本發(fā)明涉及健康保健及美容領(lǐng)域，具體涉及生物活性物質(zhì)的制備方法及其應(yīng)用，特別涉及蜂皇胎因子提取液、胎盤轉(zhuǎn)錄因子提取液、蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子提取液在制備護(hù)膚品方面的應(yīng)用，尤其是在潤膚霜方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1949年lawrence發(fā)明轉(zhuǎn)移因子(transferfactor，tf)，1969年levin首先應(yīng)用tf治療一例免疫缺陷病獲得成功。胎盤制備轉(zhuǎn)移因子，實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用具有生物活性肽、核酸、23種微量元素等。人胎盤含有特異的轉(zhuǎn)錄因子312種(23.p65)；臨床試用對(duì)白塞氏綜合癥、硬皮病、銀屑病、白細(xì)胞減少癥、乙型腦炎、慢性乙型肝炎、丙肝、復(fù)發(fā)性單純皰疹、紅斑狼瘡治愈以及配合化療治療惡性腫瘤，均有一定效果?？蔂I養(yǎng)保護(hù)皮膚彈性柔軟，對(duì)皮膚有美容作用。對(duì)急慢性皮炎、皮膚色斑(老年斑)色素沉著顯著消退。
人胎盤有312種轉(zhuǎn)錄因子(tf)本品含量：以生物活性多肽計(jì)大于2mg/ml。
①胎盤tf是美容圣品，可以改善粗糙老化皮膚，淡化皮膚上的斑點(diǎn)，美白皮膚。胎盤tf既無抑制酪氨酸酶的作用，也沒有破壞黑色素或還原黑色素的作用。它的美白機(jī)理可以從“活化細(xì)胞”的角度來解釋：細(xì)胞被活化，新陳代謝的功能提高，色素代謝的功能增強(qiáng)，角質(zhì)更新代謝正常，皮膚就自然白皙。
②核酸：(dnarna)本品含量：e＝7.8，a260/a280比值大于1.8以上。脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic、dna):細(xì)胞核內(nèi)的功能為：復(fù)制dna及蛋白質(zhì)的合成。dna缺乏時(shí)，皮膚無適當(dāng)?shù)男律?xì)胞補(bǔ)給，就易形成老化現(xiàn)象。臨床應(yīng)用：小分子胎盤dna可以被皮膚吸收，合成新細(xì)胞的遺傳構(gòu)件，使細(xì)胞處于生命力旺盛的狀態(tài)，細(xì)胞更新速度快，從而起到抗皺抗衰老作用。
③微量元素：本品胎盤轉(zhuǎn)錄因子(hp-tf)含23種微量元素(見表4)。微量元素在抗衰老中的作用是近年國際上衰老生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。大量研究表明：細(xì)胞復(fù)制、抑制自由基、提高免疫功能與抗衰老密切的微量元素主要有鋅、硒、胎盤硒(se)含量0.18-0.52mg/kg、銅、錳。
④膠原蛋白(collagen)、hp-tf水解氨基酸含量(見表2)?？扇苄阅z原蛋白水解含15種氨基酸營養(yǎng)物質(zhì)，易被皮膚吸收，能促進(jìn)表皮細(xì)胞活力，增加營養(yǎng)，有效消除皮膚的細(xì)小皺紋。
蜂皇胎、蜂王漿功能：可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，加速機(jī)體的新陳代謝，增強(qiáng)組織細(xì)胞再生能力。蜂皇胎因子與蜂王漿因子是納米小分子生物活性物質(zhì)，能滲透入皮膚組織，可以使皮膚保持嬌嫩、細(xì)膩、有光澤并富有彈性。因內(nèi)分泌失調(diào)引起的各種皮膚色斑、色素沉著、妊娠斑、老年斑基本消退治愈。
蛋白質(zhì)組學(xué)近十余年迅速成長和成熟的學(xué)科。蛋白質(zhì)組學(xué)綜合的觀點(diǎn)：即為了建立和維持一個(gè)正常運(yùn)行的生物系統(tǒng)，蛋白質(zhì)是如何行使功能和協(xié)同作用的。
