國waters公司atlantist3(4.6mm×150mm，5μm)；保護柱：美國waters公司(4.6mm×20mm，5μm，gdcrt)；流動相的配制：0.01mol/lpbs磷酸緩沖液試劑包(超純水溶解到1l并調(diào)節(jié)ph到合適范圍)，乙腈，超純水，0.2μm濾膜過濾后超聲脫氣備用；柱溫：30℃；流速：0.8ml/min；熒光檢測器：激發(fā)波長280nm，吸收波長320nm。

(b)標準曲線的制備

將da對照品用甲醇溶液(含有10％超純水)制成濃度為1mg/ml的貯備液，再用甲醇溶液稀釋成0.2，0.4，1，2，4μg/ml的對照品溶液，取10μl注入色譜儀進行分析，得到對照品溶液色譜圖。以各對照品溶液的濃度為橫坐標(x)，各組分的峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸，得到標準曲線方程。

da：y＝2636864.1874x+16039.6352，r＝0.999

(3)實驗結(jié)果

如圖2所示，與空白組的正常小鼠比較，未經(jīng)給藥的模型組帕金森病小鼠多巴胺含量明顯下降，下降了66.1％。然而桃葉珊瑚苷給藥組的帕金病小鼠紋狀體多巴胺含量較模型組相比有顯著的升高(p<0.05)，結(jié)果證實桃葉珊瑚苷能減少帕金病小鼠紋狀體多巴胺含量的降低。

三、免疫組化法檢測小鼠大腦黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的變化

(1)樣品處理

每組取4只小鼠，使用異氟烷吸入式麻醉，剪破右心耳，從左心室進針灌注生理鹽水，沖洗血液后灌注體積百分數(shù)為4％的多聚甲醛50ml。開顱取腦，浸入4％的多聚甲醛固定。經(jīng)梯度蔗糖溶液脫水，組織膠包埋制成冰凍切片(6μm)。

(2)免疫熒光

取腦組織黑質(zhì)部位冠狀切片3張，55℃烘片30min，用檸檬酸鹽緩沖液95℃水浴修復(fù)抗原，冷卻后pbs浸洗10min×2次，體積分數(shù)為5％山羊血清室溫孵育lh，加酪氨酸羥化酶(th)一抗(體積比為1:1000)4℃孵育過夜，加熒光二抗(1:1000)室溫避光孵育1h，避光顯色5min，封片，避光保存。

(3)實驗結(jié)果

結(jié)果如圖3所示，以空白組的正常小鼠為基準，未經(jīng)治療的帕金森病小鼠的神經(jīng)元細胞數(shù)目下降明顯，桃葉珊瑚苷給藥組的帕金病小鼠的神經(jīng)元細胞數(shù)目較模型組有所上升。由此可見，本發(fā)明使用的桃葉珊瑚苷對帕金森病小鼠黑質(zhì)致密部的酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元細胞分布和形態(tài)具有良好的改善作用。

四、westernblot檢測紋狀體酪氨酸羥化酶水平變化

(1)樣品處理

每組取6只小鼠，使用異氟烷吸入式麻醉，剪破右心耳，從左心室進針灌注生理鹽水，取大腦剝離雙側(cè)紋狀體，所有操作均在冰浴上進行，所得取材暫存于干冰后立即轉(zhuǎn)移到-80℃保存。紋狀體加入0.2mlripa和2μlpmsf勻漿，13000r/min，4℃離心5min，取上清液分裝，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

(2)bca法檢測紋狀體總蛋白濃度

配制工作液：根據(jù)標準品和樣品的數(shù)量，按50倍體積的bca試劑加入1倍體積的cu試劑(50:1)配制bca工作液。稀釋標準品：取bsa標準品溶液，用pbs稀釋成0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000μg/ml標準品液。將樣品取適量加到96孔板的樣品孔中，用pbs補足。各孔加入200μlbca工作液，37℃反應(yīng)30min，用酶標儀測定562nm的吸光度，以不含bsa的樣品吸光值為空白獨照。制作標準曲線，以a562為縱坐標，bsa含量為橫坐標，計算樣品的蛋白濃度。

(3)sds-page電泳、轉(zhuǎn)膜

電泳：所提取的蛋白樣品測定濃度以后，用ripa溶液將其調(diào)到一致濃度，加入上樣緩沖液，水浴煮沸5min，取適量蛋白上樣，恒壓80v電泳。轉(zhuǎn)膜：剪適當大小的pvdf膜，用甲醇活化，后用去離子水浸泡后置入轉(zhuǎn)膜液，將海綿—濾紙—page膠—pvdf膜—濾紙—海綿順序夾好，加入轉(zhuǎn)膜液，將整個電泳槽放在冰上，恒流轉(zhuǎn)膜。

(4)封閉、抗體孵育以及顯色

封閉：將膜置于含有5％的胎牛血清溶液(bsa，tbst溶液配制)的容器置于水平搖床上室溫封閉1小時。一抗孵育：封閉完成以后根據(jù)蛋白marker將含有th、gadph的條帶剪下，將剪好的膜分別浸于相應(yīng)的一抗抗體工作液(5％bsa配制)，4℃搖床過夜。二抗孵育：將孵育一抗過夜的膜從4℃取出，用tbst在搖床上輕搖洗膜，后使用hrp標記的二抗工作液(5％bsa配制)孵育，室溫搖床1h，之后用tbst在搖床上輕搖洗膜。ecl顯色：將膜從洗膜液中取出，適當控干水分，放入凝膠成像儀中，加入ecl顯色液顯像。

(5)實驗結(jié)果

結(jié)果如圖4～5所示。與空白組正常小鼠對比，以gadph為內(nèi)參的情況下，未經(jīng)給藥的帕金森病小鼠的酪氨酸羥化酶th的表達下降明顯(下降了50.9％)，桃葉珊瑚苷給藥組的帕金病小鼠的th表達有所上升(相對于未經(jīng)給藥的帕金森病小鼠的酪氨酸羥化酶th的表達上升了64.7％)。本發(fā)明使用桃葉珊瑚苷有助于增加帕金森病小鼠紋狀體內(nèi)酪氨酸羥化酶表達。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。