提取的核酸與多肽經(jīng)蛋白質(zhì)可逆性實(shí)驗(yàn)：可變殘基(短肽)的改變不影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象與功能。本品經(jīng)過變溫實(shí)驗(yàn)可以使氨基酸序列(短肽)回復(fù)成一級(jí)結(jié)構(gòu)。變性復(fù)性實(shí)驗(yàn)證明氨基酸、核糖核酸酶回復(fù)空間結(jié)構(gòu)和功能。臨床治愈自身免疫缺陷、sle、behcet、黃褐斑等疾病。
蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)功能性高分子(也稱為功能性大分子)：蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的主要功能包括催化生物體內(nèi)的反應(yīng)(酶)、代謝調(diào)節(jié)(多肽激素，如胰島素)、機(jī)體運(yùn)動(dòng)(肌肉蛋白、纖毛蛋白和鞭毛蛋白)、物質(zhì)運(yùn)輸(血紅蛋白和膜運(yùn)輸?shù)鞍?、免疫(抗體)、遺傳控制(復(fù)制裝置—dna聚合酶和螺旋-去穩(wěn)定蛋白共同構(gòu)成)[6]。
目前基因治療的概念有了較大的擴(kuò)展，凡是采用分子生物學(xué)的方法和原理，在核酸水平上開展的疾病治療方法都可稱為基因治療。帶有遺傳信息的dna片斷稱為基因。
基因治療有兩種途徑，一是exvivo法(體外法)，是將受體細(xì)胞在體外培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入外源基因，經(jīng)過適當(dāng)?shù)倪x擇系統(tǒng)，把重組的受體細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，讓外源基因表達(dá)以改善患者癥狀；二是invivo法(體內(nèi)法)，此法不需要細(xì)胞移植，直接將外源dna注射至肌體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)而發(fā)揮治療作用(吸入、口服、肌內(nèi)注射、靜脈注射)。invivo法比exvivo法更簡單、直接和經(jīng)濟(jì)，治療也比較確切，常用的體內(nèi)基因直接轉(zhuǎn)移手段有病毒介導(dǎo)、脂質(zhì)體介導(dǎo)和基因直接注射等。我們1977年發(fā)明人胎盤轉(zhuǎn)移因子(注射、口服、外用)。hp-tf內(nèi)含有核酸(dna、rna)和蛋白質(zhì)氨基酸(小分子多肽)的混合物，在某些情況下核酸是以其和蛋白質(zhì)構(gòu)成的絡(luò)合物，形式表現(xiàn)生物活性的。其體內(nèi)法(invivo)基因治療作用；對(duì)患者基因置換(genereplacement)，基因修正(genecorrection)，基因修飾(geneaugmentation)，基因激活(geneactivation)，基因失活(geneinactivation)，免疫調(diào)節(jié)(immuneadjuetment).臨床應(yīng)用用治愈多種疾病，是體內(nèi)法(invivo)基因療法的應(yīng)用[22]。
基因與蛋白質(zhì)修飾：dna，又稱脫氧核糖核酸，也稱“遺傳微?！?，是染色體的主要化學(xué)成分。dna是一種分子，可組成遺傳指令，以引導(dǎo)生物發(fā)育和生命機(jī)能運(yùn)作，其主要功能是長期性的信息儲(chǔ)存，可比喻為“藍(lán)圖”或“食譜”，其中所包含的指令，是建構(gòu)細(xì)胞內(nèi)其他化合物如蛋白質(zhì)與rna所必需的。帶有遺傳信息的dna片段稱為基因。其他的dna序列，有些直接以自身構(gòu)造發(fā)揮作用，有些則參與調(diào)控遺傳信息的表達(dá)。
早在20世紀(jì)30年代就已經(jīng)確定了dna的化學(xué)構(gòu)成，它由4種稱為核苷酸(nucleotide)的基本單位組成，其中堿基有4種，分別是腺嘌呤(adenine)、鳥嘌呤(guanine)、胸腺嘧啶(thymine)和胞嘧啶(cytosine).dna分子是由許多核苷酸連接而成與另一個(gè)核苷酸的磷酸基連接在一起，形成糖-磷酸基骨架，構(gòu)成了dna主鏈。
奧柯亞題為“合成的多核苷酸和氨基酸密碼v“的論文，用亞硝酸處理煙草花葉病毒的rna會(huì)導(dǎo)致單個(gè)堿基氧化脫氧，這種脫氧作用會(huì)發(fā)生兩種變化，使尿嘧啶取代了胞嘧啶，即導(dǎo)致c-u的置換；使鳥嘌呤取代了腺嘌呤，即a-g的置換。由于核苷酸鏈上的堿基置換，改變了它們的核苷酸序列，從而造成了這個(gè)蛋白質(zhì)多肽中在某個(gè)特定位置上一個(gè)氨基酸被另一個(gè)氨基酸被置換。
核酸的特性完全是由它的堿基序列表示的，而這個(gè)序列就是特定蛋白質(zhì)氨基酸序列的密碼。也就是說核酸中的核苷酸序列規(guī)定了蛋白質(zhì)中的氨基酸序列。
核酸體是蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞器，執(zhí)行著蛋白質(zhì)合成的功能。以完成將遺傳信息從mrna到多肽鏈的轉(zhuǎn)錄。
肽鏈則是由一個(gè)氨基酸的羰基與另一個(gè)氨基酸的氨基縮去一個(gè)水分子生成的，以這種方式結(jié)合的氨基酸鏈叫做多肽。由于肽鍵是共價(jià)的，所以相對(duì)是穩(wěn)定的(cooh,nh2)。
hp-tf是蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用：蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是其空間構(gòu)象的基礎(chǔ)，參與功能活性部位的氨基酸殘基或處于特定構(gòu)象關(guān)鍵部位的氨基酸殘基的改變即會(huì)引起功能的改變，人類有很多疾病都與蛋白質(zhì)異常有關(guān)，如鐮刀形細(xì)胞貧血病(sickle-cellanemin)根本原因是由于遺傳基因突變導(dǎo)致血紅蛋白分子中氨基酸殘基被替換。稱為分子病(moleculardisease)。
hp-tf核酸與活性肽能治療：自身免疫病、紅斑狼瘡(被治愈患者已健康工作32年)、les病毒、乙型與丙型肝炎、behcet綜合癥。
氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)由基因決定，氨基酸按遺傳密碼的順序通過肽鍵連接起來；氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)。治療多種疾病有效，是基因與蛋白質(zhì)(活性肽)的互補(bǔ)與互助，糾正人體細(xì)胞代謝，信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的組織結(jié)構(gòu)作用，使病變組織/細(xì)胞快速凋亡，恢復(fù)正常功能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
技術(shù)問題：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供生物活性物質(zhì)的制備方法，該生物活性物質(zhì)為蜂皇胎轉(zhuǎn)錄因子、胎盤轉(zhuǎn)錄因子或蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子中的一種。
本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供了蜂皇胎轉(zhuǎn)錄因子提取液、胎盤轉(zhuǎn)錄因子提取液、蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子提取液在護(hù)膚品方面的應(yīng)用。
本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種潤膚霜。
本發(fā)明要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供一種潤膚霜的制備方法。
蜂皇胎因子、蜂王漿因子、胎盤轉(zhuǎn)錄因子復(fù)方組合，是美容圣品。
本發(fā)明的潤膚霜由核酸、多肽轉(zhuǎn)錄因子等多種復(fù)合物組成，進(jìn)入人體，替換修飾病變基因細(xì)胞符合蛋白質(zhì)組學(xué)理論與實(shí)踐相結(jié)合的應(yīng)用。
技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了生物活性物質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：
1)預(yù)處理：收集檢測hiv、hbv、hcv、梅毒為陰性的蜂皇胎、胎盤或蜂王漿去雜物，置-18℃以下冷藏；
2)將步驟1)預(yù)處理后的蜂皇胎、胎盤加入生理鹽水稀釋，蜂王漿用95％乙醇稀釋，然后分別用高速勻漿或膠體磨成勻漿置-18℃以下冷凍24～48小時(shí)；
3)將步驟2)得到的三種勻漿分別提取凍溶后，用溫控1～4℃3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，留上清液置于-18℃以下24～48小時(shí)冷凍、取冷凍液置4-10℃融化得到溶解液，取溶解液細(xì)濾，采用中空纖維分子量3000納濾膜超濾得到的濾液即分別為蜂皇胎轉(zhuǎn)錄因子提取液、胎盤轉(zhuǎn)錄因子提取液、蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子提取液。
其中，上述步驟2)中的生理鹽水的質(zhì)量濃度為0.9％。
本發(fā)明內(nèi)容還包括上述的制備方法制備得到的蜂皇胎轉(zhuǎn)錄因子提取液、胎盤轉(zhuǎn)錄因子提取液、蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子提取液在護(hù)膚品方面的應(yīng)用。
一種潤膚霜，其含有制備得到的蜂皇胎轉(zhuǎn)錄因子提取液、胎盤轉(zhuǎn)錄因子提取液、蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子提取液。
其中，上述潤膚霜包括以下組分：
水相：甘油、氫氧化鉀、氫氧化鈉、尼泊金甲脂、去離子水；
油相：硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、1618醇、尼泊金丙脂、鵝油；
添加劑：ve、蜂皇胎轉(zhuǎn)錄因子提取液、胎盤轉(zhuǎn)錄因子提取液、蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子提取液、王漿精、尼泊金乙脂、香精。
單硬脂酸甘油酯：是補(bǔ)助乳化劑有潤膚作用，膏體細(xì)膩、潤滑、穩(wěn)定；冰凍后水分不易離析。
1618醇：助乳化劑具有潤膚、粘稠、促進(jìn)(ab為w/o)皮膚水合作用。賦予皮膚柔軟和平滑(a25為o/w)的感覺，可避免膏霜在長時(shí)間放置和儲(chǔ)存過程中出現(xiàn)變稀、變粗現(xiàn)象。
甘油、鵝油保濕潤膚作用；
koh：硬脂酸與堿類發(fā)生中和作用生成硬脂酸皂。為乳化劑。
胎盤tf、王漿精、蜂皇胎tf等：修復(fù)皮膚組織‘補(bǔ)充水分營養(yǎng)’防紫外線‘抗氧化作用’。
其中，上述潤膚霜按重量百分比包括以下組分：硬脂酸8～10％、單硬脂酸甘油酯0.5～1％、1618醇3～7％、尼泊金丙脂0.1～0.3％、鵝油1～5％、甘油5-12％、氫氧化鉀0.1-0.6％、氫氧化鈉0.1-0.6％、尼泊金甲脂0.1-0.6％、余量為去離子水；添加劑按油相加水相乳化后總量的百分比加入ve0.1％、蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子提取液5-15％、蜂皇胎轉(zhuǎn)錄因子提取液5～15％、胎盤轉(zhuǎn)錄因子提取液5～15％、王漿精5％、尼泊金乙脂0.1％、香精0.5％。
油相：硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、1618醇、尼泊金丙脂、鵝油；
水相：甘油、氫氧化鉀、氫氧化鈉、尼泊金甲脂、去離子水；
添加劑：ve、蜂王漿提取液、蜂皇胎因子提取液、胎盤轉(zhuǎn)移因子提取液、尼泊金乙脂、王漿精、香精。
本發(fā)明內(nèi)容還包括上述的潤膚霜的制備方法，包括以下步驟：
1)將水相、油相分別水浴加溫，水相75-95℃、油相70-85℃，溶解后留置20分鐘；
2)油相過濾后，攪拌加入水相中，攪拌同一方向混勻，中速乳化；
3)乳化后65℃加入添加劑攪勻成膏；
4)靜置陳化24小時(shí)，分裝。
有益效果：相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子潤膚霜是基因治療：潤膚霜是從胚胎干細(xì)胞(es)提取核酸(dnarna)活性多肽、多種活性物質(zhì)；可以治愈皮膚?。杭t斑狼瘡les、青春痤瘡、日光性皮炎、過敏性皮炎、黃褐斑、老年斑消退效果顯著。具有活化細(xì)胞新陳代謝功能，提高再生速率，使病變細(xì)胞快速調(diào)亡，新生皮膚自然白皙。
2)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子具有生物活性物質(zhì)：胎盤和胎兒來自同一個(gè)受精卵，遺傳物質(zhì)相同(30.p62)。人胎盤含312種轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)人體治療疾病優(yōu)點(diǎn)：取材方便、制品安全、應(yīng)用(外用、口服、注射)有效。
3)本發(fā)明的潤膚霜美白、抗衰、除皺成分功能介紹：蜂皇胎、蜂王漿、人胎盤提取的轉(zhuǎn)錄因子無過敏，是3000以下小分子納米技術(shù)。皮膚可吸收、深入表皮、真皮、皮下組織。理化指標(biāo)、生物活性、滅病毒、細(xì)菌(采用：wilfriedfranke(德國)大批量生產(chǎn)人血dle滅毒方法的改進(jìn))產(chǎn)品安全、有效。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
1、材料與方法
1.1材料：蜂皇胎、蜂王漿購于金湖縣老施蜂場。胎盤購于金湖縣醫(yī)院、揚(yáng)州醫(yī)院。其他試劑均為常規(guī)試劑。
1.2主要儀器：紫外分光光度計(jì)、高速低溫離心機(jī)、濾器(中空纖維)、生化自動(dòng)分析儀、凈化工作室、凈化工作臺(tái)、膠體磨、顯微鏡、冰柜、冰箱、真空干燥箱、恒溫水浴箱，批量投產(chǎn)品則另加設(shè)備。大批量生產(chǎn)增加凈化設(shè)備：空氣凈化室、去離子水設(shè)備、生產(chǎn)機(jī)械設(shè)備。
1.3蜂皇胎因子提取方法：
①預(yù)處理：
②處理合格蜂皇胎加入0.9％取蜂皇胎加0.9％生理鹽水，1.5:1(3kg蜂皇胎幼蟲加2kg0.9％氯化鈉冷藏溶液)混勻、高速勻漿。置-18℃以下冷凍24小時(shí)。
③離心：用溫控1℃3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，留上清液置于-18℃以下24小時(shí)冷凍；
④取冷凍液置5℃冷柜融化得到溶解液，取溶解液細(xì)濾(100目)；
⑤鈉濾：采用中空纖維分子量3000納濾膜，超濾得到的濾液即為蜂皇胎轉(zhuǎn)錄因子。
1.4胎盤轉(zhuǎn)錄因子提取方法：
①預(yù)處理：②取合格胎盤加0.9氯化鈉溶液，1:1(5kg胎盤加5kg冷藏5℃0.9％氯化鈉)高速勻漿，置-18℃以下冷凍48小時(shí)。
③凍融離心，用溫控離心機(jī)1℃3000r/min離心15min。
④取上清液，置-18℃以下48小時(shí)冷凍。
⑤凍融：取冷凍液置10℃融化。
⑥離心：取溶解液溫控4℃3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘。
⑦納濾：采用中空纖維分子量3000納濾膜，超濾得到的即為胎盤轉(zhuǎn)錄因子。
1.5蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子提取方法：
①預(yù)處理：
②處理合格的鮮王漿凍融加95％乙醇1:1(10kg蜂王漿加-18℃冷凍95％乙醇10kg)膠體磨勻漿，置-18℃冰柜冷凍24小時(shí)。
③離心：提取凍溶后取王漿液溫控1℃3000轉(zhuǎn)/分15分鐘，留上清液置于-18℃以下36小時(shí)冷凍。
⑤凍融：取冷凍液置4℃冰柜12小時(shí)，細(xì)濾，留濾液。
⑥納濾：用中空纖維分子量3000濾膜，超濾得到蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子。
1.6質(zhì)控：
1)、外觀：上述蜂皇胎因子、蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子、胎盤轉(zhuǎn)錄因子的溶液為澄清白色或微黃色液體。
2)、蛋白質(zhì)：用20％磺基水楊酸，不得出現(xiàn)輕微混濁或沉淀。
3)、ph值：電位法測淀ph應(yīng)為6.5-7.5
4)、hbsag、hcv、hiv標(biāo)準(zhǔn)試劑盒小于2ng/ml(經(jīng)濃縮10倍)，成品經(jīng)60℃10小時(shí)滅菌檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。
5)、紫外吸收值lod值測定。紫外吸收最大值在250-260nm之間紫外吸收光e＝7.8.a260/a280nm大于或等于1.8，多肽含量大于2mg/每單位ml，核糖含量80ug/ml。
6)、層析分析用葡聚糖g25(sephaclex)可見明顯2個(gè)高峰。260nm/280nm有最大吸收值。
7)原子吸收光譜測定產(chǎn)品金屬元素，微量元素。
胎盤轉(zhuǎn)錄因子微量元素分析結(jié)果：
取hp-tf(人胎盤轉(zhuǎn)錄因子)hs-tf(人脾轉(zhuǎn)錄因子)ss-tf(豬脾轉(zhuǎn)錄因子)作微量元素分析結(jié)果：
表1hp-tf、hs-tf和ss-tf微量元素分析
注：1.儀器。美國j-aⅰ100，真空型63道等離子發(fā)射光譜儀；
2.濃度單位ppm。1ppm＝1ug/ml；
3.na超長(tf用0.9％nacl溶解)。
8)、生物學(xué)性質(zhì)：無菌試驗(yàn)，按生物制品規(guī)程檢測應(yīng)無菌生長熱原試驗(yàn)：家兔試驗(yàn)，豚鼠皮下注射法，無化膿、無壞死動(dòng)物健在。
9)生物活性變性與復(fù)性實(shí)驗(yàn)：
①蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)性，一、二級(jí)結(jié)構(gòu)：
氨基酸以肽鍵相互連接構(gòu)成的線性序列稱為蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。
蛋白質(zhì)的變性機(jī)理：蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)分子次鍵的破壞引起二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，失去原有的生物活性，往往減弱或喪失等性質(zhì)的改變?cè)跍睾蜅l件下，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象只是松弛而不是混亂，氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞。當(dāng)變性因素解除后蛋白質(zhì)可恢復(fù)到天然構(gòu)象，這種變性稱可逆變性。
本試驗(yàn)用胎盤轉(zhuǎn)錄因子多肽，經(jīng)變溫后，轉(zhuǎn)錄因子小分子肽段恢復(fù)原狀一級(jí)結(jié)構(gòu)，具有生物活性。
②胎盤轉(zhuǎn)錄因子變性與復(fù)性實(shí)驗(yàn)步驟：
a、取成品胎盤轉(zhuǎn)錄因子(hp-tf)10ml毫升/支，(白色玻璃安瓶，透明液，含多肽12mg/支)取4支。
b、置水浴箱加溫20-37℃，輕輕搖動(dòng)10-30分鐘內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見明顯絮狀。
c、吸取溶液0.05-0.1毫升置載玻片上，用低倍和高倍鏡觀察。
d、可見明顯小分子多肽復(fù)性一級(jí)結(jié)構(gòu)長鏈，形態(tài)、大小均勻，數(shù)量10-20條(低倍視野)高倍鏡可見鏈狀排列一級(jí)結(jié)構(gòu)。無其它形態(tài)及雜物。
e、胎盤轉(zhuǎn)錄因子(hp-tf)解鏈：另取同一批hp-tf成品10支(每支10毫升含多肽12毫克)，置25-37℃水浴箱，輕輕搖動(dòng)10-30分鐘內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見絮狀(即一級(jí)結(jié)構(gòu)形成)，繼續(xù)置水浴箱25-37℃,10-30分鐘，從絮狀出現(xiàn)，又恢復(fù)成透明液體(溫度與核糖體連接多肽)證明hp-tf具有生物活性。
③蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)性一級(jí)二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：
a、可在顯微鏡下觀察肽鏈真實(shí)一級(jí)結(jié)構(gòu)恢復(fù)。
b、本發(fā)明可供批量檢測抽檢，取材方便。
c、工藝操作簡單不需另加試劑。
d、結(jié)果快速、真實(shí)可靠的生物活性檢測方法之一。
④用e玫瑰花試驗(yàn)激活率，高于對(duì)照30％；e-rfc試驗(yàn)，(e玫瑰花試驗(yàn))是指胎盤淋巴細(xì)胞連結(jié)綿羊紅細(xì)胞，原始百分率。淋巴細(xì)胞連結(jié)綿羊紅細(xì)胞，增加胎盤轉(zhuǎn)錄因子，是激活后增加百分率，激活率高于原始對(duì)照組30％(表1二批樣品結(jié)果)。
生物活性試驗(yàn)—淋巴細(xì)胞e受體的激活法。肝素抗凝的臍帶血液，加淋巴細(xì)胞分離液，吸出淋巴細(xì)胞層，用hank液洗滌2次后，再用hank液配成5×103的淋巴細(xì)胞懸液。取0.1ml淋巴細(xì)胞懸液加0.2mlhptf，混勻置37℃水浴沖30分鐘，使之激活，然后加1％綿羊紅細(xì)胞0.2ml，按e-rfc試驗(yàn)法，觀察計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞得活性t淋巴細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如表2說明hp-tf具有生物活性。
淋巴細(xì)胞e受體激活法(表2)
表2hp-tf(胎盤轉(zhuǎn)錄因子)對(duì)t細(xì)胞e受體的激活率
10)實(shí)驗(yàn)室及開始批量生產(chǎn)，可測游離氨基酸及肽譜分析，游離堿基的分析。hp-tf的氨基酸含量測定：
hp-tf加鹽酸水解后上機(jī)0.4mg蛋白/毫升經(jīng)hitdch835-50氨基酸自動(dòng)分析儀檢測，結(jié)果見(表3)。每單位hp-tf含水解氨基酸總量為2.1946mg較文獻(xiàn)報(bào)道略高。氨基酸含量，檢測進(jìn)樣1毫升含1.0973mg/1ml，送檢樣品含量2毫升。臨床用量一次一個(gè)單位，2毫升＝2.194mg/2ml(0.4mg檢測儀器干燥操作方法)
表3hp-tf水解氨基酸含量
8)本發(fā)明的人胎盤因子、蜂皇胎轉(zhuǎn)錄因子、蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子的多肽含量檢測結(jié)果；
表4
實(shí)施例2
基本同實(shí)施例1一樣，所不同的在于，胎盤轉(zhuǎn)錄因子提取方法步驟2采用的膠體磨勻漿；蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子提取方法中步驟2)采用的是處高速勻漿步驟；
本發(fā)明的人胎盤因子、蜂皇胎轉(zhuǎn)錄因子、蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子的多肽含量檢測結(jié)果；
表5
實(shí)施例3
基本同實(shí)施例1一樣，所不同的在于，蜂皇胎轉(zhuǎn)錄因子和蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子的提取方法步驟3)中的離心溫控為4℃3000轉(zhuǎn)/分，
本發(fā)明的人胎盤因子、蜂皇胎轉(zhuǎn)錄因子、蜂王漿轉(zhuǎn)錄因子的多肽含量檢測結(jié)果；
表6
影響轉(zhuǎn)錄因子含量因素：
a、原材料質(zhì)量：細(xì)胞含量大，濃度高，含水量大濃度低。
b、高速勻漿，凍融，離心，操作過程：保證細(xì)胞破碎好，得率高。凍融時(shí)間，溫度控制要求準(zhǔn)確。
c、操作室溫2-20℃以下，以防止產(chǎn)品生物活性喪失。
d、超濾：濾膜質(zhì)量，保養(yǎng)，清洗，操作，電壓，流速調(diào)節(jié)，流速過快濃度偏低。
實(shí)施例4潤膚霜制備工藝
原料組成：硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、1618醇、甘油、koh、tf蜂皇胎因子、胎盤肽轉(zhuǎn)移因子(核酸、多肽)、王漿精、防腐劑、去離子水、香精、ve、鵝油。
配方：
添加劑按油相加水相乳化后總量的百分比加入:
潤膚霜的制備方法：
1)將水相、油相分別水浴加溫，水相95℃、油相85℃，溶解后留置20分鐘；
2)油相過濾后，攪拌加入水相中，攪拌同一方向混勻，中速乳化；
3)乳化后65℃加入添加劑攪勻成膏；
4)靜置陳化24小時(shí)，分裝。
實(shí)施例5
與實(shí)施例4基本一樣，所不同的是，硬脂酸8％、單硬脂酸甘油酯0.5％、1618醇7％、尼泊金丙脂0.3％、鵝油1％、甘油5％、氫氧化鉀0.1％、氫氧化鈉0.6％、尼泊金甲脂0.1％、余量為去離子水；添加劑按油相加水相乳化后總量的百分比加入ve0.1％、蜂王漿提取液15％、蜂皇胎因子提取液15％、胎盤轉(zhuǎn)移因子提取液15％、王漿精5％、尼泊金乙脂0.1％、香精0.5％。本實(shí)施例中的制備過程中，水相、油相分別水浴加溫時(shí)，水相75℃、油相70℃。
實(shí)施例6
與實(shí)施例4基本一樣，所不同的是，硬脂酸9％、單硬脂酸甘油酯0.8％、1618醇3％、尼泊金丙脂0.1％、鵝油5％、甘油12％、氫氧化鉀0.6％、氫氧化鈉0.1％、尼泊金甲脂0.6％、余量為去離子水；添加劑按油相加水相乳化后總量的百分比加入ve0.1％、蜂王漿提取液10％、蜂皇胎因子提取液10％、胎盤轉(zhuǎn)移因子提取液10％、王漿精5％、尼泊金乙脂0.1％、香精0.5％。本實(shí)施例中的制備過程中，水相、油相分別水浴加溫時(shí)，水相85℃、油相80℃。
實(shí)施例7潤膚霜應(yīng)用安全有效無毒副作用
臨床應(yīng)用：實(shí)施例4～6的潤膚霜經(jīng)臨床5000多人應(yīng)用，每日2-3次，人體皮膚驗(yàn)證，其效果良好。療效觀察治愈及有效率：青春痤瘡75％、日光性皮炎67％、過敏性皮炎87％、蝴蝶斑58％、黃褐斑52％、小皺紋消退62％、老年斑消退50％、粉刺雀斑消退75％、皮膚黑色素消退50％、皮麟粗糙65％。